Рассечение местных Ca^{2 +} сигналов в культивируемых клеток мембрана ориентированных Ca^{2 +} индикаторы

Summary

Здесь мы представляем собой протокол для Ca^{2 +} изображений в нейронов и глиальных клеток, который позволяет рассечение Ca^{2 +} сигналов на субклеточном резолюции. Этот процесс применяется для всех типов клеток, которые позволяют выражение генетически закодированный Ca^{2 +} показателей.

Abstract

Ион кальция (Ca^{2 +}) молекула универсальный внутриклеточным messenger диски несколько сигнальных путей, приводит к различных биологических материалов. Координация двух Ca^{2 +} источников сигнала — «Ca^{2 +} приток» из вне ячейки и «Ca^{2 +} освобождение» от внутриклеточного Ca2 + хранить эндоплазменный ретикулум (ER) — считается лежат в основе различных пространственно временные закономерности Ca ^{2 +} сигналы, которые вызывают несколько биологических функций в клетках. Цель настоящего Протокола заключается в том, чтобы описать новый Ca^{2 +} изображения метод, который позволяет осуществлять мониторинг самого момента «Ca^{2 +} приток» и «Ca^{2 +} выпуск». ООР-GCaMP6f это генетически закодированный Ca^{2 +} индикатор (ГЕЧИ) состоит из GCaMP6f, который предназначен для внешней мембраны ER. ООР-GCaMP6f может контролировать Ca^{2 +} выпуска с более высоким временным разрешением чем обычных GCaMP6f. В сочетании с таргетингом на плазматической мембране GECIs, пространственно временной Ca^{2 +} сигнал шаблон может быть описана в субцеллюлярные резолюции. Субцеллюлярные таргетингом Ca^{2 +} индикаторы, описанные здесь в принципе, доступны для всех типов клеток, даже для в-vivo изображений Caenorhabditis elegans нейронов. В этом протоколе мы представляем Ca^{2 +} изображения в ячейках от линий клеток, нейронов и глиальных клеток в диссоциированных первичных культур и описывают подготовку замороженных запас корковых нейронов крысы.

Introduction

CA^{2 +} сигналы представляют собой повышение концентрации внутриклеточного Ca^{2 +} . CA^{2 +} является универсальной второй messenger для эукариотических клеток. С помощью Ca^{2 +}, клетки функционировать через различных внутриклеточных сигнальных путей и побудить различных биологических материалов. Например в нейронах, релиз синаптических пузырьков на пресинаптическом терминале, экспрессии генов в ядро и индукции синаптической пластичности в postsynapse регулируются собственный Ca^{2 +} сигналы, которые точно активировать соответствующий вниз по течению ферментов в правильные сайты и с точного времени¹.

Определенных пространственно-временных закономерностей Ca^{2 +} сигналов активировать специфических ферментов вниз по течению. CA^{2 +} сигналы, генерируемые координацию между двумя различными Ca^{2 +} источники: Ca^{2 +} приток из внеклеточного пространства и Ca^{2 +} освобождение от эндоплазменный ретикулум (ER), который служит в качестве внутриклеточного Ca^{2 +} магазин. Значимые пространственно-временных Ca^{2 +} сигнализации шаблон вызвать функцию определенную ячейку также поддерживается nanodomains 10 – 100 мкм Ca^{2 +} созданных вблизи Ca^{2 +} каналов на плазматической мембраны или ER мембраны². Важно отметить, что источником Ca^{2 +} сигналов является одним из наиболее важных факторов, определяющих течению биологической вывода. В нейронах Ca^{2 +} приток и Ca^{2 +} выпуска имеют противоположный эффект на кластеризации гамма - аминомасляная кислота (ГАМК)_A рецепторов (ГАМК_AR) на ГАМК синапсы, который отвечает за торможение ³возбудимости нейронов. CA^{2 +} приток сопровождается массовым возбуждения нейронов индуцирует дисперсии синаптических ГАМК_AR кластеров, тогда как постоянные Ca^{2 +} освобождение от ER способствует кластеризации синаптических ГАМК_ARs. Другие группы также сообщил, что тюнинг направление конусы роста зависит от источника Ca^{2 +} сигнала: Ca^{2 +} приток вызывает отвращение, в то время как Ca^{2 +} выпуск руководства притяжения нейрональных роста ⁴конус. Таким образом чтобы полностью понять Ca^{2 +} сигнальные пути, лежащих в основе определенных клеточных выходов, важно определить источник Ca^{2 +} сигналов, описывая Ca^{2 +} сигналы на субклеточном резолюции.

В этом протоколе мы описываем Ca^{2 +} изображения метод, позволяющий сообщить Ca^{2 +} сигналы на субклеточном резолюции, которая позволяет оценки Ca^{2 +} источников сигнала (рис. 1). CA^{2 +} microdomains только под плазматической мембраны успешно контролируются генетически закодированный Ca^{2 +} индикаторов (GECIs) ориентированы на плазматической мембране через вложение плазматической мембраны локализация сигнала Lck в Src Киназа N-Термини GECIs⁵. Чтобы обнаружить Ca^{2 +} шаблон сигнала вблизи ER с лучше пространственным и временным разрешением, мы недавно разработали ООР-GCaMP6f, в котором GCaMP6f⁶ целей ER внешней мембраны, используя белка трансмембранного ER. ООР-GCaMP6f чутко могут сообщать Ca^{2 +} освобождение от ER лучше пространственно-временных разрешением, чем обычные неадресных GCaMP6f в клетки COS-7⁷ и HEK293 клетки⁸, избегая распространения Ca^{2 +} и GECIs . Мы также подтвердили, что спонтанное Ca^{2 +} высота в культивированный гиппокампа астроциты, сообщает ООР-GCaMP6f показало различных пространственно-временных шаблон по сравнению с наблюдением ориентированные на плазматической мембране GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)^{7 ,9}, указав, что Ca^{2 +} изображений с ООР-GCaMP6f в сочетании с Lck-GCaMP6f способствует рассечение Ca^{2 +} сигналов на субклеточном резолюции для выявления их источников.

В настоящее время мы подробно протокол для Ca^{2 +} сигнал вскрытия НеЬа клетки и нейрон экзоцитоз смешанных культур, покрытие на coverslips стекла. Ca^{2 +} Тепловизионная техника с GECIs указано здесь, Lck-GCaMP6f, плазма мембраны ориентированных RCaMP2¹⁰ (Lck-RCaMP2), и ООР-GCaMP6f (рис. 1), применимы ко всем ячейкам, в которые могут быть выражены эти GECIs.

Protocol

Все эксперименты, описанные здесь были утверждены RIKEN безопасности Комитет и Комитет животных эксперимент, по мнению руководства, выданное японским Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологии.

1. Подготовка клеток

1. Подготовка поли (ethyleneimine)-с покрытием coverslips
   Примечание: Покрытие Poly(ethyleneimine) (PEI) рекомендуется для стекла аппарата, как это позволяет нейронов и астроциты плотно приложить к coverslips, не препятствуя их развития. Однако другие покрытия (например, поли орнитина, поли-L-лизин, Ламинин покрытие) доступны методы также, при необходимости, для стекло дно блюда.
   1. Место coverslip стекла 18 мм в диаметре в каждой скважине 12-ну плиты. Готовят раствор PEI 0,04% (12,5 мл/12-ну плита) с помощью стерилизации воды.
   2. Добавьте 1 мл раствора PEI 0,04% в каждой скважине. Убедитесь, что существует никаких пузырей под coverslips.
   3. Инкубировать пластины в инкубатор CO₂ на ночь при 37 ° C.
   4. Следующий день, мыть с покрытием coverslips 3 x с 1 мл стерилизации воды. Удаление решения Пей с аспиратором, добавьте 1 mL стерилизации воды для каждой скважины и поколебать пластину 12-Ну так что Пей решение между coverslip и пластину можно промыть тщательно. Как оставшиеся PEI токсичны для клеток, убедитесь, что вода после окончательного мыть придыханием полностью.
   5. Сухие и стерилизовать coverslips внутри вытяжки с ультрафиолетового (УФ) света для по крайней мере 15 минут. Пей покрытием блюдо может храниться при температуре 4 ° C на срок до 2 месяцев. Осветить блюда с УФ-излучения для 15 мин непосредственно перед использованием.
   6. Добавьте 5 мл стерильной дистиллированной воды в пространстве между скважин для предотвращения испарения питательной среды.
2. Гальванических линий клетки
   Примечание: Этот протокол обеспечивает лишь один из примеров трансфекции в клетки от линий клеток млекопитающих, таких как НеЬа клетки и клетки COS-7. Пользователи могут применять другие протоколы трансфекции, которые оптимизированы для своих экспериментов. В этом разделе мы опишем протокол культуры клеток HeLa, который также применима к клетки COS-7.
   1. За день до трансфекции культура клетки в культуре блюдо 10 см до тех пор, пока они достигают 70%-90% слияния.
   2. Prewarm питательной среды (см. Таблицу материалы) до 37 ° C.
   3. Вымыть клетки 2 x с фосфат амортизированное saline без Ca^{2 +} и Mg^{2 +} (PBS [-]).
   4. Аспирационная PBS(-), добавляют 1 мл 0,5% раствора трипсина Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и инкубации клеток при 37 ° C 90 s до тех пор, пока они достигают круглой формы.
   5. Добавьте 9 мл подогретую питательной среды, чтобы остановить trypsinization. Разбавьте клетки с питательной среды в соотношении 1:6.
   6. Семя 1 мл разбавленной клеток на ОПЭ покрытием coverslips в 12-ну пластины.
3. Подготовка гиппокампа нейрон экзоцитоз смешанные культуры от крыс и мышей
   Примечание: Секции 1.3 и 1.4 сначала должны быть рассмотрены и одобрены институциональный уход за животными и использовать Комитета и должны следовать официально утвержденными процедурами для ухода и использования лабораторных животных. Блок-схема протокола нейрональных культуры показан на рисунке 2.
   1. Подготовьте все реагенты под капотом ламинарного потока. Средний (DMEM) место Дульбекко модифицированных орла на два 100 мм культуры блюда (примерно 20 мл/блюдо), которые находятся в Набегу.
   2. Подготовка 50 мл рассечение среды состоит из DMEM и 20 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES) (см. Таблицу материалы) и отказаться от среднего в три блюда культуры 60 мм (примерно 7 мл/блюдо) и восемь 35 мм блюда культуры (примерно 2 мл/блюдо). Место блюда в другой Набегу.
   3. Подготовка 50 мл физраствора инкубации, состоящий из Hanks сбалансированного солевого раствора, дополнены 20 мм HEPES (см. Таблицу материалы) и место 8 мл физиологического раствора в 15 мл конические пробки на льду.
   4. Подготовьте покрытия среды с минимальным необходимым среднего (MEM) дополнена B-27, глютамин и пенициллин стрептомицином (см. Таблицу материалы). Сохранить это средство при комнатной температуре (20-28 ° C).
   5. Стерилизуйте хирургические инструменты с 70% этиловом спирте.
   6. Поместите бумажное полотенце в стеклянную банку с крышкой и 1 мл изофлюрановая. Пусть изофлюрановая испариться за 1 мин.
   7. Поместить в банку, подготовленный в соответствии с шагом 1.3.6 беременная крыса или мыши и держать животное в банке до тех пор, пока она находится глубоко под наркозом (около 30 s в 1 мин).
   8. Возьмите наркотизированных животное из опарника и лечить животных и оборудования рассечение, поливая их с 70% этиловом спирте. Вырезать вентральной срединной линии с стандартным рассечения ножницы и щипчики и извлечь матка беременная крыса или мыши.
   9. Экстракт зародышей E18 – 19 из матки наркотизированных женского пола крыса или мыши, используя тонкие рассечения ножницы и место извлечения эмбрионов с щипцами кольцо в ледяной DMEM в 10 см блюдо для холодной анестезии.
   10. Обезглавить эмбриона с тонкой Рассечение ножницами и голову в ледяной DMEM в 10 см блюдо.
   11. Экстракт мозг от каждого эмбриона с 13 см Изогнутый пинцет Semken и щипцы с тонкой советы. Держите мозга в среде ледяной рассечение в блюдо 60 мм.
   12. Удаление гиппокампах, используя два щипцы с тонкой советы, в среде ледяной рассечение в 35 мм блюда и поддерживать изолированных ткани в солевых инкубации, помещены в 15 мл конические пробки на льду.
   13. Вымойте гиппокампах с инкубации физиологического раствора и проинкубируйте с трипсина (1,25 мг/мл) и DNase I (0,25 мг/мл) в инкубации физиологического раствора для 5 минут при 37 ° C. Рекомендуется инкубации объем составляет 2,7 мл физраствора инкубации, 150 мкл 20 x запасов трипсина и 150 мкл акций 20 x DNase (см. Таблицу материалы).
   14. Вымойте гиппокампах 3 x с ледяной инкубации физиологического раствора.
   15. Аспирационная инкубации солевой раствор и добавить 1 мл среды покрытия, содержащие DNase I (10 мкл Стоковый раствор; см. Таблицу материалы). Приостановить ткани, дозирования не более 20 x и измерить плотность жизнеспособных клеток, используя счетчик соматических клеток и пробирного Трипановый синий.
   16. Разбавьте гиппокампа клетки к плотности 1,4 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл для крыс и 2,5 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл для мышей. Семян 1 мл разбавленной клеточных суспензий на ОПЭ покрытием coverslips в 12-ну культуры пластин.
   17. Сохранить клетки при 37 ° C в СО2-инкубатор для 2-3 дней.
   18. Удалите средство покрытия. Не дайте высохнуть клетки. Аккуратно и быстро добавлять подогретую обслуживания средней (см. Таблицу материалы).
4. Подготовка крыса корковых нейронов экзоцитоз смешанные культуры и замороженных клеток и возрождение замороженных культур
   Примечание: Метод криоконсервирования корковых клеток был описан previously11. Здесь приводится измененный Протокол, в котором корковых клеток может храниться при температуре-80 ° C для по крайней мере 3 месяцев. Блок-схема для этого протокола будет показано на рисунке 2.
   1. Подготовьте DMEM, рассечение среднего, солевых инкубации и обшивка среднего, как указано в 1.3.1–1.3.4 шаги и Таблица материалов.
   2. Подготовьте мыть среды, представляет собой DMEM, тепло инактивированная плода бычьим сывороточным и пенициллин стрептомицином (см. Таблицу материалы), при необходимости.
   3. Экстракт зародышей E18 – 19 из матки наркотизированных женского пола крыса или мыши, используя тонкие Рассечение ножницами и использовать кольцо щипцы для размещения каждой извлеченной эмбриона в ледяной DMEM для холодной анестезии.
   4. Удаление мозги из эмбрионов и держать их в ледяной рассечение среде. Удаление кор и поддерживать их в солевых инкубации, помещены в 15 мл конические пробки на льду.
   5. Вымойте кор с инкубации физиологического раствора и инкубировать кор с трипсина (1,25 мг/мл) и DNase I (0,25 мг/мл) в инкубации физиологического раствора для 5 минут при 37 ° C. Рекомендуется инкубации объем для 12 Кор-5.4 мл физраствора инкубации, 300 мкл 20 x запасов трипсина и 300 мкл акций 20 x DNase I.
   6. Вымойте Кор 3 x с ледяной инкубации физиологического раствора.
   7. Удалить супернатант и добавить 2 мл обшивка среднего дополнены с 150 мкл DNase складе. Разбить ячейки, закупорить менее 20 ударов и отфильтровать ячейки с помощью стрейнер ячейки с порами размером 70 мкм.
   8. Вымойте клетки ситечко с 20 мл среды, покрытие для обшивки. Для приготовления замороженных клеток складе, вымыть клетки с 20 мл среды, мыть (см. Таблицу материалы)
   9. Измерьте плотность жизнеспособных клеток, используя счетчик соматических клеток и метод Трипановый синий.
   10. Разбавить корковых клеток к плотности 1,4 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл с напылением среднего и добавьте 1 мл суспензии клеток разреженных Пей покрытием coverslips в 12-ну культуры пластин.
   11. Сохранить клетки при 37 ° C в инкубатор CO₂ на 2-3 дней и изменить питательной среды для обслуживания среды.
   12. После шага 1.4.9 готовить замороженные корковых клеток фондовой центрифугированием клетки на 187 x g на 3 мин, с использованием swing ротора.
   13. Аспирационная супернатант и добавьте криоконсервирования среднего (см. Таблицу материалы) хранится при температуре 4 ° C, для получения клеток плотность составляет 1 x 10-⁷ кл/мл. Аликвота 1 мл суспензии клеток в криогенных трубы.
   14. Поместите трубки в ячейку замораживания контейнер с частотой замораживания-1 ° C/мин., пока не будет достигнута температура-80 ° C и передавать морозильник-80 ° C заморозки контейнера. Клетки могут храниться в течение по крайней мере 3 месяцев при температуре-80 ° C.
   15. Чтобы оживить замороженный клетки, prewarm мыть среднего (примерно 13 мл для каждой криогенных трубы) и обслуживания среды для замороженных корковых клеток (см. Таблицу материалы).
   16. Разморозить замороженные клетки быстро при 37 ° C на водяной бане.
   17. Разбавьте талой клеток нежно с подогретую мыть среднего. Центрифуга клетки на 187 x g на 3 мин, с использованием swing ротора.
   18. Приостановить гранулы в 1 мл среды мыть и измерить плотность жизнеспособных клеток.
   19. Разбавьте клетки с среднего обслуживания для замороженных корковых клеток приносить плотность клеток 3,0 x 10⁵ жизнеспособных клеток/мл и семена 1 мл суспензии клеток в Пей покрытием 12-ну пластины.

2. выражение мембраны целевой GECIs

1. Transfection клеток
   1. Добавить 250 нг ГЕЧИ плазмида (то есть, Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 или ООР-GCaMP6f с ЦМВ промоутер)^7,8,9 до 100 мкл сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) в колодец. Для cotransfection Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f, использование 250 нг каждого плазмида в 100 мкл сокращение сыворотке среды в каждой скважине.
   2. 0.5 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) в колодец в средних смесь плазмида сокращение сыворотке. Для cotransfection Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f добавьте 0,5 мкл Реагента трансфекции за хорошо.
   3. Инкубируйте смесь для 30 мин при комнатной температуре (20-28 ° C).
   4. Добавьте 100 мкл смеси для каждого coverslip в drop-wise манере.
   5. Инкубируйте клетки для 48-72 ч в инкубатор CO₂ при 37 ° C разрешить выражение GECIs.
2. Трансфекция и аденоассоциированный вирус гиппокампа или корковых нейронов
   Примечание: Трансфекция для 3-5 дней в пробирке (DIV) приводит к трансфекции показатель для нейронов. Трансфекция на 6 – 8 DIV является предпочтительным для оптимального выражение GECIs в астроциты. Для выражения GECIs в культуре диссоциированных нейронов после 9 DIV инфекции векторов аденоассоциированный вирус (AAV) обеспечивает лучшую эффективность выражения. Векторы AAV для выражения Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f под EF1a, промоутеров были подготовлены, как описано ранее, с помощью HEK293 клетки¹² (см. Таблицу материалы).
   1. Для transfection 3-8 дней после покрытия лейбл две трубы, один для плазмида ДНК и другой для transfection реагента.
   2. Добавьте 50 мкл сокращение сыворотке среды (см. Таблицу материалы) за хорошо к каждой трубе.
   3. Добавьте 0,5 мкг плазмидной ДНК в coverslip и 1 мкл дополнения в сопровождении трансфекции реагент для нейронов (см. Таблицу материалы) за хорошо плазмида ДНК трубки. Для cotransfection Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f 0,5 мкг каждая плазмиды и 1 мкл дополнения смешиваются в 50 мкл сокращение сыворотке среднего за хорошо.
   4. 1 мкл Реагента трансфекции (см. Таблицу материалы) за хорошо в трансфекции реагент трубки. То же самое количество реагента transfection используется для cotransfection.
   5. Вихревой обе трубки для 1-2 секунд.
   6. Добавьте смесь трансфекции реагента (из шага 2.2.4) в ДНК смесь (из шага 2.2.3). Смешайте нежно закупорить и инкубировать смесь (100 мкл в coverslip) за 5 мин при комнатной температуре.
   7. Загрузите эту смесь на клетки в drop-wise манере.
   8. Инкубируйте клетки в инкубатор CO₂ на 2-3 дня до тех пор, пока белки маркер выражаются.
   9. Для AAV инфекции мкл 3 AAV за хорошо смешанных нейрон экзоцитоз культуры. Смешайте нежно покачиваясь на блюдо. Для двойной инфекции Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f 3 мкл каждого AAV вводится в колодец. В случае, если количество клеток, выражая GECIs недостаточно, следует определить оптимальный объем AAV для инфекции.
   10. Поддерживать культуру для 1 – 2 недели до тех пор, пока выражаются в GECIs.

3. Ca^{2 +} изображения

1. Одновременные снимки клеток, выражая Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f
   Примечание: Чтобы одновременно записывать требуются Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f сигналов, разделение изображений оптика. Оптика включить разделение RCaMP2 и GCaMP6f и их проекции на тот же кадр фотографические камеры (рис. 3A). Одновременных изображений также требует источники (1) света, которые могут одновременно испускают возбуждения света в синий (450-490 Нм) и спектры Грин (500 – 560 Нм), фильтр (2)-Двухленточная и дихроичное зеркало устанавливает в Микроскоп, и (3) выбросов фильтры для RCaMP2 и GCaMP6f. Для подробной информации обратитесь к Таблице материалов.
   1. Включите устройства обработки изображений и компьютеры по крайней мере 30 минут до записи. Prewarm Микроскоп, Отопление камеры до 37 ° C. Настроить образ расщепление устройства, фильтры и источник света. Выравнивание изображения расщепление Оптика, так, что же поле зрения появляется на камеру. Выберите соответствующий объектива (см. Таблицу материалы).
   2. Гора coverslip, содержащие клетки transfected с Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в камере записи, добавьте соответствующие изображений среднего или буфера (400 мкл для 18 мм coverslips) в палате и поместите его на сцене микроскопа. Поместите крышку на запись камеры чтобы избежать испарения среды.
   3. Поиск ячеек, выражая Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f флуоресцентных изображений. Минимизируйте возбуждение интенсивности света для предотвращения Фотообесцвечивание и Фототоксичность.
   4. Снимите крышку и начать запись отснятого на 10 Гц. Во время этой записи, добавьте агониста в палату вызвать Ca^{2 +} ответы (например, гистамин для клеток HeLa, СПС для клетки COS-7).
   5. Сохраните данные промежуток времени в жесткий диск (HDD).
   6. Анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
2. Запись спонтанной деятельности астроциты, выражая Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f
   Примечание: Без разделения изображений оптика Ca^{2 +} сигналов на плазматической мембраны и тех, кто вокруг ER может контролироваться в той же ячейке. Здесь описывается последовательной записи Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в том же астроциты. Цель нефти погружения с числовой апертуры, больше, чем 1.3 настоятельно рекомендуется для спонтанной Ca^{2 +} активности.
   1. Включите Микроскоп, камеры, источник света и нагрева Микроскоп камеры по крайней мере 30 минут до начала записи.
   2. Маунт coverslip, содержащие клетки transfected с Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в зале звукозаписи и 400 мкл изображений среды. Поместите крышку на верхней части камеры.
   3. Выберите фильтр для GCaMP6f и источника света (синий свет возбуждения, например 470– 490 Нм; см. Таблицу материалы). Найдите астроциты, выражая ООР-GCaMP6f.
   4. Выберите набор фильтров и источником света для RCaMP2 (зеленый свет возбуждения, например, 510 – 560 Нм; см. Таблицу материалы) и подтвердите ли Lck-RCaMP2 выражается в том же астроциты. Избегайте длительного воздействия источника света для предотвращения Фотообесцвечивание.
   5. Запись отснятого изображения Lck-RCaMP2 в 2 Гц на 2 мин сохранить визуализации данных на жестком диске.
   6. Измените фильтр установить это для GCaMP6f. Запись отснятого изображения ООР-GCaMP6f в том же поле зрения, в 2 Гц в течение 2 мин сохранить данные на жестком диске.
   7. Анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа изображения.
3. Запись спонтанной активности нейронов и индуцированных Ca^{2 +} высота в нейроны
   Примечание: Микроскоп установки для нейронов изображений является таким же, как описано в разделе 3.2. Здесь описан изображений спонтанное Ca^{2 +} высота благодаря Lck-GCaMP6f и Ca^{2 +} высота индуцированных mGluR активации вследствие ООР-GCaMP6f.
   1. Для записи спонтанной активности нейронов, Маунт coverslip, содержащие клетки, выражая Lck-GCaMP6f в зале звукозаписи и 400 мкл изображений среднего. Поместите крышку на верхней части камеры.
   2. Установите фильтр и источника света (синий возбуждения, например 470 – 790 нм; см. Таблицу материалы) для тех, для GCaMP6f. Найти нейронов, выражая Lck-GCaMP6f и спонтанной активности.
   3. Получение изображений частотой 2 Гц или выше. Сохраните данные на жестком диске.
   4. Анализировать данные с помощью программного обеспечения для анализа изображения.
   5. Чтобы записать индуцированных Ca^{2 +} высота, Маунт coverslips, содержащие клетки, выражая ООР-GCaMP6f с 400 мкл изображений среднего. Поместите крышку на верхней части камеры.
   6. С помощью фильтра для GCaMP6f, найти нейронов, выражая ООР-GCaMP6f.
   7. Снимите крышку. Начало покадровой записи частотой 2 Гц или выше. Во время записи, добавьте агонисты для Gq белка сочетании рецепторов (например, mGluR5 агонист [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [ДХПГ]) вызывают Ca^{2 +} освобождение от ER.
   8. Сохранить покадровой изображения на жестком диске и анализировать данные.

Representative Results

LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f были выражены в клетки HeLa, и оба сигналы были записаны одновременно, используя изображение расщепление Оптика, 24 ч после трансфекции (Рисунок 3А и 1 видео). Изображения были приобретены в 10 Гц. гистамина (его, 1 мкм), который индуцирует Ca^{2 +} освобождение от ER, был добавлен во время записи. По его заявлению увеличить интенсивность сигнала Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f, как показано в псевдоцветном отображение ΔF/F0, который представляет изменение от первоначального флуоресценции интенсивности (рис. 3B). Время курсы Ca^{2 +} высота (ΔF/F0) сообщил Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f были сопоставлены в том же регионе интереса (ROI) (рис. 3 c). ΔF/F0 значения были нормализованы к их максимальные значения для включения времени курс сравнение между двумя различными GECIs, которые имеют различные выражения уровня и распределения. Оба датчика сообщили Ca^{2 +} высоте колебаний как. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f показал тот же курс время для Ca^{2 +} высота в двух клетках среди типов пяти клеток изучены (рис. 3 c, ROI 1 и 3). Однако Ca^{2 +} фасады, проявленная Lck-RCaMP2 оставалась на более высоком уровне, по сравнению с проявленной ООР-GCaMP6f (рис. 3 C, ROI, 2, 4 и 5). Результаты показывают, что Ca^{2 +} высота затягивается вблизи плазматической мембраны, в то время как он завершается раньше вокруг ER, который является источником этого Ca^{2 +} сигнала, вызванных его стимуляции.

Спонтанное Ca^{2 +} сигналы от астроциты в нейрон экзоцитоз смешанной культуре от крыс гиппокампах (Рисунок 4A) и Кор (рис. 4B) были продемонстрированы Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f (рис. 4, 2 видео видео 3 , 4и 5 видео). Корковых культур были возрождены из замороженных запас, который был подготовлен, как описано в настоящем Протоколе. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f сигналов последовательно были записаны на 2 Гц от тех же ячейках. В районе, который показал Ca^{2 +} высота каждой ГЕЧИ были отобраны три ROIs, и время курс ΔF/F_базы (т.е., интенсивность флуоресценции) изменен с интенсивность средняя флуоресценции в период всей записи (F_база ). Когда базовые флуоресценции является стабильным и Ca^{2 +} высотах менее часты, F_{базовый} становится полезным базовых обнаружить Ca^{2 +} высота события. Спонтанное Ca^{2 +} фасады были видны только в рамках Астроцитарная процесса, а не в клетки тела. Этот результат согласуется с предыдущими докладами по Астроцитарная спонтанные Ca^{2 +} сигналы других GECIs визуализация в пробирке¹³ и в естественных условиях¹⁴. В гиппокампе и корковые астроциты Ca^{2 +} фасады, проявленная Lck-RCaMP2 (вверху) были более частыми, чем те показали ООР-GCaMP6f. Этот результат согласуется с нашей предыдущей демонстрации, что Ca^{2 +} фасады в астроциты благодаря Lck-GCaMP6f обнаружены чаще, чем те из-за ООР-GCaMP6f⁷ и свидетельствует о том, что это понятие распространяется также на Одноместный клеточном уровне.

Спонтанное Ca^{2 +} фасады по Lck-GCaMP6f в незрелых крыса гиппокампа нейронов (10 DIV) были замечены в 2 Гц (рис. 5А и 6 видео). Время курсы ΔF/F0 в пяти различных ROIs предполагают, что эти Ca^{2 +} фасады локально ограничиваются субцеллюлярные доменов. Рисунок 5B (7 видео) показывает Ca^{2 +} ответы в зрелых мыши гиппокампа нейронов (30 DIV) инфицированных векторы AAV ООР-GCaMP6f-выражение. Нейроны были стимулируется с 100 мкм ДХПГ, который является агонистом рецепторов глутамата Метаботропные, вызывая Ca^{2 +} выпуска. Был обнаружен ДХПГ индуцированной Ca^{2 +} выпуска ООР-GCaMP6f.

Рис 1: диаграмма, показывающая мембраны ориентированных GECIs. Принципиальная схема ориентированные на плазматической мембране GECIs (Lck-GCaMP6f и Lck-RCaMP2) и внешняя ER мембраны целевой GCaMP6f (ООР-GCaMP6f).

Рисунок 2: схема для подготовки гиппокампа и корковых клеток, плазмида transfection и инфекции AAV. Микроскопических изображений являются представительными, свежезаваренным покрытием DIV-6 корковых клеток (слева) и возродил клетки из замороженных запасов (справа). Шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3: пример одновременные снимки Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в клетки HeLa. (A) схематическое представление разделения сигнала изображения расщепление оптикой. Же поле зрения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f одновременно проецируется на камеру. В видео 1представитель записи, приобретенные на 10 Гц CMOS камера, и один кадр этой записи отображается в панели A (справа). (B) псевдо-цветных изображений ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (вверху) и ООР-GCaMP6f (внизу). Гистамин (его, 1 мкм) был добавлен на 0 с. (C) представитель нормированное время ΔF/F0 курс Lck-GCaMP2 (пурпурный) и ООР-GCaMP6f (зеленый). Данные были нормализованы максимальное значение ΔF/F0 для каждого участка. Серые линии показывают сроков его применения. Данные были проанализированы с программного обеспечения TI Workbench¹⁵. Шкалы бар = 50 мкм (микроскопических изображений).  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4: Спонтанное Ca^{2 +} высота в астроциты, мониторинг для выражения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f. (A) представитель гиппокампа и (B) корковых астроциты transfected с Lck-RCaMP2 (вверху) и ООР-GCaMP6f (внизу). Корковых клеток были возрождены из замороженных запасов культур. LCK-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f изображения последовательно были приобретены в той же ячейке, 2 Гц, с Эм-ПЗС-камеры. Участки на левой шоу время курсы ΔF/Fbase, измеряемая в ROIs указывается в микроскопических изображений. Данные были проанализированы с TI Workbench. В 2 видео, видео 3, видео 4и 5 видеопредоставляются фактические фильмы. В баре шкалы = 20 мкм (микроскопических изображений). Базовые дрейф предлагает изменения в глобальном Ca^{2 +} уровне в ячейке.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5: Примеры Ca^{2 +} изображений в нейронах с Lck-GCaMP6f и ООР-GCaMP6f. (A) представитель крыса гиппокампа нейронов, выражая Lck-GCaMP6f на 10 DIV (слева) и участки, указанием времени курсы ΔF/F0 измеряется в ROI (желтые круги) были указаны в изображении (справа). Номера в курсе времени соответствуют номерам ROI в изображении. Обратите внимание, что временная модель Ca^{2 +} высота отличается между различными регионами интереса. Базовые дрейф предполагает увеличение уровня глобальной Ca^{2 +} в этот нейрон. (B) пример зрелых мыши гиппокампа нейронов (DIV 30) инфицированных ООР-GCaMP6f выражение векторы AAV (слева). Время курса участок ΔF/F0 измеряется показывает Ca^{2 +} ответ до 100 мкм (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) применяется на сроки, проявленная на серой панели. Желтые круги показывают положение ROIs где время курс был получен. Изображения были приобретены 2 Гц с охлаждением ПЗС-камеры (группа A) или Эм-CCD камеры (группа B) и проанализированы с TI Workbench. Шкалы бар = 20 мкм (микроскопических изображений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Видео 1: пример одновременного отображения Lck-RCaMP2 и ООР-GCaMP6f в клетки HeLa. Представитель запись приобрела на 10 Гц и представлен на рисунке 3. Шкалы бар = 50 мкм.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 2: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в Lck-RCaMP2 в гиппокампе экзоцитоз. Представитель записи, приобретенные в 2 Гц (рис. 4A), записан в том же поле зрения как 3 видео. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 3: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в ООР-GCaMP6f в гиппокампе экзоцитоз. Представитель запись приобрела в 2 Гц (рис. 4A), в том же поле зрения как 2 видео. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 4: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в Lck-RCaMP2 в корковых экзоцитоз представитель записи, приобретенные в 2 Гц (рис. 4B), записан в том же поле зрения как 5 видео. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 5: Спонтанное Ca^{2 +} переходных наблюдается в ООР-GCaMP6f в корковых экзоцитоз. Представитель запись приобрела в 2 Гц (рис. 4B), в том же поле зрения как 4 видео. В баре шкалы = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 6: Пример Ca^{2 +} изображений в нейрон гиппокампа крысы (DIV 10) по Lck-GCaMP6f. Пример нейрональных Ca^{2 +} сигналы записаны в 2 Гц (рис 5A). Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Видео 7: Ca^{2 +} релиз в мыши гиппокампа нейрон (DIV 30), выражая ООР-GCaMP6f. Пример нейрональных Ca^{2 +} сигналы записаны в мыши гиппокампа нейрон инфицированных ООР-GCaMP6f выражение векторы AAV (Рисунок 5B). Нейрон была простимулирована с 100 мкм dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) применяется на 30 s вызывают Ca^{2 +} освобождение от ER. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Discussion

Разнообразные биологические выходы инициируются Ca^{2 +} сигналов. CA^{2 +} является универсальным внутриклеточных сигнальных messenger. Декодирование Ca^{2 +} сигналы вызывают конкретные мероприятия был фундаментальный вопрос биологического, и Ca^{2 +} методы для описания многообразия Ca^{2 +} сигналов визуализации не требуется. В настоящее время подробный протокол позволяет обнаружение собственный Ca^{2 +} сигналов на плазматической мембраны и ER (рис. 3 и рис. 4) и местные Ca^{2 +} microdomains в ячейку (рис. 4 и 5). Это способствует описания самых различных внутриклеточных Ca^{2 +} сигналов. Временное разрешение Ca^{2 +} сигналов, также была улучшена путем ориентации GECIs в плазматической мембраны и ER, потому что это может избежать эффекта трехмерного диффузии Ca^{2 +} и GECIs себя, и она имеет потенциал, чтобы обнаружить момент Ca^{2 +} приток или Ca^{2 +} релиз, в котором происходит на мембране.

Протокол имеет некоторые ограничения. Пользователи должны иметь в виду, что обнаруженные сигналы являются суммирование «момент Ca^{2 +} приток или освобождения» и «Ca^{2 +} рассеянный от первоначального Ca^{2 +} источника», особенно для больших Ca^{2 +} сигналов. Например хотя его стимуляции клеток HeLa вызывает Ca^{2 +} освобождение от ER, его результирующей Ca^{2 +} сигналы обнаруживаются не только ER-целевой ООР-GCaMP6f, но и плазмы мембраны ориентированные Lck-RCaMP2 (рис. 3). Другое ограничение состоит, что пространственно-временных шаблон Ca^{2 +} сигналов не может быть единственным определяющим фактором вывода Ca^{2 +} сигналов. Распределение по течению эффекторных белков (например Ca^{2 +}-зависимые киназы и фосфатаз) также может быть определяющим фактором². Полностью расшифровать внутриклеточные сигналы Ca^{2 +} , анализ поведения течению фермента, который не рассматривается в настоящем Протоколе, является абсолютно необходимым.

Одним из наиболее важных аспектов для успешного Ca^{2 +} изображений является изображения установки и изображения приобретение условия, а также как другие исследования жить изображений. Ранее мы показали, что Ca^{2 +} ответы в ячейке сильно зависит от продолжительности и интенсивности возбуждения и на условиях приобретения изображений, включая воздействия времени и приобретение частот¹⁶. Мощность освещения возбуждения является самым важным фактором, как это может вызвать токсическое воздействие света и Фотообесцвечивание GECIs. Запись условия время экспозиции, запись частоты, интенсивности света возбуждения и продолжительность записи должны быть оптимизированы согласно цели эксперимента. Мы рекомендуем сократить время экспозиции и возбуждения света, насколько это возможно избежать Фотообесцвечивание и фототоксичности на ячейку. Запись частоты и продолжительности записи должно быть достаточно для покрытия Ca^{2 +} высота события, представляющие интерес, но должны храниться как низкий, как можно избежать Фотообесцвечивание и Фототоксичность также. Мы рекомендуем сначала определить запись частоты и продолжительности и оптимизации интенсивности света и времени экспозиции, чтобы свести к минимуму Фотообесцвечивание GECIs. Еще одним важным фактором является уровень экспрессии GECIs. GECIs у Ca^{2 +}-буферизация эффект, поскольку они Ca^{2 +}-привязка белков. Таким образом гиперэкспрессия GECIs приводит к буферизации Ca^{2 +}, который является физиологически необходимых для клеток. Чтобы избежать визуализации ячеек, выражая большое количество GECIs следует минимизировать количество ГЕЧИ выражения.
 
В заключение рассечение Ca^{2 +} сигналов на субклеточном резолюции является одним из наиболее важных шагов для декодирования внутриклеточных Ca^{2 +} сигналы, которые определяют биологические явления вывода. Этот протокол обеспечивает новый метод для рассечения Ca^{2 +} сигналов для описания многообразия среди этих сигналов. В настоящее время этот метод ограничен для экспериментов в пробирке. Однако уже Lck-GCaMP6f используется для в-vivo Ca^{2 +} изображений в мышей¹⁷, и ООР-GCaMP6f было подтверждено следить Ca^{2 +} сигналов in vivo в VD двигательных нейронов в C. elegans7. Таким образом ориентация GECIs в отсеке субцеллюлярные имеет потенциал, чтобы расширить в естественных условиях изображений в будущем, таким образом благоприятные Ca^{2 +} рассечение в естественных условиях.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)	Tocris	#0342
0.5% DNase I stock solution	Sigma-Aldrich	#11284932001	Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution  supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30 °C.
0.5% Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher Scientific	#25300054
100 mM L-glutamine (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#25030081	Preparing small aliquots of 250-750 µL and store at -30 °C.
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#11360070	Aliquots (10 mL) can be stored at -20 °C. After thawing, the solution can be maintained at 4 °C for 2 months.
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid	Falcon	#353043	Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.
18 mm diameter circular coverslips	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Thickness 1, 18 mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	#15630080	pH 7.2-7.6
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock)	Sigma-Aldrich	#T4674	Prepare 150 µL aliquot and store at -30 °C.
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution	Sigma-Aldrich	#P3143	Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30 °C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.
70% Ethanol			Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter			AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.
B-27 supplement (×50 stock)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6	Japan SLC, Inc.
Camera for microscopic image recording			The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) or  CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Cell freezing container	Sarstedt K.K.	#95.64.253	Alternative cell freezing container can be used.
Cell strainer	Falcon	#352350
CO2 incubator			Maintain at 37 °C, 5% CO2.
Cryogenic tube	Corning	#430661	Alternative cryogenic tubes can be used.
Cryopreservation medium	Zenoaq		"CELLBANKER1"
Culture medium (for HeLa cells)			Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 U/mL and Streptomycin 100 µg/mL)
Dissection medium			One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM
DMEM	Nacalai	#08456-65	Alternative DMEM can be used.
DMEM	Nacalai	#08456-65	Low glucose
DNA transfection reagent	Sigma-Aldrich	#6366244001	"X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used.
Glass jar with a lid			500 mL jar (for mouse) or 1,500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal
HBSS	Thermo Fisher Scientific	#14170161	HBSS free of calcium and magnesium
Heat inactivated bovine serum	Thermo Fisher Scientific	#10100147
HeLa cells	RIKEN BioResource Center	#RCB0007
Histamine	Sigma-Aldrich	#H7125
Image analysis software			Such as Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH), and TI Workbench14 (custom made)
Image splitting optics	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
Image splitting optics dichroic mirror	Semrock	#FF560-FDi01-25×36	For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein  (GFP/RFP) signal
Image splitting optics emission filters	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	For emission of GFP/RFP signal, respectively
Imaging medium and buffer			Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.
Incubation saline			Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS
Inverted fluorescence microscope			Such as IX73 (Olympus) or  Eclipse TI (Nikon Instech)
Isoflurane	Pfizer		Used for anesthesia
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes)			48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution.
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes)			12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution.
MEM (Minimum Essential Medium)	Thermo Fisher Scientific	#11090-081
Microscope filter set for GCaMP6f imaging			Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm)
Microscope filter set for RCaMP2 imaging			Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass)
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f	Semrock	#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25	Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.
Microscope heating system			A heating system to maintain cells at 37 °C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.
Microscope light source for excitation			Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.
Microscope objective lens			Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.
Neurobasal plus medium	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Neurobasal-A Medium	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+	Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation	#164-23551	The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.
PC and image acquisition software			Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	#15140122	Penicillin 10,000 U/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9			Available upon request
Plating medium (for 4 × 12 well dishes)			48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 U/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of  the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.
Recording chamber	Elveflow	Ludin Chamber	This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.
Reduced serum media	Thermo Fisher	#11058021	Opti-MEM
Stereomicroscope			Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.
Surgical instruments			Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13 cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,  3 forceps with fine tips  (Dumont Inox #5)
Transfection reagent for neuron	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	"Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4.
Trypan blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	#15250061
Wash medium for frozen cortical cells			25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin.
Wistar rats	Japan SLC, Inc		Pregnant rats (E18)