Summary
Basée sur l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux, leur co-transplantation dans des cerveaux de type sauvage et l'évaluation morphométrique appariée des dérivés « test » et « contrôle », cette méthode permet une modélisation précise du contrôle des gènes in vivo du néocortical morphologie neuronale d'une manière simple et abordable.
Abstract
Le contrôle génique de la cytoarchitecture neuronale fait actuellement l'objet d'une enquête intensive. Décrit ici est une méthode simple développée pour étudier le contrôle in vivo de gène de la morphologie néocortical de neurone de projection. Cette méthode est basée sur (1) l'ingénierie lentivirale in vitro des précurseurs neuronaux comme cellules « d'essai » et de « contrôle », (2) leur co-transplantation dans les cerveaux sauvages-type, et (3) l'évaluation morphométrique paire de leurs dérivés neuronaux. Plus précisément, des précurseurs pallial E12.5 provenant de donneurs panneuronaux, génétiquement étiquetés, sont utilisés à cette fin. Ils sont conçus pour tirer parti de certains promoteurs et de la technologie tetON/OFF, et ils sont transplantés à la main libre dans des ventricules latéraux néonatals. Plus tard, sur le profilage d'immunofluorescence des cerveaux receveurs, des silhouettes des neurones transplantés sont introduites dans le logiciel open source NeurphologyJ, leurs paramètres morphométriques sont extraits, et la longueur moyenne et l'index de ramification sont calculés. Comparé à d'autres méthodes, celle-ci offre trois avantages principaux : elle permet la réalisation d'un contrôle fin de l'expression transgène à des coûts abordables, elle ne nécessite que des compétences chirurgicales de base, et elle fournit des résultats statistiquement fiables sur analyse d'une nombre d'animaux. En raison de sa conception, cependant, il n'est pas suffisant pour aborder le contrôle non cellulaire-autonome de la neuroarchitecture. En outre, il devrait être de préférence employé pour étudier le contrôle de morphologie neurite après l'achèvement de la migration neuronale. Dans sa formulation actuelle, cette méthode est exquisement accordée pour étudier le contrôle génique de l'architecture néocortical de neurone glutamatergic. Profitant des lignées transgéniques exprimant l'EGFP dans d'autres types spécifiques de cellules neurales, il peut être réconçu pour aborder le contrôle génétique de leur architecture.
Introduction
Ici nous décrivons une méthode simple que nous avons développée pour disséquer le contrôle in vivo de gène de cytoarchitecture neuronale. Basé sur l'ingénierie in vitro des précurseurs neuronaux, leur transplantation dans le cerveau néonatal et l'évaluation morphométrique couplée des cellules « d'essai » et de « contrôle », il permet de dévoiler des implications fonctionnelles des gènes de test dans le contrôle fin de la morphologie neuronale dans un moyen rapide et abordable. Pour étudier le contrôle in vivo des gènes de l'architecture neuronale, trois questions techniques clés doivent être abordées : (1) la réalisation d'une expression de gène d'intérêt (GOI) correctement modelée et un contrôle quantitatif précis de celui-ci; (2) obtenir une visualisation correctement segmentée des silhouettes neuronales distinctes; (3) obtenir une signification statistique des résultats tout en employant un nombre limité d'animaux.
Lorsqu'elles sont disponibles, les lignées mutantes de souris abritant des transgènes contrôlés par la tétracycline (tet) peuvent être le meilleur outil pour aborder le premier numéro1. Alternativement, la transgenèse somatique peut être employée. Dans de tels cas, le transgène est délivré par électroporation2 ou transduction virale3. Ensuite, il est conservé comme épisome (par exemple, lors de l'électroporation standard4), ou il est intégré dans le génome (au hasard, via l'intégrase rétrovirale5;ou dans un endroit défini, via CRISPR-promouvoir recombinaison homologue (SLENDR)6 ).
Deuxièmement, la visualisation neuronale de la silhouette peut être réalisée par (a) l'étiquetage uniforme clairsemé ou (b) l'étiquetage différentiel dense. En ce qui concerne l'étiquetage clairsemé, des méthodologies avancées de golgi peuvent être employées7, certains minisets neuronaux peuvent être remplis par la biocytine8, et l'étiquetage sel et poivre peut être obtenu grâce à un transgène peu exprimé. Un tel transgène peut afficher une transcription variée (Thy-EGFP)9 ou peut être activé par recombinaison stochastique (MORF)10. En ce qui concerne (b), les stratégies de pointe comprennent la recombinaison stochastique à médiation C au sein d'un réseau de transgènes de fluoroprotéines multi-floxed (Brainbow)11, ainsi que l'intégration génomique de gènes fluoroprotéines par la transpolation de piggyBac-transposase, précédemment par transgenèse somatique (CLoNE)12.
En ce qui concerne le troisième problème, le résultat morphométrique est souvent affecté par une grande variabilité aléatoire, provenant de différences inter-animaux et les contingences d'injection cellulaire. Pour cette raison, un grand nombre d'animaux est généralement utilisé pour atteindre la puissance statistique nécessaire pour évaluer l'activité morphométrique GOI.
Les approches décrites précédemment reposent souvent sur des compétences techniques avancées et nécessitent des ressources financières remarquables, ce qui peut limiter leur diffusion au sein de la communauté scientifique. Pour contourner ces problèmes, nous avons conçu un pipeline simple et facile pour disséquer le contrôle génétique de la neuroarchitecture in vivo d'une manière rapide et abordable. Ceci est inspiré par une conception similaire de co-transplantation précédemment développée pour l'évaluation in vivo rapide de l'activité de transgène antiblastique13.
Plus précisément, on pense que la co-transplantation de précurseurs neuronaux « verts » in vitro (« cellules de test » et de « contrôle ») dans un cerveau néonatal « noir » peut simultanément corriger les trois questions clés énumérées ci-dessus. En fait, l'ingénierie lentivirale in vitro de précurseurs, dans des conditions bien contrôlées, permet le maintien de la variabilité de l'expression transgène neuronale au minimum, bien en dessous de celle habituellement associée à des manipulations somatiques in vivo (effectuées précédemment 14 (en) , 15 et dans nos résultats inédits). Le contrôle précis de l'expression des gènes qui en résulte est comparable à celui obtenu par des modèles transgéniques contrôlés par les tets. Cependant, les coûts de cette procédure sont bien inférieurs à ceux provenant de l'entretien d'une ligne de souris transgénique. Ensuite, l'injection de cellules à main levée est facile et nécessite une formation minimale. En outre, la quantité de précurseurs étiquetés injectés dans chaque cerveau peut être facilement réglée pour atteindre un nombre cumulatif suffisant de précurseurs peu distribués, tout en maintenant le nombre total d'animaux transplantés à un minimum. Enfin, la co-injection de précurseurs pseudoo-étiquetés différemment, « testés » et « témoins » et l'analyse statistique par paire s'ensuit des résultats contrecarrent les effets de la variabilité expérimentale interanimale, permettant d'atteindre l'importance statistique des résultats, même sur l'analyse d'un nombre limité d'individus13.
Il convient de souligner que, bien que rapide et bon marché, cette méthode a deux principales limites. Tout d'abord, il est conçu pour étudier le contrôle des gènes autonomes cellulaires de l'architecture neuronale, et il n'est pas approprié de s'attaquer au contrôle de l'environnement. Deuxièmement, comme les précurseurs neuronaux transplantés atteignent leur emplacement final par un calendrier hétérochronique, cette méthode est préférable au contrôle neuroarchitectonique modèle se produisant après l'achèvement de migration.
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Protocol
Toutes les méthodes et procédures décrites ici ont été approuvées par le SISSA Organismo preposto al Benessere Animale (SISSA IACUC).
1. Génération de piscines d'ancêtres « vertes » d'ingénierie
- Préparation de la piscine « verte »
- Mate une femelle CD1 de type sauvage avec un fondateur MtaptEGFP / 16. Euthanasier la mère enceinte par luxation cervicale à 12,5 jours après le coitum (le jour 0 est déterminé par inspection vaginale des prises) et récolter les embryons de 12,5 (E12.5) embryons. Les mettre dans des puits individuels d'une plaque de 24 multipuits dans une solution PBS froide.
- Génotype rapide des embryons par inspection visuelle sous une lampe lumineuse bleue, vérifiant l'émission de fluorescence verte dans les cerveaux.
- Placez les embryons « verts » dans un plat Petri de 10 cm de diamètre rempli de froid 1x PBS avec 0,6 % de glucose et transférez-le sous un stéréomicroscope.
- Couper les têtes d'embryon à l'aide de ciseaux standard et en extraire le téencéphale au moyen de #3 et de #5 forceps.
- Séparer les deux vésicules télencéphaliques et disséquer les néocortices à l'aide de forceps; assurez-vous d'enlever l'hippocampe et les ganglions basiques17.
- Recueillir les néocortices en les transférant avec une pipette P1000 dans un tube de 1,5 ml conservé sur la glace.
- Laissez les néocortices disséqués s'installer au fond du tube.
- Aspirez le supernatant autant que possible.
- Resuspendre les néocortices dans 400 'L de milieu proliférant frais [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,6% de glucose, 2 'g/mL heparin, 20 ng/mL facteur de croissance de base de fibroblaste (bFGF), 20 ng/mL epidermal factor de croissance (EGF), 1X pen- et 10 pg/mL d'amphotericine B].
- Doucement pipette les néocortices de haut en bas, séquentiellement avec P1000, P200, et P20 conseils, 4x par pointe, pour obtenir une suspension cellulaire nuageuse.
REMARQUE : Le tissu néocortical E12.5 est très doux ; le dissocier en cellules simples ne nécessite aucune digestion enzymatique; le tuyauterie répété est suffisant. - Laissez les méninges et les amas néocortical résiduels s'installer pendant 2 min.
- Transférer 150 L du haut de la suspension cellulaire (contenant principalement des cellules individuelles) dans un nouveau tube stérile de 1,5 ml.
- Ajouter 150 l de milieu proliférant frais et répéter les étapes 1.1.10-1.1.12 jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'amas tissulaires. Pendant ce temps, omettez l'étape de pipetage P1000 (à l'étape 1.1.10).
REMARQUE : Trois itérations des étapes 1.1.10-1.1.12 sont habituellement suffisantes pour réaliser la dissociation complète de tissu. - Compter les cellules (piscine « verte ») avec la méthode d'exclusion bleu trypan dans une chambre17 et ajouter un milieu prolifrefrais frais pour ajuster la concentration à 103 cellules/L.
REMARQUE : Les étapes 1.1.7-1.1.14 doivent être effectuées sous une hotte stérile à débit laminaire désinfectée par 70 % d'éthanol et maintenue sa ventilation pendant au moins 20 min.
- Ingénierie des sous-piscines « vertes »
- Subdiviser la piscine « verte » en deux sous-piscines en deux tubes distincts de 1,5 ml pour l'infection lentivirale.
- Infecter les sous-piscines indépendamment avec les deux mélanges lentiviraux dédiés. Chaque mélange contient le virus de l'étiquette rouge (Pgk1-mCherry) ou le virus « noir » (pCAG-lacZ) comme un contrôle, ainsi que des virus pour le transgène piloté par tetOFF (Pgk1p-tTA et TRE-transgene) ou le contrôle (Pgk1p-tTA et TRE-PLAP).
CAUTION: Manipulez les lentivirus dans un environnement BLS-2 avec toutes les mesures de protection prescrites par les règles et les lois applicables.
REMARQUE : Chaque lentivirus doit être administré à une multiplicité d'infection (MOI) de 8, ce qui (comme indiqué précédemment14) est suffisant pour transduire la grande majorité des cellules neurales dans de telles conditions expérimentales (figure 1). Les transactivateurs de tet de lentivirus hébergent peuvent être construits en employant différents promoteurs neuronaux conduisant l'expression tTA/rtTA (par exemple, pT1, pSyn, pCaMKII, pGAD1, etc.) (Figure 2). Le MOI est le rapport de (a) le nombre de particules virales infectieuses livrées à (b) le nombre de leurs cellules cibles. Ici, le premier (a) est calculé selon la procédure conventionnelle décrite ailleurs14, la seconde (b) est simplement évaluée à l'aide d'une chambre de Bûrker. - Plaque 600 000 cellules de chaque sous-piscine infectée par puits d'une plaque de 12 puits multiples, dans 600 l de milieu proliférant avec 2 g/mL de doxycycline.
REMARQUE : Ici, les puits ne sont pas prétraités avec la polylysine, qui empêche l'attachement de cellules neurales à leurs fonds. - Transférer les cellules à l'incubateur dans 5 % de CO2 à 37 oC.
- Après 2 jours, pour évaluer l'efficacité de l'infection et le marquage différentiel des piscines modifiées, inspectez les cellules sous un microscope fluorescent conventionnel. Les deux sous-piscines doivent apparaître comme suspensions de petites neurosphères, exprimant de façon homogène la protéine fluorescente rouge (échantillon de « contrôle ») ou non (échantillon de « test »). Dans ces neurosphères, le transgène MtaptEGFP est actif limité à une minorité de cellules (neurones post-mitotiques) et silencieux dans la majorité d'entre eux (précurseurs proliférants) (Figure 3).
2. Mise en place des instruments chirurgicaux et de la zone d'opération
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Préparation des aiguilles borosilicate
- Utilisez les capillaires en verre borosilicate dont le diamètre externe et interne est égal à 1,5 mm et 1,12 mm, respectivement.
- Tirez le capillaire avec un puller P 1000.
- Configurez le programme de traction. Les paramètres typiques du programme sont les : chaleur 614; vel 60; temps de 1; pression de 600 euros. Ils doivent être ajustés en fonction du modèle de traction et de la résistance de chauffage employée.
- Placez le capillaire dans les porte-pulls et serrez-les.
- Démarrer le programme et prendre les deux microcapillaires tirés.
- Couper la pointe capillaire à la main, à l'aide d'un scalpel, sous le stéréomicroscope pour obtenir une pointe d'un diamètre externe de 200 à 250 m.
- Placez les capillaires sur une argile de modélisation (p. ex. la plasticine) dans un plat Petri fermé et transférez-le sous le capot.
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Mise en place du capot et préparation de la solution de traceur cellulaire
- Nettoyez soigneusement le capot à débit horizontal et désinfectez-le à l'aide de 70 % d'éthanol.
- Désinfectez les fibres optiques à l'aide de 70 % d'éthanol et placez-les sous le capot.
- Mélanger 10 l de 125 mM de solution EGTA et 10 'L de Fast Green pour préparer la "solution de traceur cellulaire" et le placer sous le capot.
- Couper de petits morceaux (4 cm x 2 cm de taille) de film d'étanchéité en laboratoire pour le repérage de la suspension cellulaire.
- Préparer une solution de 1 mg/mL de doxycycline stérile et l'aspirer dans une seringue de 0,3 ml.
- Allumez le capot et maintenez le flux laminaire allumé pendant 20 minutes avant l'opération.
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Assemblage du tube d'injection
- Prenez un embout en plastique dur, deux tubes en latex (chacun d'environ 30 cm de long) et un support capillaire d'un kit d'assemblage de tubes aspirateur pour les pipettes microcapillaires calibrées.
- Fixez l'embout buccal en plastique dur à une extrémité d'un tube en latex.
- Fixer le support capillaire à une extrémité d'un autre tube en latex.
- Connectez les extrémités libres des deux tubes de latex avec un filtre stérile de 0,45 m, comme une barrière contre les germes de l'opérateur.
- Placez l'assemblage de tube d'aspirateur résultant sur un support d'argile de modélisation pour être gardé sous le capot.
3. Mélange cellulaire et transplantation intraventriculaire
- Mélange de sous-piscines de cellules vertes « test » et « contrôle »
- Recueillir des neurosphères « d'essai » et de « contrôle » (voir l'étape 1.2.5) dans des tubes séparés de 1,5 ml.
- Suspension des neurosphères centrifugeuses à 200 g pendant 5 min.
- Recueillir et jeter le supernatant, en évitant la perturbation de la pastille cellulaire.
- Resuspendre délicatement les neurosphères dans 500 l de 1x PBS.
- Centrifuger à 200 g pendant 1 min.
- Retirez le supernatant.
- Répétez les étapes 3.1.4-3.1.6 deux fois de plus.
- Resuspendre délicatement les sphères dans 200 oL de solution de trypsine 2x (2x Trypsin, 1x PBS) et de granule de cellules de pipette de haut en bas 4x-5x.
REMARQUE: Faites attention à ne pas faire des bulles d'air. - Laisser les cellules dans l'incubateur pendant 5 min à 37 oC pour obtenir une suspension à une seule cellule.
- Bloquer la trypsine avec 200 l l de solution inhibitrice de trypsine (DMEM-F12, 10 g/mL DNAse I, 0,28 mg/mL trypsin inhibiteur) en faisant monter et descendre 4x-5x.
- Centrifugeuses cellules à 200 x g pendant 5 min et les resuspend dans 1 ml de milieu proliférant frais (DMEM-F12, 1x Glutamax, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0,6% glucose, 2 'g/mL heparin, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x pen-strep, 10 pg/mL amphotericin B).
- Compter les cellules des deux piscines avec la méthode d'exclusion bleu trypan dans une chambre de Bûrker.
- Ajuster leur concentration à 100 000 cellules/L dans le milieu proliférant.
- Mélangez 1:1 cellules "test" avec des cellules "contrôle".
- Vérifier le mélange résultant sous un microscope à fluorescence (grossissement objectif : 10x) pour vous assurer qu'il s'agit d'une suspension à une cellule des deux piscines (figure3C).
- Placer le mélange sur de la glace sous le capot.
- Transplantation intraventriculaire
- Préparer la cage avec la mère et les chiots P0 sur une table loin de la zone de l'opérateur chirurgical.
- Placez une cage de récupération sur un chariot près du capot.
- Placez un mélange de sciure de bois prélevédans e de la cage de la mère au fond de la cage de récupération et placez-la sous une lampe.
- Mis à part, mettre une glacière recouverte d'une feuille d'aluminium pour l'anesthésie des chiots P0.
- Juste avant la transplantation, ajouter 1/10 volume de solution de traceur cellulaire (de l'étape 2.2.3) à 1 volume de suspension cellulaire (à partir de l'étape 3.1.16) et repérer 3 'L du "mélange d'injection" résultant sur un morceau de film d'étanchéité de laboratoire.
- Placer le chiot sur le papier d'aluminium frais pendant 1 min et vérifier qu'il est entièrement anesthésié.
REMARQUE : Pour confirmer l'anesthésie, serrez doucement une patte et surveillez le chiot pour le manque de mouvements, tout en respirant encore. - Pendant ce temps, aspirez les 3 L de mélange d'injection (à partir de l'étape 3.2.5) dans le capillaire en verre.
- Essuyez délicatement la tête du chiot anesthésié avec 70 % d'éthanol.
- Placez le menton du chiot sur la pointe de la fibre optique pour identifier clairement les hémisphères corticaux.
REMARQUE: À P0-P1, la peau de la tête est très mince, permettant une identification visuelle simple des hémisphères juste au-dessus des globes oculaires et derrière les ampoules olfactives. - Gardez le capillaire (chargé tel que décrit à l'étape 3.2.7) dans l'un des deux plans mi-parasagittal (à gauche ou à droite), au-dessus de l'ampoule olfactive, et perforez la peau du front à son intersection avec le plan frontal contenant les centres de globes oculaires. Faites attention à ne pas endommager les vaisseaux sanguins. Entrez dans le capillaire dans le cortex frontal et accédez à la cavité ventriculaire (Figure 4A).
- Pour éviter les dommages accidentels de l'éminence ganglionique, faites pivoter l'aiguille latéralement de 30 degrés, en pointant sa pointe caudale-médiale-ward (Figure 4B).
- Injecter doucement les cellules dans la cavité ventriculaire et surveiller leur diffusion au moyen de Fast Green (Figure 4C).
- Attendez 5-10 s.
- Retirez l'aiguille en verre en prenant soin de ne pas aspirer la suspension de la cellule et jetez-la dans un bac d'élimination approprié.
- Avant la récupération de chiot de l'anesthésie injectent 150 l de solution de doxycycline intrapéritooneally pour maintenir l'expression de transgène toujours hors après la transplantation.
- Après l'injection, placez le chiot immédiatement sous la lampe pour la récupération.
- Laissez les chiots sous la lampe pendant 5-10 min et, une fois complètement éveillés, placez-les dans la cage avec la mère.
- Observez les chiots opérés pendant 2-3 h, pour s'assurer que la mère les accepte.
- Fournir à la cage de l'eau potable contenant de la doxycycline de 0,5 mg/mL et du saccharose de 50 g/L pour maintenir l'expression transgène.
- Remplacer l'eau contenant de la doxycycline par de l'eau sans 4 jours après la transplantation, activant ainsi le transgène dans les neurones post-mitotiques. Gardez les souris dans un régime sans pendant 6 jours et euthanasiez-les à P10 par inhalation de dioxyde de carbone suivie d'une décapitation.
4. Analyse des cerveaux transplantés
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Histologie et immunofluorescence
- Euthanasiez les chiots transplantés 10 jours après la transplantation cellulaire par inhalation de dioxyde de carbone suivie d'une décapitation. Fixer les cerveaux des chiots euthanasiés dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) à 4 oC pendant la nuit.
CAUTION: PFA est très toxique; le manipuler avec soin, en se conformant strictement aux prescriptions du fabricant, sous une hotte chimique de fumée; jeter la solution PFA résiduelle dans un contenant de déchets étiqueté. - Retirez la solution PFA et remplacez-la par une solution de saccharose à 30 %.
- Laissez le cerveau à 4 oC ou jusqu'à ce qu'il coule au fond du flacon.
- Transférer le cerveau dans un moule d'encastrement jetable à peu près à moitié rempli de cryo-inclusion.
- Congeler les cerveaux inclus à -80 oC.
- Couper des sections coronales de 60 m d'épaisseur à l'aide d'un cryostat.
REMARQUE: Évitez d'utiliser des sections plus minces, car cela peut entraîner une perte inacceptable d'informations concernant toute l'architecture des neurones simples. - Sections de processus pour l'immunofluorescence18,19, utilisant des anticorps anti-GFP [1:400] et anti-RFP (mCherry) [1:500]. Noyeul de contre-tache avec la solution DAPI de 1 mg/mL [1:200].
- Euthanasiez les chiots transplantés 10 jours après la transplantation cellulaire par inhalation de dioxyde de carbone suivie d'une décapitation. Fixer les cerveaux des chiots euthanasiés dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) à 4 oC pendant la nuit.
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Morphométrie
- Définiz les paramètres de travail du microscope confocal comme suit : hauteur de la pile z à 40 m; étape de 2 m.
- Recueillir des photos de tranches immunossayed sélectionnant GFP neurone positif riches en champs photographiques, aveugle de la distribution du signal de la DP.
- Exportez les images sous forme de fichiers .nd2.
- Générer des projections Z maximales d'entre eux comme des fichiers .tiff (Figure 5A).
- Pour permettre la squesanguinisation neuronale sous-séquentielle aveugle au génotype des cellules, cachent le signal rouge. Pour ce faire, ouvrez chaque fichier .tiff par un logiciel approprié et ajoutez une couche d'ajustement. Sélectionnez "niveaux", "rouge", puis définir "sortie" à zéro. Enregistrer le fichier en tant que tel.
REMARQUE : La squezation est ensuite effectuée par un nouvel opérateur qui n'avait pas accès auparavant aux fichiers rouges clairs d'origine. - Pour chaque fichier rouge caché, ajoutez une couche de dessin à l'image principale et sélectionnez l'outil crayon (couleur blanche). Tracer le soma sur la base du signal GFP, puis tracer les neurites.
REMARQUE : l'outil crayon peut être réglé à 40 pixels pour le soma et à trois pixels pour les neurites. - Enregistrer le fichier multicouche, y compris les silhouettes neuronales (Figure 5B).
REMARQUE : L'analyse ultérieure du squelette neuronal peut être effectuée par l'un ou l'autre opérateur. - Créez un nouveau fichier 1024 x 1024 16 bits à l'échelle grise avec fond noir, un par neurone.
- Copiez et collez les silhouettes neuronales simples de l'image primaire au nouveau fichier à l'échelle grise. Revenez au fichier multicouches et éteignez la couche d'ajustement pour dévoiler les génotypes neuronaux. Enregistrer le fichier 16 bits à l'échelle grise annoté le génotype neuronal correspondant.
- Importer des images à l'échelle grise dans ImageJ un par un et analyser les squelettes par NeurphologyJ plugin du logiciel ImageJ20 (Figure 5C).
- Copier les données primaires de NeurphologyJ(neurite-longueur, points d'attachement et pointsde terminaison; pour chacun, prendre les valeurs de la « zone totale »), les coller dans une feuille de calcul et les utiliser pour calculer les paramètres morphométriques secondaires ( longueur moyenne des neurites, indice de ramification) ( Figure5D).
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Representative Results
Il existe cinq ensembles de données primaires fournissant des informations utiles sur les aspects clés de la procédure, le premier étant (1) l'efficacité de la transduction des précurseurs neuronaux et la co-transduction par les vecteurs lentiviraux. (2) Exemple des principales caractéristiques des promoteurs employés pour piloter le « gène d'essai ». (3) Exemple de cellules modifiées prêtes à être rectifiées. (4) Un dessin animé comprenant les détails procéduraux principaux de la microinjection cellulaire dans le cerveau néonatal. (5) Un synopsis de l'ensemble du pipeline morphométrique.
Quant (1), la capacité des vecteurs lentiviraux prototypiques livrés à différents MOI (2,4,8) de transduire efficacement les précurseurs néocortical a été évaluée. Dans le premier test, les précurseurs neuronaux provenant des premiers néocortices de type sauvage ont été infectés par un journaliste lentiviral, hébergeant la séquence de codage mCherry (cds) sous le contrôle du promoteur de pT1 neuronogénique-lignée-spécifique, à MOI 2, 4, 8, puis permis de se différencier. La co-immunoprofilation de leurs descendants pour mCherry et le marqueur pan-neuronal Tubb3 a montré que les neurones ont été effectivement transducés à des fréquences de 64%, 69%, et 78%, respectivement (Figure 1A). Dans un deuxième récarquille, les précurseurs néocortical ont été gravement co-infectés par deux reporters lentiviraux, exprimant L'EGFP et le mCherry, sous le contrôle du promoteur constitutif de pPgk1, aux MOIs (2,2), (4,4), et (8,8). Quelques jours plus tard, la co-immunoprofiling de leurs dérivés a montré que le rapport entre les cellules EGFPetMCherry et EGFPétaitde 80 %, 88 % et 93 % respectivement (figure1B). Ces données suggèrent que, sur la livraison du protocole d'ingénierie envisagé pour la présente étude, a) la grande majorité des neurones sont transducés, et (b) presque tous les neurones transducés ont reçu l'ensemble lentiviral complet nécessaire à leur caractérisation.
Figure 1 : Efficacité de la transduction des cellules précurseurs neuronales par vecteurs lentiviraux. Les groupes d'experts font état d'une évaluation de l'efficacité par laquelle les cellules précurseurs néocorticales E12.5 sont transductées (ou co-transductées) lors de l'administration de reporters lentiviraux dédiés à différentes multiplicités d'infection (MOI). Dans le premier cas (A), les cellules ont été gravement infectées par le lentivirus (LV) pT-1-mCherry à MOI 2, 4, 8, cultivées dans le milieu proliférant pendant 2 jours, transférées au milieu différenciant, et autorisées à se différencier pendant 1 semaine. Lors de la fixation au jour in vitro (DIV) 9, les cultures ont été co-immunoprofiled pour mCherry et le marqueur pan-neuronal Tubb3. Les signaux mCherry et EGFP ont été détectés par des anticorps primaires anti-RFP et anti-EGFP et révélés par alexa-594- et Alexa-488-conjugués, respectivement. Enfin, les ratiosmCherryetTubb3 ont été calculés, calculés et tracés par rapport aux MOI correspondants. Dans ce dernier cas (B), les cellules ont été gravement infectées par un mélange 1:1 de deux lentivirus, codant pour les transgènes pPgk-mCherry et pPgk-EGFP, à différents MOI (2, 4, 8 pour chaque virus). Les cellules ont été cultivées dans le milieu proliférant pendant 4 jours, trypsinized et, sur la fixation, profilé pour l'immunofluorescence de mCherry et d'EGFP comme ci-dessus. Enfin, les ratiosmCherryet EGFP ont été calculés, calculés, moyens et tracés par rapport aux MOI correspondants. Les barres d'erreur représentent S.E.M. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
En ce qui concerne (2), les modèles d'activité pT-1 et pSyn peuvent être déduits sur la base des profils d'expression des gènes de fluoroprotéine sous leur contrôle. Dans cet exemple, ce contrôle est direct dans le cas de mCherry (Figure 2A), et indirect [c'est-à-dire médiatisé par une interface de deuxième génération tetON (Figure 2E)], dans le cas de l'EGFP (Figure 2B, C,D). Les deux promoteurs sont spécifiquement actifs au sein de Tubb3- neurones postmitotiques (Figure 2B, C,D), mais pT1 également les incendies dans un sous-ensemble de Ki67- intermitotic (neuronogenic) précurseurs (Figure 2A). Ici, pour donner une idée de la variabilité limitée de l'activité du promoteur lorsque les cellules sont conçues en fonction de ces conditions standard (Figure 2E), les niveaux d'expression EGFP pilotés par pT1 et pSyn dans les neurones Tubb3ont été quantifiés par Plugin Photoshop CS6 Histogram. Ensuite, les données brutes ont été normalisées par rapport aux médianes et tracées contre les promoteurs (figure 2F). Remarquablement, les niveaux de fluorescence unicellulaire ont été densément regroupés autour des médianes : premier et troisième quartiles ont égalé 0,86 et 1,16, ainsi que 0,89 et 1,12 dans les cas de pT1 et de pSyn, respectivement.
Figure 2 : Profilage des promoteurs de type précurseur neuronal adaptés à la surexpression de GOI. Les panneaux se réfèrent à la caractérisation des promoteurs de Tubulin alpha 1 (pT-1) et de Synapsin (pSyn), spécifiquement actifs dans toute la lignée neuronale et les neurones postmitotiques, respectivement. L'essai a été exécuté dans les précurseursnéocortical moissonnés à différents âges embryonnaires (E n), gravement infectés par des mélanges lentiviraux dédiés [pT-1-mCherry in (A); pT-rtTA, TREt-EGFP dans (B); pSyn-rtTA, TREt-EGFP dans (C,D); 2 /ml doxy ab initio], et cultivé dans le milieu proliférant (A), prolimique (2 jours) suivi par le milieu différenciant (B,C), ou le milieu différenciant (D). Lors de la fixation au jour in vitro (DIV) n, les neurones postmitotic ont été identifiés par les précurseurs de 'Tubb3 et intermitotic par l'immunofluorescence de Ki67 ; mCherry et L'EGFP ont été détectés comme indiqué à la figure 1. Les signaux ont été révélés comme indiqué à la figure 1. Barres d'échelle : 100 m (A,B) et 50 m (C,D). Sont montrés (E) des mélanges lentiviraux dédiés utilisés dans cette étude avec des références aux panneaux de figure. Montré est un (F) une parcelle de dispersion de pT -1- et pSyn-conduit signal EGFP dans Tubb3- cellules mentionnées dans (B) et (D), respectivement. Les cellules en boîte sont des cellules qui tombent entre 25e et 75e percentiles ; les moustaches se réfèrent aux 10e et 90e percentiles. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
En ce qui concerne (3), 3 jours après la transduction lentivirale, les neurosphères « vertes » de MtaptEGFP/MD expriment la protéine fluorescente rouge (sphères de contrôle) (figure3A, B). Toutes les sphères sont dissociées en cellules simples, ce qui assure qu'il n'y a pas de restes d'amas, et les suspensions correspondantes sont mélangées 1:1. Le mélange qui en résulte (figure 3C) est placé sur la glace et utilisé dans les 20 minutes pour la transplantation.
Figure 3 : Exemple de test (« seulement vert ») et de contrôle (« vert-rouge ») neurosphères DIV2 et suspension cellulaire prêt pour la transplantation. (A,B) Ces sphères ont été obtenues à partir de mtaptEGFP/E 12.5 précurseurs néocortical, gravement infectés par des mélanges lentiviraux "pCAG-lacZ, Pgk1p-tTA, TREt-GOI" (A) et "Pgk1p-mCherry, Pgk1p-tTA, TREt-PLAP" (B), respectivement, 8, et maintenu dans le milieu proliférant. (C) La suspension cellulaire a été obtenue en dissociant les neurosphères « test » et « contrôle » (A,B) aux cellules individuelles et en les mélangeant 1:1. Barres d'échelle : 200 m (A,B) et 100 m (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Quant à (4), la procédure d'injection cellulaire dans le cerveau néonatal comprend trois étapes clés. Le capillaire, placé sur le plan mi-parasagittal, est entré dans la cavité ventriculaire latérale par la paroi corticale frontale (Figure 4A). Ensuite, pour éviter les dommages de l'éminence ganglionique, le capillaire est tourné à 30 degrés dans le plan horizontal, de sorte que la pointe pointe médially /caudally (Figure 4B). Enfin, la suspension cellulaire est délicatement éjectée dans la cavité ventriculaire latérale, où elle forme un « nuage » bleu clair facilement reconnaissable (figure4C).
Figure 4 : Schématiques de la procédure en trois étapes utilisée pour l'injection cellulaire dans le cerveau néonatal. (A) Le capillaire est entré dans le ventricule latéral par la paroi néocortical frontale. Ensuite, (B) il est tourné médialward, pour éviter les dommages de l'éminence ganglionique. Enfin (C), la suspension cellulaire est doucement injectée dans le ventricule latéral, où elle forme un nuage bleu clair. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Quant à (5), la procédure analytique comprend quatre étapes principales. Tout d'abord, les sections optiques confocales des champs transplantés riches en neurones sont aplaties, selon la modalité MAX Z-projection générant ainsi des fichiers RGB .tiff. Ici, à titre d'exemple, seuls les neurones « à essai vert » et les neurones « témoins jaunes », provenant de précurseurs co-transplantés, peuvent être facilement distingués (il convient de noter que mCherry peut alternativement être utilisé pour étiqueter les neurones « test ») (Figure 5A). Ensuite, une version lucida de l'image idéalisée et squelettée est générée par un logiciel graphique approprié (voir l'étape 4.2.6) (Figure 5B) par un opérateur aveugle du canal rouge. La cécité du canal rouge est d'une importance primordiale afin d'éviter tout biais involontaire dans l'évaluation des données. Ensuite, les silhouettes mononeuronales sont introduites dans le logiciel NeurphologyJ sous forme d'images et devaleurs en noir et blanc des trois paramètres primaires « nombre total de points de sortie » (points d'attache), « nombre total de points de terminaison » (points de terminaison) et « total neurite" (neurite-longueur) sont collectés (figure 5C). Enfin, les paramètres secondaires de chaque neurone sont calculés, moyens et évalués statistiquement par le logiciel Excel (Figure 5D).
Figure 5 : Graphique représentatif de l'analyse morphométrique des cerveaux transplantés. Les panneaux de la rangée supérieure montrent : (A) une image MAX z-projection .tiff du néocortex médial, fixée 10 jours après la transplantation de cellules machinées (vert - Mtapt-conduit, EGFP neuronale-restreint; rouge - mCherry, étiquette constitutive "contrôle" cellules; bleu DAPI), le signal de canal vert, et (B) son e-caméra squelette lucida rendu. Barres d'échelle : 50 m. La rangée inférieure comprend : (C) paramètres morphométriques primaires extraits de squelettes neuronaux par l'analyse logicielle NeurphologyJ (neurite-longueur comme 'li' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' paramètres secondairescalculés surleur base. Ce chiffre a été modifié à partir de Chiola et coll.21. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les aspects/étapes spécifiques de cette procédure sont essentiels et nécessitent une attention particulière. Premièrement, a) les opérateurs doivent être suffisamment préformés pour manipuler en toute sécurité les lentivirus dans un environnement de laboratoire conforme au BSL-2. Deuxièmement, b) avant de mélanger les préparations neuronales « test » et « contrôle », il est obligatoire de laver soigneusement les deux suspensions de neurosphère correspondantes telles que décrites, afin d'éviter toute infection croisée retardée des deux préparations due à des lentilles indésirables reportent. Troisièmement, c) lors de la transplantation des cellules, les soins doivent être placés tout en ciblant la cavité ventriculaire; à cet égard, le traceur Fast Green inclus dans la suspension cellulaire est d'une aide substantielle. En outre, d) pour prévenir le cannibalisme, les chiots transplantés ne doivent être transférés à la mère qu'après leur rétablissement complet de l'anesthésie (habituellement 10 min est suffisant). e) La cryosection du tissu transplanté doit être effectuée à 60 m; en fait, cette épaisseur permet simultanément une pénétration facile d'anticorps dans le tissu et limite la perte d'information provenant de la fragmentation artificielle de neurone. Enfin, f) pour éviter tout biais involontaire dans l'évaluation des données, nous soulignons que la skeletonisation des neurones doit être effectuée par un opérateur aveugle du canal rouge.
Le protocole décrit ici fait référence aux manipulations de gènes GOF. Alternativement, les neurones « d'essai » peuvent être conçus pour downregulate goI fonction par le biais des lentivirus codantpour les effecteurs d'ARNi. Ensuite, nous employons habituellement mCherry pour étiqueter les cellules neurales « témoins » ; toutefois, le système mCherry/"control" et LacZ/"test" peut évidemment être inversé. Enfin, le protocole décrit ici se réfère aux injections intraventriculaires de cellules ; les neurones « test » et « contrôle » peuvent être co-injectés alternativement dans le parenchima neuronal21.
Malgré ses avantages, cette méthode a deux limites principales. Tout en permettant d'étudier la cellule-le contrôle génétique autonome de la neuroarchitecture, il ne s'applique pas au contrôle environnemental de celui-ci. De plus, comme les précurseurs neuronaux transplantés migrent de l'aspect ventriculaire de la paroi corticale à leur emplacement laminaire final après la naissance (c.-à-d. dans un délai non physiologique), cette méthode devrait être utilisée de préférence pour modéliser contrôle neuroarchitectonique après l'achèvement de la migration.
Enfin, une attention particulière devrait être accordée à l'interprétation critique des résultats. En particulier, si le sujet de l'étude du gène X réduit la complexité morphologique des neurones « testés », cela pourrait ne pas refléter spécifiquement son impact véritable sur l'architecture neuronale. Au contraire, un tel phénomène pourrait être un indice non spécifique des dommages neuronaux provoqués par la surexpression de X. Pour résoudre ce problème, il peut être utile de comparer les densités locales de neurones transplantés, « testés » et « témoins », puis de rechercher un rétrécissement numérique possible de la population « test », comme un indice de la souffrance neuronale induit par X [ce rétrécissement devrait être encore plus prononcé sur une analyse plus tardive des cerveaux transplantés]. Dans de tels cas, l'abaissement du niveau de surpression du gène X ou le passage à une conception de perte de fonction peut résoudre le problème.
Notre méthode s'ajoute à un large éventail de technologies utilisées pour étudier le contrôle génétique de la morphologie neuronale in vivo1,2,3,4,7,8, 9 (en) , 10 Ans et plus , 11 Ans, états-unis ( , 12. Comme nous l'avons rappelé dans l'introduction, ces technologies reposent sur une variété de manipulations génétiques ponctuelles visant à perturber les niveaux d'expression du GOI et à faciliter l'extraction de l'information morphologique à partir des échantillons biologiques. Ces technologies permettent habituellement une dissection précise de ce contrôle; cependant, ils ne nécessitent pas de compétences expérimentales et de ressources financières précieuses. À cet égard, la méthode offre trois avantages clés. Il permet un contrôle précis des niveaux d'expression DE GOI comparables à ceux propres aux modèles transgéniques ; cependant, en l'absence de coûts d'entretien des colonies mutantes. Il ne nécessite pas de compétences expérimentales (chirurgicales) sophistiquées. Il atteint souvent l'importance statistique des résultats sur l'analyse d'un nombre relativement limité d'animaux.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Mihn Duc Do pour sa contribution à la mise en place précoce de cette procédure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mL syringe | BD | 320840 | store at RT |
| 0.45 μm sterile filter | Millex-HV | SLHU033RS | store at RT |
| 12 multiwell plate | Falcon | 353043 | store at RT |
| 1X PBS | Gibco | 14190-094 | store at RT |
| 24 multiwell plate | Falcon | 351147 | store at RT |
| anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 | Tebubio | GTX13970 | store at -20 °C |
| anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 | Antibodies Online | ABIN334653 | store at -20 °C |
| anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 | Covance | MMS-435P | store at -20 °C |
| Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | store at RT |
| Blue light lamp | Nightsea | BLS2 | store at RT |
| Borosilicate capillaries | Kwik-Fil | TW150-4 | store at RT |
| BSA | Sigma | A9647 | store at -20 °C |
| Bürker chamber | Sigma | BR719520 | 0.0025 mm2, 0.100 mm |
| Cryo-inclusion medium (Killik) | Bio-Optica | 05-9801 | store at RT |
| DAPI | Sigma | D9542 | store at -20 °C |
| Disposable embedding mold | Bio-Optica | 07MP7070 | store at RT |
| DMEM/F-12 | Gibco | 31331-028 | store at +4 °C |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | store at -20 °C |
| Doxycicline | Sigma | D1822 | store at -20 °C |
| Dumont forceps #3c | Fine Science Tools | 11231-20 | store at RT |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | store at RT |
| EGF | Gibco | PHG0311 | store at -20 °C |
| EGTA | Sigma | E3889 | store at RT |
| FGF | Gibco | PHG0261 | store at -20 °C |
| Fine scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14060-09 | store at RT |
| Fungizone (Amphotericin B) | Gibco | 15290018 | store at -20 °C |
| Glucose | Sigma | G8270 | store at RT |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | store at RT |
| Goat anti-chicken Alexa 488 | Invitrogen | A11039 | store at -20 °C |
| Goat anti-rat Alexa 594 | Invitrogen | A11007 | store at -20 °C |
| Heparin Solution | Stem Cell Technologies | 07980 | store at -20 °C |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | store at -20 °C |
| Optical fibers | Leica | CLS150X | |
| P1000 puller | Sutter Instruments | P-1000 model | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | store at RT |
| Pen Strep | Sigma | P0781 | store at -20 °C |
| Petri dish | Falcon | 353003 | store at RT |
| PFA | Sigma | 158127 | store at RT |
| Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #484 [LV_lacZ] | Addgene | 12108 | store at -20 °C |
| Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] | built in house | store at -20 °C | |
| Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] | built in house | store at -20 °C | |
| Scalpel | Braun | BB515 | store at RT |
| Steromicroscope | Leica | MZ6 | store at RT |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | store at RT |
| Trypsin | Gibco | 15400-054 | store at -20 °C |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T6522 | store at -20 °C |
References
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