膜靶向 ca 2 + 指标对培养细胞中局部 Ca^{2 +}信号的解剖

Summary

在这里, 我们提出了一个协议 ca^{2 +}成像在神经元和胶质细胞, 使 ca^{2 +}信号的解剖在亚细胞分辨率。此过程适用于允许表达基因编码的 ca^{2 +}指标的所有细胞类型。

Abstract

钙离子 (Ca^{2 +}) 是一种通用的细胞内信使分子, 它驱动多种信号通路, 从而产生不同的生物输出。两个 Ca^{2 +}信号源的协调--细胞外的 "ca^{2 +}流入" 和细胞内 ca2 + 存储内质网 (Er) 的 "ca^{2 +}释放"--被认为是 ca 的不同时空模式的基础^{2 +}信号, 导致细胞中的多种生物功能。该协议的目的是描述一种新的 Ca^{2 +}成像方法, 该方法能够监视 "ca^{2 +}流入" 和 "ca^{2 +}释放" 的时刻。Oer-gcmp6f 是一种基因编码的 Ca^{2 +}指示器 (geci), 由 GCaMP6f 组成, 针对 er 外膜。Oer-gmp6f 可以以比传统 Gmp6f 更高的时间分辨率监测 Ca^{2 +}释放。结合等离子体膜靶向 GECIs, 时空 Ca^{2 +}信号模式可以描述为亚细胞分辨率。这里描述的亚细胞靶向 ca^{2 +}指标原则上适用于所有细胞类型, 甚至适用于线虫神经元的体内成像. 在这个协议中, 我们介绍 ca^{2 +}成像细胞从细胞系, 神经元, 和胶质细胞在离解的原代培养, 并描述了大鼠皮质神经元冻结存量的制备。

Introduction

Ca^{2 +}信号表示细胞内 ca^{2 +}浓度的升高。Ca^{2 +}是真核细胞的通用第二信使。使用 Ca^{2 +}, 细胞通过不同的细胞内信号通路发挥作用, 并诱导各种生物输出。例如, 在神经元中, 突触前末端的突触囊泡释放、细胞核中的基因表达以及突触后突触突触的突触可塑性诱导都受到不同的 Ca^{2 +}信号的调节, 这些信号精确地激活了适当的信号。下游酶在正确的地点和精确的时间¹。

Ca^{2 +}信号的特定时空模式激活特定的下游酶。Ca^{2 +}信号是由两个不同的 ca2⁺源之间的协调产生的: ca^{2 +}来自细胞外空间的流入和来自内质网 (er) 的 ca^{2 +}释放, 后者作为细胞内 ca^{2 +}店。在质膜或 ER 膜2上产生的 10–100μm^{ca 2 +}纳米值 2 + 也支持了诱导特定细胞功能的有意义的时空 ca 2⁺信号模式. 重要的是, Ca^{2 +}信号的来源是决定下游生物输出的最关键因素之一。在神经元中, Ca^{2 +}流入和 ca^{2 +}释放对 gabaep 突触下的γ-氨基丁酸 (gaba) a 受体 (gaba a r) 的聚集有相反的影响, 这对其进行抑制.神经元兴奋性³。Ca^{2 +}流入伴随着巨大的神经元兴奋, 导致突触 gaba_ar 簇的分散, 而来自 er 的持续性 ca^{2 +}释放促进突触 gaba r 的聚类.其他研究小组也报告说, 生长锥的调谐方向在很大程度上取决于 Ca^{2 +}信号的来源: ca^{2 +}流入会引起排斥, 而 ca2⁺释放则引导神经元生长的吸引力圆锥⁴。因此, 要充分理解 ca^{2 +}信号通路背后的特定细胞输出, 重要的是通过描述 ca^{2 +}信号的来源在亚细胞分辨率。

在该协议中, 我们描述了一种 Ca^{2 +}成像方法, 用于以亚蜂窝分辨率报告 ca^{2 +}信号, 该方法允许估计 ca^{2 +}信号源 (图 1)。通过在 Src 内连接等离子体膜定位信号 Lck, 基因编码的 Ca^{2 +}指标 (gec) 对质膜下的 ca 2⁺微域进行了成功的监测。激酶^{到 GECIs 5}的 n-终止。为了以更好的空间和时间分辨率检测 er 附近的 Ca^{2 +}信号模式, 我们最近开发了 Oer-gmmmp6f, 其中 GCaMP6f⁶使用 er 跨膜蛋白瞄准 er 外膜。Oer-gcmp6 可以通过避免 Ca 2 + 和 GECI 的扩散, 以比传统的非目标 Gmp6f 更好的时空分辨率敏感地报告 er 中的 Ca^{2 +}释放 .我们还证实, Oer-gmpmp6f 报告的培养海马星形胶质细胞的自发钙 2⁺升高与血浆膜靶向 gcmp6f (Lck-gmp6f) 监测的时空模式^{不同。 9},^表明ca^{2 +}成像与 oer-gmpmp6f 结合 lck-gmpmp6f 有助于解剖 ca 2⁺信号在亚细胞分辨率, 以确定其来源。

目前, 我们详细介绍了在 HeLa 细胞和神经星形胶质混合培养中的 Ca^{2 +}信号解剖的协议, 并将其涂在玻璃覆盖片上。此处所示的 GECIs^{ca 2 +}成像技术, Lck-gmpmp6f、等离子体膜靶向 rmmp2¹⁰ (LCC-RMPMP2) 和 Oer-gmcmp6f (图 1) 适用于所有可以表达 gecis 的细胞。

Protocol

根据日本教育、文化、体育、科学和技术部发布的指导意见, 这里描述的所有实验都得到了 RIKEN 安全委员会和动物实验委员会的批准。

1. 细胞的制备

1. 聚乙二醇涂覆盖板的制备
   请注意:建议玻璃设备使用聚 (乙基烯胺) (PEI) 涂层, 因为它允许神经元和星形胶质细胞紧密地附着在盖板上, 而不会阻止它们的发育。但是, 其他涂层方法 (例如, 多鸟氨酸、聚 l-赖氨酸、层压蛋白涂层) 也可在必要时用于玻璃底部的菜肴。
   1. 在12井板的每口井中放置一个直径18毫米的玻璃覆盖物。使用灭菌水制备 0.04% pei 溶液 (12.5 mll 12 孔板)。
   2. 在每口井加入1毫升 0.04% pei 溶液。确保盖板下没有气泡。
   3. 在37°c 条件下, 将板材在二氧化碳孵化器中孵育一夜。
   4. 第二天, 用1毫升的消毒水清洗涂层盖板3x。用吸尘器取出 PEI 溶液, 在每口井中加入1毫升灭菌水, 并摇晃12井板, 使盖板与板之间的 PEI 溶液被彻底冲走。由于剩余的 PEI 对细胞有毒, 请确保最后清洗后的水被完全吸气。
   5. 用紫外线 (UV) 光对引擎盖内的盖板进行干燥和消毒, 时间至少为15分钟。爱德华王子岛涂层盘可在4°c 下存放长达2个月。使用前, 用紫外线照射餐具15分钟。
   6. 在井间的空间内加入5毫升无菌蒸馏水, 防止培养基蒸发。
2. 电镀细胞系
   请注意:该协议仅提供了一个从哺乳动物细胞系转染细胞的例子, 如 HeLa 细胞和 COS-7 细胞。用户可以应用针对其实验进行优化的其他转染协议。在本节中, 我们将描述 HeLa 细胞培养协议, 它也适用于 COS-7 细胞。
   1. 在转染前一天, 在10厘米的培养皿中培养细胞, 直到它们达到 70%-90% 的融合。
   2. 将培养基预热至 37°c (见材料表)。
   3. 用没有钙 2⁺和 mg^{2 +} (pbs [-]) 的磷酸盐缓冲盐水清洗细胞2倍。
   4. 吸入 PBS (-), 加入0.5% 色氨酸-乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液的1毫升, 在37°c 孵育细胞 90度, 直到它们达到圆形。
   5. 加入9毫升预热培养基, 以阻止胰蛋白酶化。以1:6 的比例稀释培养基的细胞。
   6. 种子1毫升的稀释细胞在 pei 涂层盖板在12孔板。
3. 大鼠或小鼠海马神经元星形胶质细胞混合培养的制备
   请注意:第1.3 节和第1.4条必须首先由机构动物护理和使用委员会审查和批准, 并且必须遵循官方批准的实验室动物护理和使用程序。神经元培养协议的流程图如图 2所示。
   1. 准备层流罩下的所有试剂。将杜尔贝克改装后的鹰的培养基 (DMEM) 放入两个100毫米的养殖菜肴 (约 20 Ml/), 在一个冰箱里。
   2. 制备由 DMEM 和 20 mM 4-(2-羟乙基)-1-吡嗪磺酸 (hepes) (见材料表) 组成的解剖介质的50毫升, 并将该介质放入 3个60毫米培养皿 (约 7 mll) 和 8 35 毫米养殖菜肴 (约 2 mll)。把盘子放在另一个冰箱里。
   3. 准备50毫升的孵育盐水, 由汉克斯的平衡盐溶液组成, 辅以 20 mM Hepes (见材料表), 并将8毫升的盐水放置在一个15毫升的锥形管在冰上。
   4. 用最低必要介质 (MEM) 准备电镀介质, 辅以 B-27、谷氨酰胺和青霉素链霉素 (见材料表)。在室温 (20–28°c) 下保持此介质。
   5. 用70% 乙醇消毒手术器械。
   6. 将纸巾放入一个有盖子和1毫升异氟醚的玻璃瓶中。让异氟醚蒸发1分钟。
   7. 将怀孕的老鼠或小鼠放入根据步骤1.3.6 准备的罐子中, 并将动物保留在罐子中, 直到其被深度麻醉 (约30秒至 1分钟)。
   8. 将麻醉后的动物从罐子里取出, 用70% 的乙醇喷洒, 对动物和解剖设备进行消毒。用标准的解剖剪刀和推子切割腹侧中线, 并从怀孕的大鼠或小鼠身上提取子宫。
   9. 从麻醉的雌性大鼠或小鼠的子宫中提取 E18–19胚胎, 使用精致的解剖剪刀, 并将提取的胚胎与环钳放入冰凉 DMEM 中, 放入10厘米的麻醉盘中。
   10. 用精细的解剖剪刀将胚胎斩首, 并将头部放入冰凉的 DMEM 中10厘米的盘子中。
   11. 用13厘米弯曲的 Semken 钳子和带有细尖的钳子从每个胚胎中提取大脑。将大脑放在60毫米的盘子里的冰凉解剖介质中。
   12. 在35毫米的盘子中, 用两个带细尖的钳子取出海马体, 并将孤立的组织保存在放置在冰上15毫升锥形管中的培养盐水中。
   13. 用孵育盐水清洗海马, 用胰蛋白酶 (1.25 Mg/ml) 和 DNase i (0.25 Mg/ml) 在孵育盐水中孵育5分钟。推荐的孵育量为培养盐水的2.7 毫升、20x 的 20x-trypsin 150μl 和20x 库存 DNase 的 150Μl (见材料表)。
   14. 用冰凉的孵育盐水清洗海马3x。
   15. 吸入培养盐水, 加入含有 DNase i (10μl 的库存溶液; 见材料表) 的电镀介质1毫升。通过移液次数不超过20x 的时间将组织挂起, 并使用细胞计数器和 Trypan 蓝色检测方法测量活细胞的密度。
   16. 将海马细胞稀释到大鼠 1.4 x¹⁰ 5 活细胞的密度, 小鼠 2.5 x 10 5 活细胞的密度.种子1毫升的稀释细胞悬浮液到 pei 涂层覆盖物在12孔培养板上。
   17. 将细胞在37°c 的 CO2 孵化器中保持2-3天。
   18. 取出电镀介质。不要让细胞干涸。轻轻快速地添加预热的维护介质 (参见材料表)。
4. 大鼠皮质神经元-星形胶质细胞混合培养和冷冻细胞的制备及冷冻培养的恢复
   请注意:介绍了一种皮质细胞的冷冻保存方法。在这里, 提供了一个修改后的协议, 其中皮质细胞可以存储在-80°c 至少3个月。此协议的流程图如图 2所示。
   1. 准备 DMEM、解剖培养基、培养盐水和电镀培养基, 如步骤 1.3.1 1.3.4 和材料表所示。
   2. 如有必要, 准备由 DMEM、热灭活的胎儿牛血清和青霉素-链霉素 (见材料表) 组成的洗涤介质。
   3. 从麻醉的雌性大鼠或小鼠的子宫中提取 E18–19胚胎, 使用精致的解剖剪刀, 并使用环钳将每个提取的胚胎放入冰冷的 DMEM 中进行冷麻醉。
   4. 从胚胎中取出大脑, 并将其保存在冰冷的解剖介质中。取下皮质, 并将其保存在盐层中放置在冰上15毫升的锥形管中。
   5. 用孵育盐水清洗皮质, 用胰蛋白酶 (1.25 Mg/ml) 和 DNase i (0.25 Mg/ml) 在37°c 孵育盐水中孵育皮质5分钟。12个皮质的推荐孵育量为培养盐水5.4 毫升, 20x 股票胰蛋白酶300Μl 和20x 库存 DNase i 300Μl。
   6. 用冰凉的盐水清洗3x 的皮质。
   7. 去除上清液, 加入2毫升的电镀介质, 辅以150μl 的 DNase i 库存。通过移液少于20次的方式将细胞分离, 并使用孔径为70微米的细胞过滤器对细胞进行过滤。
   8. 用20毫升的电镀介质清洗电池过滤器, 用于电镀。对于冷冻细胞库存的制备, 请使用20毫升的洗涤介质清洗细胞 (见材料表)
   9. 使用细胞计数器和 Trypan blue 方法测量活细胞的密度。
   10. 用电镀介质将皮质细胞稀释到 1.4 x 10 5 活细胞的密度, 并在12井培养板的 pei 涂层盖板中加入1毫升的稀释细胞悬浮液。
   11. 将细胞_在37°c 的 co2 孵化器中保持 2-3天, 并将培养基改为维持介质。
   12. 1.4.9 步骤后, 使用摆动转子, 将 187 x g的细胞离心 3分钟, 制备冷冻皮质细胞。
   13. 吸入上清液, 加入保存在4°c 的冷冻保存介质 (见材料表), 获得 1 x 10^{7 细胞}密度。将细胞悬浮液注入低温管中。
   14. 将试管放入冷冻率为-1°cmmin 的电池冷冻容器中, 直至达到-80°c 的温度, 并将冷冻容器转移到-80°c 的冰柜中。细胞可在-80°c 下储存至少3个月。
   15. 为了恢复冷冻细胞, 对洗涤介质 (每个低温管大约13毫升) 和冷冻皮质细胞的维护介质进行预热 (见材料表)。
   16. 在37°c 的水浴中快速解冻冷冻细胞。
   17. 用预热洗涤介质轻轻稀释解冻的细胞。用摆动转子以 187 x g 离心细胞3分钟。
   18. 将颗粒悬浮在洗涤介质的1毫升中, 测量活细胞密度。
   19. 用冷冻皮质细胞的维持介质稀释细胞, 产生 3.0 x^{10 5}活细胞的细胞密度, 并在 pei 涂层的12孔板中种子1毫升的细胞悬浮液。

2. 膜目标 Geci 的表达

1. 细胞转染
   1. 加入250纳克的 GECI 质粒 (即 Lck-gmp6f、Lck-rmcmp2 或 Oer-gmcmp6f 与 CMV 启动子)^{7, 8, 9}至100μl 的减少血清培养基 (见材料表)。对于 Lcc-rmcmp2 和 OER-GMP6 的共转染, 在每口井100Μl 的减少血清中使用每个质粒的 250 ng。
   2. 每井在血浆还原血清培养基混合物中加入0.5 微米转染试剂 (见材料表)。对于 Lcc-rmp2 和 Oer-gmp6f 的协同转染, 每口加入0.5Μl 转染试剂。
   3. 在室温 (20–28°c) 下将混合物生也就是30分钟。
   4. 以一种下降的方式将100μl 的混合物添加到每个盖板上。
   5. 在37°c 的二氧化碳孵化器中孵育细胞 48-72小时 , 以实现 geci 的表达。
2. 海马或皮质神经元的转染和腺病毒感染
   请注意:体外转染 3-5天 (DIV) 可提高神经元的转染率。在 6-8 DIV 的转染是首选的 Geci 在星形胶质细胞中的最佳表达。对于 9 DIV 后在离解培养神经元中 Geci 的表达, 腺病毒相关病毒 (AAV) 载体的感染提供了较好的表达效果。如前所述, 使用 HEK293 单元 12 (见材料表), 在 EF1a 启动子下制备了用于表达 Lck-gmp6f、Lck-rmmp-2 和 OER-GMCMP6F 的 AAV载体.
   1. 对于电镀后3-8天的转染, 贴上两个管的标签, 一个用于质粒 DNA, 另一个用于转染试剂。
   2. 在每口管中加入50μl 的减少血清培养基 (见材料表)。
   3. 每盖液中加入0.5 微克的质粒 DNA, 每口在质粒 DNA 管中加入1微克的补充, 并附有神经元转染试剂 (见材料表)。对于 Lcc-rmcmp2 和 OER-GMP6F 的同转染, 将每个质粒0.5 微克和1微米的补充混合在50μl 的减少血清培养基中。
   4. 在转染试剂管中每口井加入1μl 转染试剂 (见材料表)。相同数量的转染试剂用于同染。
   5. 旋涡两个管的 1–2 s。
   6. 将转染试剂混合物 (从步骤 2.2.4) 添加到 DNA 混合物中 (从步骤 2.2.3)。轻轻搅拌, 在室温下孵育混合物 (每张盖板 100Μl) 5分钟。
   7. 以下降的方式将此混合物加载到单元格上。
   8. 将细胞孵育在 CO2 孵化器中 2-3天, 直到标记蛋白被表达。
   9. 对于 AAV 感染, 在混合神经元星形胶质细胞培养中加入每口3微米的 AAV。轻轻混合, 摇一摇盘子。对于 Lcc-rmcmp2 和 Oer-gmp6f 的双重感染, 每口采用3Μl 的方法。如果表达 Geci 的细胞数量不足, 应确定感染的最佳 AAV 量。
   10. 保持培养 1-2周, 直到 Geci 表达。

3. Ca^{2 +}成像

1. 表达 Lck-rmp2 和 OER-GMP6F 的细胞同时成像
   请注意:为了同时记录 Lcc-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 信号, 需要分割图像的光学器件。光学器件可将 Rcmp2 和 Gmp6f 及其投影分离到相机的同一摄影帧上 (图 3 a)。同时成像还需要 (1) 能够同时发射蓝色 (450-490 nm) 和绿色 (500–560 nm) 光谱激发光的光源, (2) 显微镜中的双带滤波器和双色镜组, 以及 (3) RCaMP2 和Gmp6f。有关详细信息, 请参阅材料表。
   1. 在录制前至少30分钟打开成像设备和计算机。将显微镜加热室预热至37°c。设置拆像设备、过滤器和光源。对齐图像分割光学, 以便在相机上显示相同的视场。选择合适的物镜 (参见材料表)。
   2. 将含有 Lc-rmmmp2 和 Oer-gmcmp6f 转染的细胞的盖板安装在记录室内, 在记录室内添加适当的成像介质或缓冲液 (18 毫米盖板为 400μl), 并将其放置在显微镜舞台上。在记录室上盖上盖子, 以避免介质蒸发。
   3. 通过荧光成像定位同时表达 Lck-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 的细胞。最大限度地降低激发光强, 防止光漂白和光毒性。
   4. 取下盖子, 以 10 Hz 开始延时记录。在此录制过程中, 将激动剂添加到腔内, 以唤起 Ca^{2 +}响应 (例如, hela 细胞的组胺, COS-7 细胞的 atp)。
   5. 将延时数据保存在硬盘驱动器 (HDD) 中。
   6. 使用图像分析软件对数据进行分析。
2. 记录星形胶质细胞自发活动, 表达 Lcc-rmp2 和 Oer-gmp6f
   请注意:在没有图像分裂光学器件的情况下, 可以在同一细胞中监测质膜上的 Ca^{2 +}信号和 er 周围的信号。在这里, lcc-rmp2 和 Oer-gmpmp6f 在相同的星形胶质细胞中的顺序记录。对于自发 Ca^{2 +}活性, 强烈建议采用数值孔径大于1.3 的油浸目标。
   1. 在录制前至少30分钟打开显微镜、照相机、光源和显微镜加热室。
   2. 将含有 Lc-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 转染的细胞的盖板安装在记录室中, 并添加400Μl 的成像介质。在房间顶部盖上盖子。
   3. 选择 GCaMP6f 和光源的滤光片集 (蓝色激发光, 例如 470–490 nm; 请参见材料表)。找到表达 Oer-gmpmp6f 的星形胶质细胞。
   4. 选择 Lck-(绿色激发光, 例如510–560纳米; 见材料表) 的滤光片和光源, 并确认 lcc-rmcmp2 是否在相同的星形胶质细胞中表示。避免长时间暴露在光源上, 以防止光漂白。
   5. 以2赫兹的速度记录 Lcc-rmcmp2 的延时图像 2分钟, 将成像数据保存在硬盘上。
   6. 将筛选器设置为 Gmp6f 的筛选器集。在同一视野中记录 Oer-gmcmp6f 的延时图像, 以2赫兹为2分钟保存硬盘上的数据。
   7. 使用图像分析软件对数据进行分析。
3. 记录神经元的自发性神经元活动和诱导的神经元^{ca 2 +}升高
   请注意:神经元成像的显微镜设置与第3.2 节中描述的相同。本文介绍了由 Oer-gmcmp6f 引起的由 glur 活化引起的 Lcc-gmp6f 和 Ca^{2 +}高程引起的自发 ca 2⁺高程的成像。
   1. 要记录自发性神经元活动, 请在记录室中安装包含表达 Lc-gmpmp6f 的细胞的覆盖图, 并添加400μl 的成像介质。在房间顶部盖上盖子。
   2. 将过滤器和光源 (蓝色激发, 例如 470–790 nm; 见材料表) 设置为 Gmp6f。找到表达 Lc-gmp6f 并显示自发活动的神经元。
   3. 以 2 Hz 或更快的速度获取图像。将数据保存在硬盘上。
   4. 使用图像分析软件对数据进行分析。
   5. 要记录诱导的 Ca^{2 +}高程, 请使用400μl 成像介质安装包含表达 Oer-gmpmp6f 的细胞的盖板。在房间顶部盖上盖子。
   6. 使用 Gmp6f 的滤池, 找到表达 Oer-gmp6f 的神经元。
   7. 取下盖子。以2赫兹或更快的速度开始延时记录。在录制过程中, 加入 gq-蛋白偶联受体的激动剂 (例如, mGluR5 激动剂 [RS]-3, 5-二羟基苯基甘氨酸 [DHPG]), 以唤起从 ER^{的 ca 2 +}释放。
   8. 将延时图像保存在硬盘上并分析数据。

Representative Results

Lcc-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 在 HeLa 电池中表达, 这两个信号在转染后24小时内使用图像分裂光学同时记录 (图 3 a和video1)。这些图像是在10赫兹的情况下获得的, 在记录过程中添加了组胺 (他的, 1μm), 它诱导从 ER^{释放 ca 2 +} 。应用他的, Lcc-rcmp2 和 Oer-gmcmp6f 的信号强度增加, 如伪彩色显示的 F/F0 所示, 它代表了与初始荧光强度的变化 (图 3B)。比较了 Lck-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 报告的在同一感兴趣的区域 (ROI) 的 Ca2⁺高程 (f/f0) 的时间过程 (图 3c)。将 F/F0 值归一化为峰值, 以便在具有不同表达式级别和分布的两个不同 Geci 之间进行时间过程比较。这两个传感器都报告了类似振荡的 Ca^{2 +}高程。Lcc-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 在所检查的五种细胞类型中显示了两个细胞^{中 ca 2 +}高程的相同时间过程 (图 3c、roi 1 和 3)。然而, 与 Oer-gmp6f 所显示的相比, Lcc-rmcmp2 显示的 ca^{2 +}高程保持在较高的水平 (图 3c、roi 2、4和 5)。结果表明, Ca^{2 +}高程在质膜附近被延长, 而它在 er 周围较早终止, er 是由他的刺激诱导的这个 ca^{2 +}信号的来源。

Lcc-rmp2 和 OER-GMP6 (图 4, 视频 3) 显示了来自大鼠海马 ( 图 4a) 和皮质的神经元星形胶质细胞自发 ca2⁺信号 、视频 4和视频 5)。皮质文化是从本协议所描述的冷冻库存中恢复的。Lcc-rmcmp2 和 Oer-gmcmp6f 信号从同一细胞按 2 Hz 顺序记录。在每个 GECI 显示 ca^{2 +}高程的区域中选择了三个 roi, 在整个记录期间, F/f_基的时间过程 (即荧光强度) 与平均荧光强度发生了变化 (f_基)).当基线荧光稳定且 Ca^{2 +}高程频率较低时, f_基成为检测 ca^{2 +}高程事件的有用基线。自发性 Ca^{2 + 升高仅}在星形胶质细胞过程中可见, 而在细胞体上不可见。这一结果与以往关于其他 Geci 在体外13和体内14的星形胶质细胞自发 ca^{2 +}信号的报告一致.在海马和皮质星形胶质细胞中, Lcc-rmcmp2 (上) 显示的^{ca 2 +}高度比 Oer-gmcmp6f 所显示的更频繁。这一结果与我们先前的演示一致, 即由于 Lck-gmcmp6f 引起的星形胶质细胞中的 Ca^{2 +}升高比 oer-gmcmp6f⁷引起的升高更为频繁, 并表明这一概念也适用于单细胞级。

在2赫兹时, Lcc-gmcmp6f 在未成熟的大鼠海马神经元 (10 DIV) 中的自发性钙^{2 +}升高 (图 5A和视频 6)。在五个不同的 Roi 中, F/F0 的时间过程表明, 这些 Ca^{2 +}高程在本地局限于亚细胞域。图 5B(视频 7) 显示了感染 Oer-gmp6f-表达 aav 载体的成熟小鼠海马神经元 (30 div) 中的 ca^{2 +}反应。神经元受 100μm DHPG 刺激, 它是促进粒应激谷氨酸受体的激动剂, 诱导 Ca^{2 +}释放。检测到由 Oer-gmpmp6f 引起的 dhpg 诱导的 Ca^{2 +}释放。

图 1: 显示膜目标 Geci 的关系图.等离子体膜靶向 Geci (Lcc-gmp6f 和 Lcc-rmcmp2) 和外 ER 膜靶向 Gmp6f (OER-GMP6 f) 的示意图。

图 2: 海马和皮质细胞制备、质粒转染和 AAV 感染流程图.微观图像是具有代表性的, 新鲜的 DIV-6 皮质细胞 (左) 和从冷冻的股票 (右) 复活的细胞。刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3: 在 hela 细胞中同时成像 lcc-rmp2 和 Oer-gmp6f 的示例.(a) 用分片光学器件进行信号分离的原理图表示。Lcc-rmp2 和 OER-GMP6 的相同视野同时投射在相机上。视频 1中提供了由 cmos 摄像机以 10 hz 获得的代表性录音, 面板 a (右) 显示了此录制的一帧。(b) lcc-gmp2 (上) 和 oer-gmp6f (下) 的 F/f0 的伪彩色图像。组胺 (他的, 1μm) 是在 0 s. (c) 代表归一化的 lcc-gmpmp2 (品红色) 和 oer-gmp6 (绿色) 的归一化的 f/f0 时间过程。数据被归一化为每个图形的最大 F/f0 值。灰色条形图表示他申请的时间。数据是通过定制软件 TI 工作台15进行分析的。刻度杆 = 50μm (显微图像)。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4: 星形胶质细胞中的自发性 Ca^{2 +}高程, 用于 LCC-RMP2 和 oer-gmp6 表达.(a) 具有代表性的海马和 (b) 皮质星形胶质细胞转染 lcc-rmp2 (上图) 和 Oer-gmcmp6f (下)。皮质细胞从冷冻的种群培养中恢复。Lcc-rmcmp2 和 OER-GMCMP6F 图像是在2赫兹的同一单元中, 用 EM-CCD 摄像机按顺序获得的。左边的图显示了在微观图像中所示的 Roi 中测量的 F/fbase 的时间过程。使用 TI 工作台对数据进行了分析。实际影片包含在视频 2、视频3、 视频 4和视频 5中。刻度杆 = 20μm (显微图像)。基线漂移表明单元格中的全局 Ca^{2 +}级别的变化。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5: lck-Gmp6f 和 OER-GMPMP6F 在神经元中的 Ca^{2 +}成像示例.(a) 图像 (右) 显示了在 div 10 (左) 表达 Lc-gmcmp6f 的代表性大鼠海马神经元和显示在 roi (黄色圆圈) 中测量的 f/f0 时间程的图。时间过程中的数字与图像中的 ROI 数字相对应。请注意, Ca^{2 +}高程的时间模式在不同感兴趣的区域之间是不同的。基线漂移表明这个神经元的全球 Ca^{2 +}水平的增加。(b) 感染 Oer-gmcmp6f 表达 aav 载体 (左) 的成熟小鼠海马神经元 (div 30) 的一个例子。测量的 F/f0 时间图显示了在灰度条显示的时间上应用的 Ca^{2 +}响应 100ΜM (rs)-3, 5-二羟基苯基甘氨酸 (dhpg)。黄色圆圈显示了获取时间过程的 Roi 的位置。这些图像是用冷却 ccd 摄像机 (a 面板) 或 EM-CCD 摄像机 (面板 b) 在2赫兹采集的, 并用 ti 工作台进行分析. 刻度杆 = 20μm (显微图像)。请点击这里查看此图的较大版本.

视频 1: 在 hela 细胞中同时成像 lcc-rmp2 和 Oer-gmpmp6f 的示例.以10赫兹时获得的代表性记录, 如图 3所示。刻度杆 = 50μm。 请点击此处下载此视频.

视频 2: 在海马星形胶质细胞 Lck-rmcmp2 中观察到的自发性 Ca^{2 +}瞬态.以2赫兹获得的代表性记录 (图 4 a), 记录在与视频 3相同的视场中。刻度栏 = 20μm. 请点击此处下载此视频.

视频 3: 在海马星形胶质细胞的 Oer-gmcmp6f 中观察到的自发 Ca^{2 +}瞬态.在2赫兹 (图 4 a) 处获得的代表性记录, 与视频 2的视野相同。刻度栏 = 20μm. 请点击此处下载此视频.

视频 4: 在 Lcc-rmcmp2 中观察到的自发性 ca^{2 +}瞬态性, 在 2 hz 获得的皮质星形胶质细胞代表性记录中 (图 4b), 记录在与视频 5相同的视场中。刻度栏 = 20μm. 请点击此处下载此视频.

视频 5: 在皮质星形胶质细胞的 Oer-gmcmp6f 中观察到的自发 ca^{2 +}瞬态.在2赫兹 (图 4b) 处获得的代表性记录, 与视频 4的视野相同。刻度栏 = 20μm. 请点击此处下载此视频.

视频 6: Lck-gmp6f 在大鼠海马神经元 (DIV 10) 中的 Ca^{2 +}成像示例。以 2 hz 记录的神经元^{ca 2 +}信号示例 (图 5a)。刻度栏 = 20μm. 请点击此处下载此视频.

视频 7:ca^{2 +}释放在小鼠海马神经元 (div 30) 表达 Oer-gmpmp6f.记录在感染 Oer-gmpmp6f 表达 AAV 向量的小鼠海马神经元中记录的神经元 Ca 2⁺信号示例 (图 5b)。在30秒应用100Μm 二羟基苯基甘氨酸 (DHPG) 刺激神经元, 从 ER 中唤起 Ca^{2 +}释放。刻度栏 = 20μm. 请点击此处下载此视频.

Discussion

不同的生物输出是由 Ca^{2 +}信号启动的。Ca^{2 +}是一种多才多艺的细胞内信号信使。解码 Ca^{2 +}信号以唤起特定的输出一直是一个基本的生物学问题, ca^{2 +}成像技术来描述 ca^{2 +}信号的多样性是必需的。目前详细的协议允许检测不同的 Ca^{2 +}信号在质膜和 Er (图 3和图 4) 和本地 ca 2 + 微域在一个细胞内 (图 4和图 5⁾ 。这有助于描述细胞内 Ca2⁺信号的多样性。ca^{2 +}信号的时间分辨率也通过针对质膜和 er 中的 geci 得到改善, 因为它可以避免 ca^{2 +}和 geci 本身的三维扩散的影响, 并且有可能检测到Ca^{2 +}流入或^{ca 2 +}释放的时刻, 发生在膜上。

该协议有一些限制。用户应记住, 检测到的信号是 "Ca^{2 +}流入或释放的时刻" 和 "ca² + 从原始 ca^{2 +}源扩散出来" 的总和, 特别是对于大型 ca^{2 +}信号。例如, 尽管他在 HeLa 细胞中的刺激唤起 Er 中的 ca^{2 +}释放, 但其产生的 ca^{2 +}信号不仅通过 er 靶向的 Oer-gmpmp6f 检测, 而且还通过等离子体膜靶向 Lcc-rcmp2 检测到 (图 3)。另一个限制是 ca^{2 +}信号的时空模式可能不是 ca^{2 +}信号输出的唯一行列式。下游效应蛋白 (如 Ca^{2 +}依赖激酶和磷酸酶) 的分布也可能是一个决定性因素²。要完全解码细胞内 Ca^{2 +}信号, 分析下游酶的行为, 这在本协议中没有涉及, 是绝对必要的。

ca^{2 +}成像成功的最关键的方面之一是成像设置和图像采集条件, 以及其他实时成像研究。我们之前表明, ca^{2 +}反应在细胞中是高度依赖的持续时间和强度的兴奋和图像采集条件, 包括曝光时间和采集频率¹⁶。激发照明能力是最关键的因素, 因为它可以引起 Geci 的光毒性和光漂白。应根据实验目的, 优化曝光时间、记录频率、激发光强和记录持续时间的记录条件。我们建议尽可能缩短曝光时间和激发光强度, 以避免光漂白和光氧化对电池的影响。记录频率和记录时间应足以涵盖感兴趣的 Ca^{2 +}高程事件, 但应尽可能保持在较低的水平, 以避免光漂白和光毒性。我们建议首先确定记录频率和持续时间, 并优化光强和曝光时间, 以最大限度地减少 Geci 的光漂白。另一个重要因素是 Geci 的表达水平。Geci 具有 Ca^{2 +}缓冲效应, 因为它们是^{ca 2 +}结合蛋白。因此, Geci 的过度表达导致 Ca^{2 +}的缓冲, 这在生理上是必要的细胞。应尽量减少 GECI 表达的量, 以避免成像细胞表达大量 Geci。
 
总之, 以亚细胞分辨率分割 ca^{2 +}信号是解码确定输出生物现象的细胞内 ca^{2 +}信号的最重要步骤之一。该协议为 Ca^{2 +}信号的分割提供了一种新的方法来描述这些信号之间的多样性。目前, 该技术仅限于体外实验。然而, Lcc-gmcmp6f 已经被用于小鼠^体内ca^{2 +}成像, oer-gmp6 f 被证实在体内监测 ca 2 + 信号在 vd 运动神经元在 c . elegans7^.因此, 针对亚细胞舱内的 Geci 有可能在未来扩展到体内成像, 从而使 Ca^{2 +}在体内解剖成为可能。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)	Tocris	#0342
0.5% DNase I stock solution	Sigma-Aldrich	#11284932001	Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution  supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30 °C.
0.5% Trypsin-EDTA solution	Thermo Fisher Scientific	#25300054
100 mM L-glutamine (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#25030081	Preparing small aliquots of 250-750 µL and store at -30 °C.
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock)	Thermo Fisher Scientific	#11360070	Aliquots (10 mL) can be stored at -20 °C. After thawing, the solution can be maintained at 4 °C for 2 months.
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid	Falcon	#353043	Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used.
18 mm diameter circular coverslips	Karl Hecht "Assistent"	#41001118	Thickness 1, 18 mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used.
1 M HEPES	Thermo Fisher Scientific	#15630080	pH 7.2-7.6
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock)	Sigma-Aldrich	#T4674	Prepare 150 µL aliquot and store at -30 °C.
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution	Sigma-Aldrich	#P3143	Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30 °C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating.
70% Ethanol			Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection.
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter			AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and  pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request.
B-27 supplement (×50 stock)	Thermo Fisher Scientific	#17504044	This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566).
B57BL/6	Japan SLC, Inc.
Camera for microscopic image recording			The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics,  ImagEM; Andor, iXon) or  CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
Cell freezing container	Sarstedt K.K.	#95.64.253	Alternative cell freezing container can be used.
Cell strainer	Falcon	#352350
CO2 incubator			Maintain at 37 °C, 5% CO2.
Cryogenic tube	Corning	#430661	Alternative cryogenic tubes can be used.
Cryopreservation medium	Zenoaq		"CELLBANKER1"
Culture medium (for HeLa cells)			Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 U/mL and Streptomycin 100 µg/mL)
Dissection medium			One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM
DMEM	Nacalai	#08456-65	Alternative DMEM can be used.
DMEM	Nacalai	#08456-65	Low glucose
DNA transfection reagent	Sigma-Aldrich	#6366244001	"X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used.
Glass jar with a lid			500 mL jar (for mouse) or 1,500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal
HBSS	Thermo Fisher Scientific	#14170161	HBSS free of calcium and magnesium
Heat inactivated bovine serum	Thermo Fisher Scientific	#10100147
HeLa cells	RIKEN BioResource Center	#RCB0007
Histamine	Sigma-Aldrich	#H7125
Image analysis software			Such as Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH), and TI Workbench14 (custom made)
Image splitting optics	Hamamatsu Photonics	#A12801-01	W-view GEMINI
Image splitting optics dichroic mirror	Semrock	#FF560-FDi01-25×36	For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein  (GFP/RFP) signal
Image splitting optics emission filters	Semrock	#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25	For emission of GFP/RFP signal, respectively
Imaging medium and buffer			Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator.
Incubation saline			Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS
Inverted fluorescence microscope			Such as IX73 (Olympus) or  Eclipse TI (Nikon Instech)
Isoflurane	Pfizer		Used for anesthesia
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes)			48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution.
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes)			12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution.
MEM (Minimum Essential Medium)	Thermo Fisher Scientific	#11090-081
Microscope filter set for GCaMP6f imaging			Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm)
Microscope filter set for RCaMP2 imaging			Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass)
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f	Semrock	#FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25	Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging.
Microscope heating system			A heating system to maintain cells at 37 °C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended.
Microscope light source for excitation			Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity.
Microscope objective lens			Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes.
Neurobasal plus medium	Thermo Fisher Scientific	#A3582901
Neurobasal-A Medium	Thermo Fisher Scientific	#10888022	Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium.
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+	Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation	#164-23551	The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used.
PC and image acquisition software			Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14.
Penicillin-Streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	#15140122	Penicillin 10,000 U/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9			Available upon request
Plating medium (for 4 × 12 well dishes)			48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 U/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of  the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival.
Recording chamber	Elveflow	Ludin Chamber	This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips.
Reduced serum media	Thermo Fisher	#11058021	Opti-MEM
Stereomicroscope			Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available.
Surgical instruments			Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13 cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains,  3 forceps with fine tips  (Dumont Inox #5)
Transfection reagent for neuron	Thermo Fisher Scientific	#L3000008	"Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4.
Trypan blue (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	#15250061
Wash medium for frozen cortical cells			25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin.
Wistar rats	Japan SLC, Inc		Pregnant rats (E18)