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Genetics

विवो न्यूरोआर्किटेक्चर स्टडीज के लिए इंजीनियर न्यूरोनल प्रवर्तकों का इंट्रावेंट्रिकल ट्रांसप्लांटेशन

Published: May 11, 2019 doi: 10.3791/59242
Automatic Translation
1, 1, 1
1Laboratory of Cerebral Cortex Development, SISSA

Summary

न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो लेन्टिवायरल इंजीनियरिंग के आधार पर, जंगली-प्रकार के दिमाग में उनके सह-ट्रांसप्लांटेशन और "परीक्षण" और "नियंत्रण" डेरिवेटिव के युग्मित मॉर्फोमीट्रिक मूल्यांकन, इस विधि से नियोकोर्टिकल के विवो जीन नियंत्रण में सटीक मॉडलिंग की अनुमति देता है एक सरल और सस्ती तरीके से न्यूरॉन आकारिकी.

Abstract

न्यूरोनल साइटोआर्किटेक्चर का जीन नियंत्रण वर्तमान में गहन जांच का विषय है। यहाँ वर्णित एक सरल विधि neocortical प्रक्षेपण न्यूरॉन आकृति विज्ञान के vivo जीन नियंत्रण में अध्ययन करने के लिए विकसित की है. इस विधि पर आधारित है (1) "परीक्षण" और "नियंत्रण" कोशिकाओं के रूप में न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो leniviral इंजीनियरिंग में, (2) जंगली प्रकार के दिमाग में उनके सह प्रत्यारोपण, और (3) उनके न्यूरॉन डेरिवेटिव के युग्मित morphometric मूल्यांकन. विशेष रूप से, E12.5 panneuronal से pallial अग्रदूतों, आनुवंशिक रूप से लेबल दाताओं, इस उद्देश्य के लिए कार्यरत हैं. वे चयनित प्रमोटरों और tetON / ऑफ प्रौद्योगिकी का लाभ लेने के लिए इंजीनियर हैं, और वे नि: शुल्क हाथ नवजात पार्श्व निलय में प्रत्यारोपित कर रहे हैं. बाद में, प्राप्तकर्ता दिमाग की इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोफाइलिंग पर, प्रतिरोपित न्यूरॉन्स के silhouettes NeurphologyJ खुला स्रोत सॉफ्टवेयर में खिलाया जाता है, उनके morphometric मापदंडों निकाले जाते हैं, और औसत लंबाई और शाखा सूचकांक की गणना कर रहे हैं. अन्य तरीकों की तुलना में, यह एक तीन मुख्य लाभ प्रदान करता है: यह सस्ती कीमत पर transgene अभिव्यक्ति के ठीक नियंत्रण के प्राप्त करने की अनुमति देता है, यह केवल बुनियादी शल्य कौशल की आवश्यकता है, और यह एक सीमित के विश्लेषण पर सांख्यिकीय विश्वसनीय परिणाम प्रदान करता है जानवरों की संख्या. इसके डिजाइन के कारण, हालांकि, यह neuroarchitecture के गैर सेल स्वायत्त नियंत्रण को संबोधित करने के लिए पर्याप्त नहीं है. इसके अलावा, यह अधिमानतः न्यूरोनल प्रवास के पूरा होने के बाद neurite आकृति विज्ञान नियंत्रण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. अपने वर्तमान निर्माण में, इस विधि अति सुंदर glutamatergic neocortical न्यूरॉन वास्तुकला के जीन नियंत्रण की जांच करने के लिए tuned है. ट्रांसजेनिक अन्य विशिष्ट तंत्रिका कोशिका प्रकार में EGFP व्यक्त लाइनों का लाभ उठाते हुए, यह उनकी वास्तुकला के जीन नियंत्रण को संबोधित करने के लिए फिर से उद्देश्य किया जा सकता है.

Introduction

यहाँ हम एक सरल विधि हम न्यूरॉन cytoarchiketoke के vivo जीन नियंत्रण में विच्छेदन के लिए विकसित का वर्णन. न्यूरोनल अग्रदूतों के इन विट्रो इंजीनियरिंग के आधार पर, नवजात मस्तिष्क में उनके प्रत्यारोपण और "परीक्षण" और "नियंत्रण" कोशिकाओं के युग्मित morphometric मूल्यांकन, यह एक में न्यूरॉन आकृति विज्ञान के ठीक नियंत्रण में परीक्षण जीन के कार्यात्मक प्रभाव अनावरण करने के लिए अनुमति देता है तेजी से और सस्ती तरीका है. न्यूरोनल वास्तुकला के विवो जीन नियंत्रण में जांच करने के लिए, तीन प्रमुख तकनीकी मुद्दों को संबोधित किया जाना चाहिए: (1) एक पर्याप्त रूप से पैटर्न जीन के ब्याज (भारत आई ओ आई) अभिव्यक्ति और इसका एक सटीक मात्रात्मक नियंत्रण प्राप्त करना; (2) अलग न्यूरॉन silhouettes की एक ठीक से खंडित दृश्य प्राप्त करने; (3) परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को प्राप्त करते हुए पशुओं की एक सीमित संख्या में रोजगार.

उपलब्ध होने पर, टेट्रासाइक्लिन (टीईटी) नियंत्रित transgenes शरण माउस उत्परिवर्ती लाइनों पहले मुद्दे1को संबोधित करने के लिए सबसे अच्छा उपकरण हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, दैहिक transgenesis नियोजित किया जा सकता है. ऐसे मामलों में, ट्रांसजीन इलेक्ट्रोपोरेशन2 या वायरल ट्रांसडक्शन3के माध्यम से वितरित किया जाता है। इसके बाद, इसे एक महामारी के रूप में बनाए रखा जाता है (जैसे, मानक इलेक्ट्रोपोट्रेशन4पर), या यह जीनोम में एकीकृत होता है (यादृच्छिक रूप से, रेट्रोवायरल इंटीग्रेस5के माध्यम से ; या एक परिभाषित स्थान में, CRISPR-प्रमोट किए गए समजात पुनर्संयोजन (SLENDR)6 के माध्यम से ).

दूसरा, न्यूरॉन सिल्हूट दृश्य के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है (क) विरल वर्दी लेबलिंग या (ख) घने अंतर लेबलिंग. विरल लेबलिंग के लिए, उन्नत Golgi की तरह तरीकों कार्यरत किया जा सकताहै7, चयनित न्यूरोनल minisets biocytin द्वारा भरा जा सकताहै 8, और नमक और मिर्च लेबलिंग एक विरल व्यक्त transgene के लिए धन्यवाद प्राप्त किया जा सकता है. इस तरह के एक transgene विभिन्न लिप्यंजन प्रदर्शित कर सकते हैं (Thy-EGFP)9 या stochastic पुनर्संयोजन द्वारा सक्रिय किया जा सकता है (MORF)10. के लिए के रूप में (ख), कला रणनीतियों के राज्य एक बहु-फ्लैक्स्ड फ्लोरोप्रोटीन ट्रांसजीन सरणी (Brainbow)11के भीतर क्रे-मध्यस्थ stochastic पुनर्संयोजन शामिल हैं, साथ ही साथ piggyBac-transposase संचालित फ्लोरोप्रोटीन जीन के जीनोमिक एकीकरण, पहले दैहिक ट्रांसजेनेसिस (CLoNE)12के माध्यम से दिया |

तीसरे मुद्दे के लिए के रूप में, morphometric परिणाम अक्सर एक बड़े यादृच्छिक परिवर्तनशीलता से प्रभावित है, अंतर पशु मतभेद और सेल इंजेक्शन आकस्मिकताओं से शुरू होता है. इस वजह से, जानवरों की एक बड़ी संख्या आमतौर पर भारत सरकार morphometric गतिविधि का आकलन करने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय शक्ति को प्राप्त करने के लिए कार्यरत है।

पहले वर्णित दृष्टिकोण अक्सर उन्नत तकनीकी कौशल पर भरोसा करते हैं और विशिष्ट वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता होती है, जो वैज्ञानिक समुदाय के भीतर उनके प्रसार को सीमित कर सकते हैं। इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हमने विवो में न्यूरोआर्किटेक्चर के जीन नियंत्रण को एक तेज और किफायती तरीके से विभाजित करने के लिए एक आसान और सरल पाइपलाइन की कल्पना की। यह एंटीब्लास्टिक ट्रांसजीन गतिविधि13के विवो मूल्यांकन में तेजी से विकसित एक समान सह-ट्रांसप्लांटेशन डिजाइन से प्रेरित है।

विशेष रूप से, यह सोचा है कि इन विट्रो इंजीनियर के सह-प्रतिरोपण "हरी" तंत्रिका अग्रदूतों ("परीक्षण" और "नियंत्रण" कोशिकाओं) एक "काला" प्राप्तकर्ता नवजात मस्तिष्क में एक साथ तीन प्रमुख मुद्दों के ऊपर सूचीबद्ध ठीक कर सकते हैं. वास्तव में, अग्रदूतों के इन विट्रो lentiviral इंजीनियरिंग में, अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में, एक न्यूनतम पर न्यूरॉन ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता के रखरखाव की अनुमति देता है, अभी तक नीचे है कि आम तौर पर विवो दैहिक जोड़तोड़ में के साथ जुड़े (पहले प्रदर्शन किया 14 , 15 और हमारे अप्रकाशित परिणामों में). जीन अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप सटीक नियंत्रण है कि tet नियंत्रित transgenic मॉडल द्वारा प्राप्त के साथ तुलनीय है. हालांकि, इस प्रक्रिया की लागत अभी तक एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन के रखरखाव से शुरू होने वालों से नीचे हैं. अगले, मुक्त हाथ सेल इंजेक्शन आसान है और कम से कम प्रशिक्षण की आवश्यकता है. इसके अलावा, प्रत्येक मस्तिष्क में इंजेक्शन लेबल अग्रदूतों की राशि आसानी से कम से कम वितरित अग्रदूतों की एक पर्याप्त संचयी संख्या को प्राप्त करने के लिए tuned किया जा सकता है, जबकि भी एक न्यूनतम पर प्रतिरोपित जानवरों की कुल संख्या रखते हुए. पिछले नहीं बल्कि कम से कम, सह अलग fluoro लेबल के इंजेक्शन, "परीक्षण" और "नियंत्रण" अग्रदूतों और बाद में pairwise परिणामों के सांख्यिकीय विश्लेषण अंतर पशु प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता के प्रभाव प्रतिक्रिया, तक पहुँचने की अनुमति परिणामों का सांख्यिकीय महत्व, यहां तक कि सीमित संख्या में व्यक्तियों के विश्लेषण पर13.

यह जोर दिया जाना चाहिए कि, हालांकि तेजी से और सस्ते, इस विधि दो मुख्य सीमाएं हैं. सबसे पहले, यह कोशिका-स्वायत्त जीन नियंत्रण न्यूरॉन वास्तुकला की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, और यह पर्यावरण नियंत्रण को संबोधित करने के लिए उपयुक्त नहीं है. दूसरा, के रूप में प्रत्यारोपित न्यूरोनल अग्रदूतों एक विषमक्रोनिकन अनुसूची द्वारा अपने अंतिम स्थान तक पहुँचने, इस विधि मॉडल neuroarchitectonics नियंत्रण पिछले प्रवास पूरा होने वाली करने के लिए बेहतर है.

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Protocol

सभी तरीकों और प्रक्रियाओं यहाँ वर्णित SISSA जीवो preposto अल Benessere Animale (SISSA IACU) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1. इंजीनियर "हरी" जनक पूल की पीढ़ी

  1. "हरी" पूल की तैयारी
    1. मेट एक जंगली प्रकार CD1 महिला के साथएक MtaptEGFP / गर्भवती बांध को 12.5 दिनों के बाद कोइटम (दिन 0 योनि प्लग निरीक्षण द्वारा निर्धारित किया जाता है) पर गर्भाशय ग्रीवा की अव्यवस्था द्वारा यूथेनाइज करें और भ्रूण ीय दिन 12.5 (E12.5) भ्रूण ों की कटाई करें। उन्हें ठंडे पीबीएस समाधान में 24 मल्टीवेल प्लेट के अलग-अलग कुओं में सेट करें।
    2. जल्दी से एक नीले प्रकाश दीपक के तहत दृश्य निरीक्षण द्वारा भ्रूण genotype, दिमाग में हरी फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के लिए जाँच.
    3. 0.6% ग्लूकोज के साथ ठंड 1x पीबीएस से भरा एक 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में "हरी" भ्रूण प्लेस और यह एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत करने के लिए हस्तांतरण।
    4. मानक कैंची का उपयोग कर भ्रूण सिर कट और #3 और #5 संदंश के माध्यम से उन से telencephalon निकालने.
    5. दो टेलेन्सेफैलिक vesicles को अलग करें और संदंश का उपयोग करके नियोकोर्टिस को अलग करें; हिप्पोकैम्पस और बेसल गैंग्लिया17को हटाने के लिए सुनिश्चित करें .
    6. बर्फ पर रखा एक 1.5 एमएल ट्यूब में एक P1000 पिपेट के साथ स्थानांतरित करके उन्हें neocortices लीजिए.
    7. विच्छेदन नियोकोर्टिस को नली के तल पर बसने दें।
    8. जितना संभव हो उतना सुपरनेटेंट को प्रेरित करें।
    9. ताजा proliferative माध्यम के 400 $L में neocortices resuspend [DMEM-F12, 1x Glutamax, 1X N2, 1 mg/mL गोवाइन सीरम एल्बुमिन (BSA), 0.6% ग्लूकोज, 2g /mL heparin, 20 ng/mL बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF), 20/ और 10 pg/mL एम्फोटेरिकिन बीजेड.
    10. धीरे pipette neocortices ऊपर और नीचे, P1000, P200, और P20 युक्तियाँ, टिप प्रति 4x के साथ क्रमिक रूप से, एक बादल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए.
      नोट: E12.5 neocortical ऊतक बहुत नरम है; इसे एकल कोशिकाओं से अलग करने के लिए एंजाइमी पाचन की आवश्यकता नहीं होती है; दोहराया पाइपिंग पर्याप्त है.
    11. meninges और अवशिष्ट neocortical clumps 2 मिनट के लिए बैठ जाओ.
    12. सेल निलंबन के शीर्ष से 150 डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण (मुख्य रूप से एकल कोशिकाओं युक्त) एक नया 1.5 एमएल बाँझ ट्यूब में.
    13. ताजा proliferative मध्यम के 150 $L जोड़ें और चरणों को दोहराएँ 1.1.1.1.12 जब तक कोई और अधिक ऊतक clumps स्पष्ट कर रहे हैं. ऐसा करते समय, P1000 पाइपिंग चरण (चरण 1.1.10 में) छोड़ दें।
      नोट: चरणों के तीन पुनरावृत्ति 1.1.10-1.12 आमतौर पर पूर्ण ऊतक वियोजन प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं.
    14. गणना कोशिकाओं ("हरी" पूल) एक B$rker कक्ष में trypan नीले बहिष्करण विधि के साथ17 और ताजा proliferative माध्यम जोड़ने के लिए एकाग्रता को समायोजित करने के लिए 103 कोशिकाओं /
      नोट: चरण 1.1.7-1.1.14 एक बाँझ laminar प्रवाह हुड 70% इथेनॉल द्वारा कीटाणुरहित के तहत प्रदर्शन किया जाना चाहिए और कम से कम 20 मिनट के लिए हवादार रखा.
  2. "हरा" उप-पूल इंजीनियरिंग
    1. lentiviral संक्रमण के लिए दो अलग 1.5 एमएल ट्यूबों में दो उप-पूल में "हरी" पूल उपविभाजित।
    2. दो समर्पित lentiviral घोला जा सकता है के साथ स्वतंत्र रूप से उप-पूल संक्रमित करें। प्रत्येक मिश्रण में "लाल लेबल" वायरस (Pgk1]mCherry) या "काला" वायरस (pCAG[lac]) एक नियंत्रण के रूप में, साथ ही tetOFF संचालित ट्रांसजीन के लिए वायरस (Pgk1p]tTA और TRE$transgene) या नियंत्रण (Pgk1p]tTA और TRE$PLAP) अभिव्यक्ति शामिल हैं।
      चेतावनी: लागू नियमों और कानूनों द्वारा निर्धारित सभी सुरक्षात्मक माप के साथ एक BLS-2 वातावरण में lentiviruses हेरफेर.
      नोट: प्रत्येक lentivirus संक्रमण की बहुलता पर प्रशासित किया जाना चाहिए (MOI) 8, जो (जैसा कि पहले दिखाया14) ऐसी प्रयोगात्मक स्थितियों में तंत्रिका कोशिकाओं के विशाल बहुमत transduce करने के लिए पर्याप्त है (चित्र 1). टीईटी ट्रांसएक्टिवेटरों को आश्रय देने वाले lentivirus को विभिन्न न्यूरोनल प्रमोटरों को टीटीए/आरटीए अभिव्यक्ति (उदा., पीटीजेड1, पी.सी.एन., pCaMKII, pGAD1, आदि) को रोजगार देकर बनाया जा सकता है। (चित्र2) . MOI का अनुपात है (क) संक्रामक वायरल कणों की संख्या (ख) उनके लक्षित कोशिकाओं की संख्या को दिया. यहाँ, पूर्व (क) कहीं और वर्णित पारंपरिक प्रक्रिया के अनुसार गणना की है14,बाद (ख) बस एक B$rker कक्ष का उपयोग कर मूल्यांकन किया है.
    3. प्लेट 600,000 कोशिकाओं प्रत्येक संक्रमित उप पूल के एक 12 multiwell प्लेट के अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से, proliferative माध्यम के 600 डिग्री एल में doxycycline के 2 g/
      नोट: यहाँ, कुओं पाली-lysine, जो उनके नीचे करने के लिए तंत्रिका कोशिका लगाव रोकता है के साथ pretreated नहीं कर रहे हैं.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 में इनक्यूबेटर के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
    5. 2 दिनों के बाद, संक्रमण की दक्षता और इंजीनियर पूल के अंतर अंकन का आकलन करने के लिए, एक पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण। दो उप-पूल छोटे neurospheres के निलंबन के रूप में प्रकट होना चाहिए, समरूप लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त ("नियंत्रण" नमूना) या नहीं ("परीक्षण" नमूना). इन neurospheres के भीतर, MtaptEGFP transgene सक्रिय कोशिकाओं के एक अल्पसंख्यक तक ही सीमित है (पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स) और उनमें से बहुमत में चुप (प्रजनन अग्रदूतों) (चित्र 3).

2. शल्य चिकित्सा उपकरणों और ऑपरेटिंग क्षेत्र की स्थापना

  1. बोरोसिलिकेट सुइयों की तैयारी
    1. क्रमशः 1.5 मिमी और 1.12 मिमी के बराबर बाहरी और आंतरिक व्यास के साथ बोरोसिलिकेट ग्लास केशिकाओं का उपयोग करें।
    2. एक पी 1000 खींचने के साथ केशिका खींचो.
    3. पुलिंग प्रोग्राम सेट करें. ठेठ कार्यक्रम पैरामीटर हैं: गर्मी $ 614; वेल $ 60; समय $ 1; दबाव $ 600. वे खींचने मॉडल और हीटिंग रोकनेवाला कार्यरत के अनुसार समायोजित किया जाना चाहिए.
    4. पुलर धारकों में केशिका रखें और उन्हें कसें।
    5. कार्यक्रम शुरू करने और दो खींच लिया microcapillaries ले लो.
    6. $ 200-250 $m के एक बाहरी व्यास के साथ एक टिप प्राप्त करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, एक स्केलपेल के साथ, हाथ से केशिका टिप कट।
    7. एक बंद पेट्री डिश में एक मॉडलिंग मिट्टी (उदा., plasticine) समर्थन पर केशिकाओं प्लेस और यह हुड के नीचे करने के लिए स्थानांतरण.
  2. हुड की स्थापना और सेल अनुरेखक समाधान की तैयारी
    1. क्षैतिज प्रवाह हुड को सावधानी से साफ करें और 70% इथेनॉल का उपयोग करके इसे कीटाणुरहित करें।
    2. ऑप्टिकल फाइबर 70% इथेनॉल का उपयोग कर कीटाणुरहित और उन्हें हुड के नीचे जगह है।
    3. 125 एमएम EGTA समाधान के 10 डिग्री सेल्सियस और फास्ट ग्रीन के 10 डिग्री एल मिश्रण "सेल अनुरेखक समाधान" तैयार करने और हुड के नीचे जगह है.
    4. सेल निलंबन खोलना के लिए प्रयोगशाला सील फिल्म के छोटे टुकड़े (4 सेमी x 2 सेमी आकार) काटें।
    5. 1 मिलीग्राम/एमएल बाँझ doxycycline का एक समाधान तैयार करें और इसे 0.3 एमएल सिरिंज में मिला दें।
    6. हुड पर स्विच और आपरेशन से पहले 20 मिनट के लिए पर स्तरीय प्रवाह रखने के लिए।
  3. इंजेक्शन ट्यूब इकट्ठा करना
    1. एक हार्ड प्लास्टिक मुखपत्र, दो लेटेक्स ट्यूब (प्रत्येक के बारे में 30 सेमी लंबी) और calibrated microcapillary pipettes के लिए एक एस्पिरेटर ट्यूब विधानसभा किट से एक केशिका धारक ले लो.
    2. हार्ड-प्लास्टिक मुखपत्र को लेटेक्स ट्यूब के एक छोर पर ठीक करें।
    3. केशिका धारक को दूसरे लेटेक्स ट्यूब के एक छोर पर ठीक करें।
    4. ऑपरेटर कीटाणुओं के खिलाफ एक बाधा के रूप में, एक 0.45 डिग्री बाँझ फिल्टर के साथ दो लेटेक्स ट्यूबों के मुक्त सिरों कनेक्ट।
    5. एक मॉडलिंग मिट्टी धारक पर जिसके परिणामस्वरूप एस्पिरेटर ट्यूब विधानसभा प्लेस हुड के तहत रखा जाना है.

3. सेल मिश्रण और इंट्रावेंकुलर प्रत्यारोपण

  1. मिश्रण "परीक्षण" और "नियंत्रण" हरी सेल उप-पूल
    1. लीजिए "परीक्षण" और "नियंत्रण" neurospheres (कदम देखें 1.2.5) अलग 1.5 एमएल ट्यूबों में.
    2. सेंट्रीफ्यूज neurospheres 5 मिनट के लिए 200 ग्राम पर निलंबन.
    3. लीजिए और सेल गोली की अशांति से बचने, supernatant त्यागदें।
    4. धीरे से 1x पीबीएस के 500 डिग्री एल में neurospheres resuspend.
    5. 1 मिनट के लिए उन्हें 200 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    6. सुपरनेंट निकालें.
    7. 3.1.4-3.1.6 दो बार चरणों को दोहराएँ.
    8. 2x ट्रिप्सिन विलयन (2x ट्रिप्स, 1x पीबीएस) और पिपेट सेल पेलेट अप और नीचे 4x-5x के 200 डिग्री एल में गोलों को धीरे से पुन: स्फूंधा करें।
      नोट: ध्यान देना हवा बुलबुले बनाने के लिए नहीं है।
    9. एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को छोड़ दें।
    10. ट्रिप्सिन अवरोधक समाधान के 200 डिग्री एल के साथ ब्लॉक ट्रिप्सिन (डीएमईएम-एफ 12, 10 डिग्री जी/
    11. 5 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं और ताजा proliferative माध्यम के 1 एमएल में उन्हें फिर से भरना (DMEM-F12, 1x ग्लूटामैक्स, 1x N2, 1 mg/mL BSA, 0.6% ग्लूकोज, 2 g/mL heparin, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF, 1x pen-strep, 10 pg/
    12. दो पूल के कक्षों की गणना एक B$rker कक्ष में trypan नीले बहिष्करण विधि के साथ.
    13. उनकी सांद्रता को प्रोलाइफरी माध्यम में 100,000 कोशिकाओं/
    14. मिश्रण 1:1 "नियंत्रण" लोगों के साथ "परीक्षण" कोशिकाओं.
    15. एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (ऑब्जेक्टिव आवर्धन: 10x) के तहत जिसके परिणामस्वरूप मिश्रण दो पूलों का एक एकल सेल निलंबन है सुनिश्चित करने के लिए की जाँच करें (चित्र 3C)।
    16. हुड के नीचे बर्फ पर मिश्रण प्लेस.
  2. अंत:केंद्रीय प्रतिरोपण
    1. शल्य प्रचालक क्षेत्र से दूर एक मेज पर माँ और P0 पिल्ले के साथ पिंजरे तैयार करें।
    2. हुड के करीब एक गाड़ी पर एक वसूली पिंजरे रखें.
    3. वसूली पिंजरे के नीचे माँ के पिंजरे से लिया sawdust का एक मिश्रण रखो और यह एक दीपक के नीचे जगह है.
    4. एक तरफ, एक बर्फ P0 पिल्ले की संज्ञाहरण के लिए एक एल्यूमीनियम पन्नी द्वारा कवर बॉक्स सेट.
    5. बस प्रत्यारोपण से पहले, सेल अनुरेखक समाधान के 1/10 मात्रा जोड़ें (चरण 2.2.3 से) सेल निलंबन की 1 मात्रा (चरण 3.1.16 से) और जगह 3 $L जिसके परिणामस्वरूप "इंजेक्शन मिश्रण" प्रयोगशाला सील फिल्म के एक टुकड़े पर.
    6. 1 मिनट के लिए शांत एल्यूमीनियम पन्नी पर पिल्ला प्लेस और जाँच करें कि यह पूरी तरह से एनेस्थेटाइज़ किया गया है।
      नोट: संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए, धीरे एक पंजा निचोड़ और आंदोलनों की कमी के लिए पिल्ला की निगरानी, जबकि अभी भी साँस लेने.
    7. इस बीच, इंजेक्शन मिश्रण के 3 डिग्री एल (चरण 3.2.5 से) कांच केशिका में aspirate.
    8. 70% इथेनॉल के साथ एनेस्थेटाइज्ड पिल्ले के सिर को धीरे से पोंछें।
    9. ऑप्टिकल फाइबर की नोक पर पिल्ला की ठोड़ी रखें स्पष्ट रूप से cortical गोलार्द्धों की पहचान करने के लिए.
      नोट: P0-P1 पर, सिर की त्वचा बहुत पतली है, बस eyeballs के ऊपर और घ्राण बल्ब के पीछे गोलार्द्धों के सीधा दृश्य पहचान के लिए अनुमति देता है.
    10. केशिका रखें (चरण 3.2.7 में वर्णित के रूप में) दो मध्य parasagital विमानों में से किसी एक में (बाएं या दाएं), घ्राण बल्ब के ऊपर, और ललाट विमान eyeballs केन्द्रों युक्त के साथ अपने चौराहे पर माथे त्वचा पंचर. रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान दें। ललाट प्रांतस्था में केशिका दर्ज करें और वेंट्रिकुलर गुहा का उपयोग (चित्र 4A) .
    11. गुच्छिका के आकस्मिक क्षति को रोकने के लिए, सुई को बाद में 30 डिग्री से घुमाएं, इसकी नोक पुच्छ-मध्य-वार्ड की ओर इशारा करते हुए (चित्र 4 ख)।
    12. कोशिकाओं को वेंट्रिकुलर गुहा में धीरे-धीरे इंजेक्ट करें और फास्ट ग्रीन के माध्यम से उनके प्रसार की निगरानी करें (चित्र 4 ब्)।
    13. 5-10 एस रुको.
    14. कांच की सुई को निकालें जो देखभाल करते हैं ताकि सेल निलंबन को छोड़ न सके और इसे एक उपयुक्त निपटान बिन में छोड़ दें।
    15. संज्ञाहरण से प्यूप वसूली से पहले प्रत्यारोपण के बाद अभी भी बंद ट्रांसजीन अभिव्यक्ति रखने के लिए doxycycline समाधान के इंट्राperitoneally 150 डिग्री सेल्सियस इंजेक्ट.
    16. इंजेक्शन के बाद, ठीक होने के लिए पिल्ले को तुरंत दीपक के नीचे रखें।
    17. 5-10 मिनट के लिए दीपक के नीचे पिल्ले छोड़ दो और, एक बार पूरी तरह से जाग, उन्हें माँ के साथ पिंजरे में जगह है.
    18. 2-3 ज के लिए संचालित पिल्ले का निरीक्षण करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि माँ उन्हें स्वीकार करे।
    19. ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए 0.5 मिलीग्राम/एमएल डॉक्सीसाइक्लिन और 50 ग्राम/एल सुक्रोज युक्त पीने के पानी के साथ पिंजरे की आपूर्ति करें।
    20. प्रत्यारोपण के 4 दिन बाद doxy-free water द्वारा doxycycline युक्त पानी को बदलें, इस प्रकार पोस्ट-माइटोटिक न्यूरॉन्स में ट्रांसजीन को सक्रिय करें। चूहों को 6 दिनों के लिए एक मुक्त शासन में रखें और उन्हें P10 पर कार्बन डाइऑक्साइड inhalation द्वारा इच्छामृत्यु decapitation के बाद.

4. प्रत्यारोपित दिमाग का विश्लेषण

  1. ऊतक विज्ञान और इम्यूनोफ्लोरेसेंस
    1. प्रतिरोपित पिल्ले को कोशिका प्रत्यारोपण के 10 दिन बाद कार्बन डाइऑक्साइड इनहेलेशन द्वारा उत्कर्ष ित करें जिसके बाद क्षय होता है। रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) में यूथेनाइज्ड पिल्ले के दिमाग को ठीक करें।
      चेतावनी: पीएफए अत्यधिक विषाक्त है; यह देखभाल के साथ संभाल, सख्ती से निर्माता के नुस्खे के साथ पालन, एक रासायनिक धूआं हुड के तहत; एक लेबल अपशिष्ट कंटेनर में पीएफए समाधान अवशिष्ट छोड़ दें।
    2. पीएफए समाधान निकालें और इसे 30% सुक्रोज समाधान के साथ बदलें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर या जब तक वे शीशी नीचे सिंक पर दिमाग छोड़ दें.
    4. एक डिस्पोजेबल embedding मोल्ड में दिमाग स्थानांतरण लगभग आधे से भरे क्रायो-सम्मिलन माध्यम के साथ.
    5. -80 डिग्री सेल्सियस पर शामिल दिमाग फ्रीज।
    6. क्रायोस्टैट का उपयोग करके 60 मीटर मोटी कोरोनल खंडों को काटें।
      नोट: पतले वर्गों को रोजगार से बचें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप एकल न्यूरॉन्स की पूरी वास्तुकला के बारे में जानकारी की अस्वीकार्य हानि हो सकती है।
    7. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए प्रक्रिया अनुभाग18,19, एंटी-जीएफपी [1:400] और एंटी-आरएफपी (मचेरी) [1:500] एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए। 1 मिलीग्राम/एमएल डीएपीआई विलयन [1:200] के साथ काउंटरस्टेन नाभिक।
  2. मोरहोमेट्री
    1. confocal माइक्रोस्कोप के काम मानकों को इस प्रकार सेट करें: z-स्टैक ऊंचाई $ 40 $m; चरण - 2 डिग्री मी.
    2. GFP सकारात्मक न्यूरॉन अमीर फोटो क्षेत्रों का चयन प्रतिरक्षा स्लाइस की तस्वीरें ले लीजिए, आरएफपी संकेत वितरण के अंधा.
    3. छवियों को .nd2 फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें.
    4. उनमें से अधिकतम $-प्रक्षेप ोंका करें .tiff फ़ाइलें (चित्र 5A)।
    5. कोशिकाओं जीनोटाइप के लिए अंधा उप-क्रमिक न्यूरोनल कंकालीकरण के लिए अनुमति देने के लिए, लाल संकेत छिपाएं। ऐसा करने के लिए, एक उपयुक्त सॉफ़्टवेयर द्वारा प्रत्येक .tiff फ़ाइल खोलें और समायोजन परत जोड़ें. "स्तर", "लाल" का चयन करें, फिर शून्य करने के लिए "आउटपुट" सेट करें। फ़ाइल को इस प्रकार सहेजें.
      नोट: Skeletonization बाद में मूल सादे लाल फ़ाइलों के लिए कोई पिछले पहुँच था जो एक नए ऑपरेटर द्वारा किया जाता है.
    6. प्रत्येक छुपी हुई लाल फ़ाइल के लिए, प्राथमिक छवि में आरेखण परत जोड़ें और पेंसिल उपकरण (सफेद रंग) का चयन करें. GFP संकेत के आधार पर सोमा ट्रेस, तो neurites का पता लगाने.
      नोट: पेंसिल उपकरण सोमा के लिए 40 पिक्सल पर और neurites के लिए तीन पिक्सल पर सेट किया जा सकता है.
    7. न्यूरोनल silhouettes सहित बहुपरत फ़ाइल सहेजें (चित्र 5B)
      नोट: न्यूरॉन कंकाल के बाद विश्लेषण या तो ऑपरेटर द्वारा किया जा सकता है.
    8. काले रंग की पृष्ठभूमि के साथ एक नया 1024 x 1024 16-बिट स्केल फ़ाइल बनाएँ, न्यूरॉन प्रति एक.
    9. कॉपी और पेस्ट एकल न्यूरोनल silhouettes प्राथमिक छवि से नए स्केल फ़ाइल के लिए. बहुपरत फ़ाइल के लिए वापस जाओ और न्यूरोनल जीनोटाइप अनावरण करने के लिए समायोजन परत बंद कर देते हैं। इसी न्यूरोनल जीनोटाइप को एनोटेट करने वाली 16-बिट स्केल फ़ाइल सहेजें।
    10. ImageJ में एक के बाद एक ग्रेस्केल छवियों आयात और ImageJ सॉफ्टवेयर20 के NeurphologyJ प्लगइन द्वारा कंकाल का विश्लेषण (चित्र 5C).
    11. कॉपी NeurphologyJ प्राथमिक डेटा(न्युराइट-लंबाई, attachment-points और समापन बिंदु; प्रत्येक के लिए, "कुल क्षेत्र" मान ले), उन्हें एक स्प्रेडशीट में पेस्ट करें और उन्हें माध्यमिक morphometric मापदंडों की गणना करने के लिए रोजगार ( औसत न्यूराइट लंबाई, शाखा सूचकांक) (चित्र 5D)

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Representative Results

प्रक्रिया के प्रमुख पहलुओं के बारे में उपयोगी जानकारी प्रदान करने वाले पांच प्राथमिक डेटासेट हैं, पहला (1) तंत्रिका अग्रदूतों की दक्षता और lentiviral सदिशों द्वारा सह-परिवर्तन। (2) "परीक्षण जीन" ड्राइव करने के लिए कार्यरत प्रमोटरों की प्रमुख विशेषताओं का एक उदाहरण. (3) प्रत्यारोपण के लिए तैयार इंजीनियर कोशिकाओं का एक उदाहरण. (4) नवजात मस्तिष्क में सेल माइक्रोइंजेक्शन के प्रमुख प्रक्रियात्मक विवरण सहित एक कार्टून। (5) पूरे morphometric पाइप लाइन का एक सार.

(1) के लिए के रूप में, विभिन्न MOIs (2,4,8) पर दिया प्रोटोटाइपिक लेन्टीवायरल वैक्टर की क्षमता को प्रभावी ढंग से neocortical अग्रदूतों transduce करने के लिए मूल्यांकन किया गया था. पहले परख में, प्रारंभिक जंगली प्रकार neocortices से उत्पन्न तंत्रिका अग्रदूतों एक lentiviral रिपोर्टर से संक्रमित थे, न्यूरोजनिक-लाइनेज-विशिष्ट पीटीजेड 1 प्रमोटर के नियंत्रण में मची कोडिंग अनुक्रम (सीडी) शरण, MOI पर $ 2, 4, 8, तो अंतर करने की अनुमति दी. मक्की और पैन-न्यूरोनल मार्कर Tubb3 के लिए उनकी संतानों के सह-प्रतिरक्षा-प्रोफाईलिंग से पता चला कि न्यूरॉन्स को प्रभावी ढंग से 64%, 69%, और 78% की आवृत्तियों पर प्रभावी रूप से ट्रांसड्यूस किया गया था (चित्र 1A)। एक दूसरे परख में, neocortical अग्रदूतों तीव्रता से दो lentiviral पत्रकारों द्वारा coinfected थे, EGFP और mCherry व्यक्त, गठन pPgk1 प्रमोटर के नियंत्रण में, MOIs पर $(2,2), (4,4), और (8,8). कुछ दिनों बाद, उनके डेरिवेटिव्स के सह-प्रतिरक्षा-प्रोफेशनिंग से पता चला कि ईजीएफपी + एमचेरी+और ईजीएफपी+मचेरी कोशिकाओं के बीच अनुपात क्रमशः 80%, 88% और 93% था (चित्र1बी)। इन आंकड़ों का सुझाव है कि, वर्तमान अध्ययन के लिए परिकल्पित इंजीनियरिंग प्रोटोकॉल के वितरण पर, (क) न्यूरॉन्स के विशाल बहुमत transduced हैं, और (ख) लगभग सभी ट्रांसड्यूस न्यूरॉन्स पूर्ण lentiviral सेट उनके लक्षण के लिए आवश्यक प्राप्त किया.

Figure 1
चित्र 1 : तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं की दक्षता lentiviral वेक्टर द्वारा transduction. पैनलों दक्षता का एक मूल्यांकन रिपोर्ट जिसके द्वारा E12.5 neocortical अग्रदूत कोशिकाओं transduced रहे हैं (या सह transduced) संक्रमण के विभिन्न multiplicities पर समर्पित lentiviral पत्रकारों की डिलीवरी पर (MOIs). पूर्व मामले में(ए), कोशिकाओं को MOI में lentivirus (LV) pT $1-mCherry से तीव्रता से संक्रमित थे - 2, 4, 8, 2 दिनों के लिए proliferative माध्यम में सुसंस्कृत, अंतर माध्यम में स्थानांतरित, और 1 सप्ताह के लिए अंतर करने की अनुमति दी. इन विट्रो (DIV) 9 में दिन में निर्धारण पर, संस्कृतियों को एमचेरी और पैन-न्यूरोनल मार्कर Tubb3 के लिए सह-प्रतिरक्षा प्रोफाईड किया गया था। एमचेरी और ईजीएफपी संकेतों का पता एंटी-आरएफपी और एंटी-ईजीएफपी प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा लगाया गया था और क्रमशः एलेक्सा-594- और एलेक्सा-488-कंजुटेड सेकेंडरी एंटीबॉडी द्वारा पता चला था। अंत में, mCherry+Tubb3+/ mCherryTubb3+ अनुपात की गणना की गई, औसत और इसी MOIs के खिलाफ साजिश रची. बाद के मामले में (बी), कोशिकाओं को तीव्रता से दो lentiviruses के एक 1:1 मिश्रण से संक्रमित थे, गठन सक्रिय pPgk-mCherry और pPgk-EGFP transgenes के लिए एन्कोडिंग, विभिन्न MOIs पर (2, 4, 8 प्रत्येक वायरस के लिए). कोशिकाओं को 4 दिनों के लिए proliferative माध्यम में सुसंस्कृत किया गया, trypsinized और, निर्धारण पर, ऊपर के रूप में mCherry और EGFP इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए profiled. अंत में, mCherry+EGFP+/ mCheryEGFP+ अनुपात की गणना की गई, औसत और इसी MOIs के खिलाफ साजिश रची. त्रुटि पट्टियाँ S.E.M. का प्रतिनिधित्व करती हैं कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

(2) के लिए के रूप में, pT $1 और pSyn गतिविधि पैटर्न उनके नियंत्रण में फ्लोरोप्रोटीन जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के आधार पर अनुमान लगाया जा सकता है. इस उदाहरण में, इस प्रकार के नियंत्रण का प्रत्यक्ष रूप से मञ्च (चित्र 2क) के मामले में होता है, और अप्रत्यक्ष [अर्थात एक टेटॉन दूसरी पीढ़ी के अंतराफलक द्वारा मध्यस्थता की गई (चित्र 2E)], ईजीएफपी (चित्र 2ठ, ब्,D) के मामले में। दोनों प्रवर्तक Tubb3+ postmitotic न्यूरॉन्स के भीतर विशेष रूप से सक्रिय हैं (चित्र 2B, सी, डी), लेकिन pT $1 भी Ki67 के एक सबसेट में आग+ intermitootic (neuronogenic) अग्रदूतों (चित्र 2A). यहाँ, प्रमोटर गतिविधि की सीमित परिवर्तनशीलता का एक विचार प्रदान करने के लिए जब कोशिकाओं को इन मानक शर्तों के अनुसार इंजीनियर हैं (चित्र 2E),pT$1- और pSyn संचालित EGFP अभिव्यक्ति का स्तर Tubb3 के भीतर+ न्यूरॉन्स द्वारा परिमाणित किया गया फ़ोटोशॉप CS6 हिस्टोग्राम प्लगइन. फिर, मध्यप्रदो के विरुद्ध कच्चे आंकड़ों को सामान्य किया गया और प्रवर्तकों के विरुद्ध साजिश रची गई (चित्र2 एफ) उल्लेखनीय है कि एकल-सेल फ्लोरोसेंट स्तर औसत के चारों ओर सघन रूप से संकुलित थे: क्रमशः पीटीजेड1 और पी एस आई के मामलों में प्रथम और तृतीय चतुर्थक ों की बराबरी 0.86 और 1.16 तथा 0.89 तथा 1.12।

Figure 2
चित्र 2 : भारत सरकार overexpression ड्राइव करने के लिए उपयुक्त तंत्रिका अग्रदूत प्रकार-विशिष्ट प्रमोटरों की प्रोफाईलिंग। पैनलों Tubulin अल्फा 1 (pT$1) और Synapsin (pSyn) प्रमोटरों की विशेषता को देखें, पूरे न्यूरॉन वंश और postmitotic न्यूरॉन्स के भीतर विशेष रूप से सक्रिय, क्रमशः. परीक्षण विभिन्न भ्रूणीय (ईएन) उम्र में काटा गया नवकोर्टिक अग्रदूतों में चलाया गया था, समर्पित lentiviral घोला जा सकता है के साथ तीव्रता से संक्रमित [pT]1-mCherry में ( (ए; pT]1-rtTA, TRET-EGFP में (B ); pSyn-rtta, TRET-EGFP में (सी,डी ),2 डिग्री ) /ml doxy ab initio,और proliferative माध्यम (A), proliferative (2 दिन) के बाद विभिन्न माध्यम (बी, सी), या अंतर (डी) माध्यम में सुसंस्कृत. इन विट्रो (DIV) nमें दिन में निर्धारण पर , postmitotic न्यूरॉन्स द्वारा की पहचान की गई $Tubb3 और intermitotic अग्रदूतों द्वारा $Ki67 इम्यूनोफ्लोरेसिस द्वारा; चित्र 1में दर्शाए अनुसार मचेरी और ईजीएफपी का पता लगाया गया था। संकेतचित्र 1में दर्शाए गए अनुसार प्रकट किए गए थे। स्केल बार: 100 डिग्री मी (ए,बी) और 50 डिग्री मी (सी, डी) में। दिखाया गया है (ई) समर्पित lentiviral आंकड़ा पैनलों के संदर्भ के साथ इस अध्ययन में इस्तेमाल घोला जा सकता है. दिखाया गया है , टट का एक तितर बितर आलेख है - और टब्ब3में पी.जी.एफ.पी. संकेत , क्रमशः (ठ) और (डी) में संदर्भित कोशिकाओं का सारण है . बॉक्स्ड कोशिकाओं 25वें और 75वें शतमक के बीच गिर रहे हैं; मूंछों में 10वें और 90प्रतिशत का उल्लेख है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

के लिए के रूप में (3), lentiviral transduction के बाद 3 दिन, MtaptEGFP / + "हरी" neurospheres Pgk1p प्रमोटर संचालित व्यक्त, mCherry लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन ("नियंत्रण" क्षेत्रों) या नहीं ("परीक्षण" क्षेत्रों) ( चित्र3A, बी) . सभी क्षेत्रों एकल कोशिकाओं के लिए अलग कर रहे हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए कोई clumps छोड़ दिया है, और इसी निलंबन मिश्रित कर रहे हैं 1:1. परिणामस्वरूप मिश्रण (चित्र 3C) बर्फ पर रखा गया है और प्रत्यारोपण के लिए 20 मिनट के भीतर इस्तेमाल किया.

Figure 3
चित्र 3 : परीक्षण का उदाहरण ("केवल हरे रंग") और नियंत्रण ("हरी लाल") DIV2 neurospheres और सेल निलंबन प्रत्यारोपण के लिए तैयार. (ए, बी) इन क्षेत्रों MtaptEGFP/ +ई 12.5 neocortical अग्रदूतों से प्राप्त किए गए थे, lentiviral घोला जा सकता है से गंभीर रूप से संक्रमित "pCAG[lac], Pgk1p]tTA, TRET[GOI" (ए) और "Pgk1p]mCherry, Pgk1p ]tTA, TRET PLAP (B), क्रमशः, प्रत्येक , LVI पर 8, और proliferative माध्यम में रखा. (सी) सेल निलंबन एकल कोशिकाओं के लिए "परीक्षण" और "नियंत्रण" neurospheres (ए, बी) को अलग करके प्राप्त किया गया था और उन्हें मिश्रण 1:1. स्केल बार: 200 डिग्री (ए, बी) में और 100 डिग्री (सी) में। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

के लिए के रूप में (4), नवजात मस्तिष्क में सेल इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया तीन महत्वपूर्ण कदम भी शामिल है. केशिका, मध्य पैरासैगिटल तल पर रखा, ललाट cortical दीवार के माध्यम से पार्श्व वेंट्रिकुलर गुहा में प्रवेश किया है (चित्र 4A). इसके बाद, गुच्छिका-उत्सर्जन की क्षति को रोकने के लिए, केशिका को क्षैतिज तल के भीतर 30 डिग्रीघुमाया जाता है, ताकि टिप मीडिया/ पिछले, सेल निलंबन नाजुक पार्श्व वेंट्रिकुलर गुहा में बाहर निकाल दिया है, जहां यह एक आसानी से भेद, प्रकाश नीले "बादल" (चित्र4C)रूपों.

Figure 4
चित्र 4 : नवजात मस्तिष्क में सेल इंजेक्शन के लिए कार्यरत तीन कदम प्रक्रिया के Schematics. (ए) केशिका ललाट नवकोरटिक दीवार के माध्यम से पार्श्व निलय में प्रवेश किया है. फिर, (बी) यह मध्य की ओर घुमाया जाता है, गुच्छिका eminence की क्षति को रोकने के लिए. अंत में (सी), सेल निलंबन धीरे पार्श्व निलय, जहां यह एक हल्के नीले बादल रूपों में इंजेक्शन है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

के लिए के रूप में (5), विश्लेषणात्मक प्रक्रिया चार मुख्य कदम शामिल हैं. सबसे पहले, प्रत्यारोपित न्यूरॉन समृद्ध क्षेत्रों के ऑप्टिकल confocal वर्गों चपटा कर रहे हैं, मैक्स के अनुसार - प्रक्षेपण मोडलिटी तो आरजीबी .tiff फ़ाइलें पैदा. यहाँ, एक उदाहरण के रूप में, केवल "हरी परीक्षण" न्यूरॉन्स और "पीला नियंत्रण" न्यूरॉन्स, सह-प्रतिरोपित अग्रदूतों से शुरू, आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है (यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि mCherry वैकल्पिक रूप से लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है "परीक्षण" न्यूरॉन्स) ( चित्र ासान5A). फिर, चित्र का एक आदर्शीकृत, कंकालित कैमरा ल्यूसिडा संस्करण एक उपयुक्त ग्राफिक सॉफ़्टवेयर द्वारा उत्पन्न होता है (चरण 4.2.6 देखें) (चित्र 5B) लाल चैनल के एक ऑपरेटर द्वारा. डेटा मूल्यांकन में किसी भी अनजाने पूर्वाग्रह को रोकने के लिए लाल चैनल का अंधापन अत्यंत महत्वपूर्ण है। अगला, एकल-न्यूरॉनल silhouettes काले और सफेद चित्रों और तीन प्राथमिक मापदंडों के मूल्यों के रूप में NeurphologyJ सॉफ्टवेयर में खिलाया जाता है "exitpoints की कुल संख्या" (attachment]points), "अंतबिंदु की कुल संख्या" (अंत बिंदु) और "कुल न्युराइट लंबाई" (न्युराइट-लंबाई) एकत्र की जाती है (चित्र 5C) . अंत में, प्रत्येक न्यूरॉन के माध्यमिक मापदंडों की गणना कर रहे हैं, औसत और सांख्यिकीय एक्सेल सॉफ्टवेयर द्वारा मूल्यांकन (चित्र 5D).

Figure 5
चित्र 5 : प्रत्यारोपित दिमाग के मॉर्फोमीट्रिक विश्लेषण के प्रतिनिधि प्रवाहचार्ट। ऊपरी पंक्ति पैनलोंशो: (एक ) एक MAX z-प्रक्षेप .tiff छवि मध्यस्थ neocortex, इंजीनियर सेल प्रत्यारोपण के बाद 10 दिन तय (हरी ] Mtapt-चालित, न्यूरॉन-प्रतिबंधित EGFP; लाल ] mCherry, गठन लेबलिंग "नियंत्रण" कोशिकाओं; नीले ] DAPI), हरी चैनल संकेत, और (बी) अपने कंकालई ई कैमरा ल्यूकिडा प्रतिपादन. स्केल बार: 50 डिग्री मी. नीचे पंक्ति में शामिल हैं: (सी) प्राथमिक morphometric मानकों NeurphologyJ सॉफ्टवेयर विश्लेषण द्वारा न्यूरॉन कंकाल से निकाले गए (neurite-लंबाई के रूप में [li, attachment]points के रूप में एनबाहर निकलें और एनएंडके रूप में अंतिम बिंदु और (डी) माध्यमिक पैरामीटरों की गणना उनके आधार पर की जाती है। यह आंकड़ा Chiola एट अल21से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रक्रिया के विशिष्ट पहलू/चरण महत्वपूर्ण हैं और इस पर विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। सबसे पहले, (क) ऑपरेटरों पर्याप्त रूप से एक बीएसएल-2 अनुरूप प्रयोगशाला वातावरण में lentiviruses हेरफेर करने के लिए पर्याप्त रूप से pretrained होना चाहिए. दूसरा, (ख) मिश्रण करने से पहले "परीक्षण" और "नियंत्रण" तंत्रिका तैयारी, यह ध्यान से वर्णित के रूप में दो इसी neurosphere निलंबन धोने के लिए अनिवार्य है, ताकि अवांछित lentiviral के कारण दो तैयारी के किसी भी देरी पार संक्रमण को रोकने के लिए पर ले जाने के लिए. तीसरा, (ग) कोशिकाओं को प्रतिरोपित करते समय, वेंट्रिकुलर गुहा को लक्षित करते समय देखभाल की जानी चाहिए; इस संबंध में, फास्ट ग्रीन अनुरेखक सेल निलंबन में शामिल पर्याप्त मदद की है. इसके अतिरिक्त, (घ) नरभक्षीता को रोकने के लिए, प्रत्यारोपित पिल्ले को संज्ञाहरण से अपनी पूरी वसूली के बाद ही मां को फिर से स्थानांतरित किया जाना चाहिए (आमतौर पर 10 मिनट पर्याप्त है)। (ड) प्रतिरोपित ऊतक का क्रायो-सेक्शन60 डिग्री मीटर पर किया जाना चाहिए; वास्तव में, इस मोटाई एक साथ ऊतक में एक आसान एंटीबॉडी प्रवेश की अनुमति देता है और artifactual न्यूरॉन विखंडन से उत्पन्न जानकारी के नुकसान को सीमित करता है. अंत में, (च) डेटा मूल्यांकन में किसी भी अनजाने पूर्वाग्रह को रोकने के लिए, हम जोर देते हैं कि न्यूरॉन skeletonization लाल चैनल के अंधा एक ऑपरेटर द्वारा किया जाना चाहिए.

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल GOF जीन जोड़तोड़ को संदर्भित करता है. वैकल्पिक रूप से, "परीक्षण" न्यूरॉन्स RNAi effectors के लिए lentiviruses एन्कोडिंग के माध्यम से भारत सरकार समारोह को विनियमित करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है. अगले, हम आम तौर पर "नियंत्रण" तंत्रिका कोशिकाओं लेबल करने के लिए mCherry को रोजगार; तथापि, मक्की/नियंत्रण और लाखा/परीक्षण योजना स्पष्ट रूप से उलटा हो सकती है। पिछले, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल intraventricular सेल इंजेक्शन को संदर्भित करता है; "परीक्षण" और "नियंत्रण" न्यूरॉन्स वैकल्पिक रूप से तंत्रिका parenchima21में सह इंजेक्शन किया जा सकता है.

अपने फायदे के बावजूद, इस विधि की दो मुख्य सीमाएं हैं। कोशिका की जांच करने की अनुमति देते समय-neuroarchitecture के स्वायत्त जीन नियंत्रण, यह इसके बारे में पर्यावरण ीय नियंत्रण के लिए लागू नहीं होता है. इसके अलावा, के रूप में प्रतिरोपित न्यूरोनल अग्रदूतों जन्म के बाद अपने अंतिम पटल स्थान के लिए cortical दीवार के वेंट्रिकुलर पहलू से विस्थापित (यानी एक गैर भौतिक समय सीमा के भीतर), इस विधि अधिमानतः मॉडल के लिए नियोजित किया जाना चाहिए neuroarchitectonics प्रवास पूरा होने के बाद नियंत्रण.

पिछले नहीं बल्कि कम से कम, परिणामों की महत्वपूर्ण व्याख्या करने के लिए विशेष ध्यान दिया जाना चाहिए. विशेष रूप से, यदि जांच के एक्स जीन विषय "परीक्षण" न्यूरॉन्स के रूपात्मक जटिलता को कम कर देता है, यह विशेष रूप से न्यूरॉन वास्तुकला पर अपने वास्तविक प्रभाव को प्रतिबिंबित नहीं हो सकता है. बल्कि, इस तरह की घटना एक्स overexpression द्वारा प्राप्त न्यूरॉन क्षति के एक गैर विशिष्ट सूचकांक हो सकता है. इस मुद्दे को हल करने के लिए, यह प्रतिरोपित की स्थानीय घनत्व की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है, "परीक्षण" और "नियंत्रण" न्यूरॉन्स, तो संभव संख्यात्मक संकुचन के लिए देखो "परीक्षण" जनसंख्या, X द्वारा प्रेरित न्यूरॉन पीड़ित के एक सूचकांक के रूप में [इस संकुचन और भी अधिक होना चाहिए प्रतिरोपित मस्तिष्कों के और विलंबित विश्लेषण पर स्पष्ट किया गया। ऐसे मामलों में, एक्स जीन के oveaसंपीड़न स्तर को कम करने या एक हानि के समारोह डिजाइन करने के लिए आगे बढ़ इस मुद्दे को ठीक हो सकता है.

हमारी विधि विवो1, 2,3,4,7,8में न्यूरोनल आकारिकी के जीन नियंत्रण की जांच करने के लिए कार्यरत प्रौद्योगिकियों की एक विस्तृत सरणी के लिए कहते हैं, 9 , 10 , 11 , 12.जैसा कि परिचय में याद किया गया है, ये तकनीकें भारत सरकार के अभिव्यक्ति के स्तर को परेशान करने और जैविक नमूनों से आकृतिक जानकारी की निकासी को कम करने के उद्देश्य से विभिन्न तदर्थ आनुवंशिक जोड़-तोड़ पर निर्भर करती हैं। इन प्रौद्योगिकियों आमतौर पर इस नियंत्रण का सटीक विच्छेदन की अनुमति; हालांकि, वे मूल्यवान प्रयोगात्मक कौशल और वित्तीय संसाधनों की आवश्यकता नहीं है. इस संबंध में, विधि तीन प्रमुख लाभ प्रदान करता है. यह ट्रांसजेनिक मॉडल के लिए अजीब उन लोगों के लिए तुलनीय भारत सरकार अभिव्यक्ति के स्तर का एक सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है; हालांकि, उत्परिवर्ती कॉलोनी रखरखाव लागत के अभाव में. यह परिष्कृत प्रयोगात्मक (सर्जिकल) कौशल की आवश्यकता नहीं है। यह अक्सर जानवरों की एक अपेक्षाकृत सीमित संख्या के विश्लेषण पर परिणामों के सांख्यिकीय महत्व को प्राप्त करता है.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम इस प्रक्रिया की जल्दी स्थापित करने के लिए उनके योगदान के लिए Mihn Duc क्या धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3 mL syringe BD 320840 store at RT
0.45 μm sterile filter Millex-HV SLHU033RS store at RT
12 multiwell plate Falcon 353043 store at RT
1X PBS Gibco 14190-094 store at RT
24 multiwell plate Falcon 351147 store at RT
anti-EGFP antibody, chicken polyclonal, RRID:AB_371416 Tebubio GTX13970 store at -20 °C
anti-RFP antibody, rat monoclonal, RRID:AB_10795839 Antibodies Online ABIN334653 store at -20 °C
anti-Tubb3 antibody, mouse monoclonal, RRID:AB_2313773 Covance MMS-435P store at -20 °C
Aspirator tube assemblies kit for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA store at RT
Blue light lamp Nightsea BLS2 store at RT
Borosilicate capillaries Kwik-Fil TW150-4 store at RT
BSA Sigma A9647 store at -20 °C
Bürker chamber Sigma BR719520 0.0025 mm2, 0.100 mm
Cryo-inclusion medium (Killik) Bio-Optica 05-9801 store at RT
DAPI Sigma D9542 store at -20 °C
Disposable embedding mold Bio-Optica 07MP7070 store at RT
DMEM/F-12 Gibco 31331-028 store at +4 °C
Dnase I Roche 10104159001 store at -20 °C
Doxycicline Sigma D1822 store at -20 °C
Dumont forceps #3c Fine Science Tools 11231-20 store at RT
Dumont forceps #5 Fine Science Tools 11251-20 store at RT
EGF Gibco PHG0311 store at -20 °C
EGTA Sigma E3889 store at RT
FGF Gibco PHG0261 store at -20 °C
Fine scissors - Sharp Fine Science Tools 14060-09 store at RT
Fungizone (Amphotericin B) Gibco 15290018 store at -20 °C
Glucose Sigma G8270 store at RT
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 store at RT
Goat anti-chicken Alexa 488 Invitrogen A11039 store at -20 °C
Goat anti-rat Alexa 594 Invitrogen A11007 store at -20 °C
Heparin Solution Stem Cell Technologies 07980 store at -20 °C
N2 Supplement Gibco 17502048 store at -20 °C
Optical fibers Leica CLS150X
P1000 puller Sutter Instruments P-1000 model
Parafilm Bemis PM-996 store at RT
Pen Strep Sigma P0781 store at -20 °C
Petri dish Falcon 353003 store at RT
PFA Sigma 158127 store at RT
Plasmid #363 [LV_TREt_(IRES)PLAP] built in house store at -20 °C
Plasmid #386 [LV_pTa1_mCherry] built in house store at -20 °C
Plasmid #401 [LV_pTa1_rtTA(M2)] built in house store at -20 °C
Plasmid #408 [LV_Ppgk1p_rtTA(M2)] built in house store at -20 °C
Plasmid #484 [LV_lacZ] Addgene 12108 store at -20 °C
Plasmid #529 [LV_Pgk1p_mCherry] built in house store at -20 °C
Plasmid #730 [LV_pSyn_rtTA(M2)] built in house store at -20 °C
Scalpel Braun BB515 store at RT
Steromicroscope Leica MZ6 store at RT
Trypan blue Gibco 15250-061 store at RT
Trypsin Gibco 15400-054 store at -20 °C
Trypsin inhibitor Sigma T6522 store at -20 °C

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References

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Chiola, S., Santo, M., Mallamaci, A. Intraventricular Transplantation of Engineered Neuronal Precursors for In Vivo Neuroarchitecture Studies. J. Vis. Exp. (147), e59242, doi:10.3791/59242 (2019).

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