Summary
यहां हम Ca के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत2 + ंयूरॉंस और glial कोशिकाओं में इमेजिंग, जो ca 2 के विच्छेदन सक्षम बनाता है+ subcellular संकल्प में सिग्नल । यह प्रक्रिया सभी कक्ष प्रकारों पर लागू होती है जो आनुवंशिक रूप से एंकोडेड Ca2 + संकेतकों की अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं ।
Abstract
कैल्शियम आयन (Ca2 +) एक सार्वभौमिक intracellular दूत अणु है कि कई संकेत मार्ग ड्राइव, विविध जैविक outputs के लिए अग्रणी है । दो ca के समंवय2 + सिग्नल स्रोतों-"ca2 + आमद" सेल के बाहर से और "ca2 + रिलीज" intracellular Ca2 से + स्टोर अंतर्द्रव्यी रेटिलियम (ईआर)-के लिए विविध spatio-लौकिक पैटर्न के लिए माना जाता है ca 2 + संकेतों कि कोशिकाओं में कई जैविक कार्यों का कारण । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक नया Ca2 + इमेजिंग विधि का वर्णन करने के लिए है जो "ca 2 + आमद" और "ca2 + release" के परिक्षण की निगरानी को सक्षम करता है । OER-GCaMP6f एक आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Ca2 + संकेतक (geci) GCaMP6f शामिल है, जो ईआर बाहरी झिल्ली को लक्षित है । OER-GCaMP6f सीए 2 की निगरानी कर सकते हैं+ पारंपरिक GCaMP6f की तुलना में एक उच्च लौकिक संकल्प पर रिहाई. प्लाज्मा झिल्ली-लक्षित GECIs के साथ संयुक्त, spatio-लौकिक सीए2 + सिग्नल पैटर्न एक subcellular संकल्प में वर्णित किया जा सकता है । subcellular लक्षित सीए2 + संकेतक यहां वर्णित हैं, सिद्धांत रूप में, सभी प्रकार के सेल के लिए उपलब्ध है, यहां तक कि vivo इमेजिंग में caenorहैबडाइटिस एलिगेंस ंयूरॉंस के लिए । इस प्रोटोकॉल में, हम सेल लाइनों, ंयूरॉंस से कोशिकाओं में सीए2 + इमेजिंग परिचय, और वियोजित प्राथमिक संस्कृतियों में glial कोशिकाओं, और चूहे वल्कुट ंयूरॉंस के जमे हुए शेयर की तैयारी का वर्णन ।
Introduction
Ca2 + सिग्नल intracellular ca2 + एकाग्रता की ऊंचाई का प्रतिनिधित्व करते हैं । Ca2 + यूकार्योटिक कोशिकाओं के लिए सार्वभौमिक दूसरा दूत है । Ca का उपयोग कर2 +, कोशिकाओं विविध intracellular संकेत मार्ग के माध्यम से कार्य और विभिन्न जैविक outputs प्रेरित. उदाहरण के लिए, ंयूरॉंस, presynaptic टर्मिनल, नाभिक में जीन अभिव्यक्ति में synaptic आशय जारी, और postsynapse में synaptic सुघट्यता के प्रेरण विशिष्ट Ca 2 द्वारा विनियमित रहे हैं+ संकेत है कि ठीक से उपयुक्त सक्रिय सही साइटों पर डाउनस्ट्रीम एंजाइमों और सटीक समय के साथ1।
विशिष्ट अनुप्रवाह एंजाइमों को सक्रिय Ca2 + संकेतों के विशेष spatioलौकिक पैटर्न । ca 2 + सिग्नल दो अलग ca2 + स्रोतों के बीच समंवय द्वारा उत्पंन होते हैं: ca2 + अंतर्द्रव्यी रेटिक्युलम (ईआर), जो एक intracellular ca 2 + के रूप में कार्य करता है, से extracellular अंतरिक्ष और ca2 + रिलीज से आमद स्टोर । एक विशिष्ट सेल समारोह को प्रेरित करने के लिए सार्थक spatioलौकिक सीए2 + सिग्नलिंग पैटर्न भी प्लाज्मा झिल्ली या ईआर झिल्ली2पर सीए2 + चैनलों के आसपास में उत्पन्न 10-100 μm सीए2 के nanodomains द्वारा समर्थित है । महत्वपूर्ण बात, Ca के स्रोत2 + संकेत सबसे महत्वपूर्ण बहाव जैविक उत्पादन का निर्धारण कारकों में से एक है । न्यूरॉन्स में, ca2 + तांता और ca2 + रिहाई गैबेराइजिक synapses, जो की निषेध के लिए जिंमेदार है पर गामा aminobutyric एसिड (गाबा)एक रिसेप्टर्स (गाबाएआर) के क्लस्टरिंग पर विपरीत प्रभाव है न्यूरोनल excitability3. ca2 + बड़े पैमाने पर न्यूरोनल उत्तेजना के साथ तांता synaptic गाबाएआर क्लस्टर्स के फैलाव लाती, जबकि लगातार Ca2 + ईआर से रिहाई synaptic गाबाएकरुपये के क्लस्टरिंग को बढ़ावा देता है. अंय समूहों ने यह भी बताया है कि विकास शंकु की ट्यूनिंग दिशा गंभीर रूप से ca के स्रोत पर निर्भर है2 + सिग्नल: ca 2 + आमद लाती प्रतिकर्षण, जबकि ca2 + रिलीज गाइड न्यूरोनल विकास के आकर्षण कोन४. इसलिए, पूरी तरह से सीए 2 को समझने के लिए+ विशिष्ट सेलुलर outputs अंतर्निहित मार्ग सिग्नलिंग, यह ca 2 + संकेतों के स्रोत की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है Subcellular संकल्प में ca के दो+ संकेतों का वर्णन ।
इस प्रोटोकॉल में, हम ca 2 + इमेजिंग विधि की रिपोर्ट करने के लिए ca 2 + संकेतों subcellular रिज़ॉल्यूशन पर, जो सीए2 + संकेत स्रोतों का अनुमान (चित्रा 1) की अनुमति देता है का वर्णन । Ca2 + प्लाज्मा झिल्ली के नीचे सिर्फ microdomains सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से एनकोडेड Ca2 + संकेतक (gecis) प्लाज्मा झिल्ली के लगाव के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली को लक्षित द्वारा निगरानी कर रहे हैं-स्थानीयकरण सिग्नल Lck के भीतर एसआरसी कीनेस को एन-टर्मी ऑफ गेकिस5. एक बेहतर स्थानिक और लौकिक संकल्प पर ईआर के आसपास में Ca2 + संकेत पैटर्न का पता लगाने के लिए, हम हाल ही में oer-GCaMP6f, जिसमें GCaMP6f6 ईआर बाहरी झिल्ली लक्ष्य, ईआर transmembrane प्रोटीन का उपयोग कर विकसित की है । OER-GCaMP6f संवेदनशीलता सीए 2+ जारी करने के लिए एक बेहतर spatioलौकिक संकल्प पर एर से COS में पारंपरिक Nontargeted GCaMP6f की तुलना कर सकते हैं-7 कोशिकाओं7 और HEK293 कोशिकाओं8, ca के प्रसार से बचने के द्वारा2 + और gecis . हम यह भी पुष्टि की है कि सहज Ca2 + सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पल astrocytes में ऊंचाई oer द्वारा रिपोर्ट-GCaMP6f प्लाज्मा झिल्ली द्वारा निगरानी की तुलना में एक अलग स्पैटिओटेंटल पैटर्न दिखाया-लक्षित GCaMP6f (Lck-GCaMP6f)7 ,9, का संकेत है कि ca2 + oer के साथ इमेजिंग-lck के साथ संयोजन में GCaMP6f-GCaMP6f ca के विच्छेदन के लिए योगदान देता है+ subcellular संकल्प में संकेतों को अपने स्रोतों की पहचान ।
वर्तमान में, हम विस्तार से Ca के लिए प्रोटोकॉल2 + हेला कोशिकाओं में सिग्नल विच्छेदन और neuron-astrocyte मिश्रित संस्कृति कांच coverslips पर चढ़ाया । Ca2 + gecis के साथ इमेजिंग तकनीक यहां संकेत दिया, Lck-GCaMP6f, प्लाज्मा-झिल्ली-लक्षित RCaMP210 (lck-RCAMP2), और Oer-GCaMP6f (चित्रा 1) सभी कोशिकाओं में इन gecis व्यक्त किया जा सकता है लागू होते हैं ।
Protocol
यहां वर्णित सभी प्रयोगों को जापानी शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान, और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा जारी किए गए दिशानिर्देश के अनुसार रिकेन सेफ्टी कमेटी और पशु प्रयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।
1. कोशिकाओं की तैयारी
- पाली की तैयारी (ethyleneimine)-लेपित coverslips
नोट: पाली (ethyleneimine) (PEI) कोटिंग कांच तंत्र के लिए सिफारिश की है, क्योंकि यह ंयूरॉंस और astrocytes उनके विकास को रोकने के बिना coverslips को कसकर संलग्न करने की अनुमति देता है । हालांकि, अंय कोटिंग तरीकों (जैसे, पाली-ornithine, पाली एल lysine, laminin कोटिंग) भी उपलब्ध हैं, यदि आवश्यक हो, कांच के लिए नीचे व्यंजन ।- एक 12-अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कूप में एक 18 मिमी व्यास ग्लास coverslip प्लेस । निष्फल जल का उपयोग करके ०.०४% PEI समाधान (१२.५ मिलीलीटर/12-कूप प्लेट) तैयार करें ।
- प्रत्येक अच्छी तरह से ०.०४% PEI समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें । सुनिश्चित करें कि वहां coverslips के नीचे कोई बुलबुले हैं ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में एक सह2 इनयूबेटर में प्लेटें सेते ।
- अगले दिन, लेपित coverslips 3x धोने के साथ निष्फल पानी की 1 मिलीलीटर । एक aspirator के साथ पी समाधान निकालें, एक अच्छी तरह से निष्फल पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और 12-अच्छी तरह से थाली हिला ताकि coverslip और थाली के बीच पी समाधान अच्छी तरह से धोया जा सकता है । के रूप में शेष बेई कोशिकाओं के लिए विषाक्त है, यह सुनिश्चित करें कि अंतिम धोने के बाद पानी पूरी तरह से aspirated है ।
- सूखी और के साथ हुड के अंदर coverslips जीवाणुरहित पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के लिए ंयूनतम 15 मिनट । बेई लेपित पकवान 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । केवल उपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश के साथ व्यंजन रोशन ।
- संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए कुओं के बीच अंतरिक्ष में बाँझ आसुत जल की ५ मिलीलीटर डालें.
- चढ़ाना सेल लाइंस
नोट: यह प्रोटोकॉल स्तनधारी कोशिका रेखाओं, जैसे कि HeLa कोशिकाओं और COS-7 कोशिकाओं से कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन के लिए सिर्फ एक उदाहरण प्रदान करता है । उपयोगकर्ताओं को अपने प्रयोगों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं कि अन्य ट्रांसफेक्शन प्रोटोकॉल लागू कर सकते हैं. इस अनुभाग में, हम HeLa सेल कल्चर प्रोटोकॉल का वर्णन करेंगे, जो कि COS-7 कक्षों पर भी लागू होता है ।- transfection से पहले दिन, संस्कृति एक 10 सेमी संस्कृति डिश में कोशिकाओं जब तक वे 70%-90% संगम प्राप्त करते हैं ।
- संस्कृति मध्यम Prewarm ( सामग्री की मेजदेखें) ३७ डिग्री सेल्सियस करने के लिए ।
- 2 एक्स फॉस्फेट के साथ सेल 2x धो-बिना नमक buffered+ और2 मिलीग्राम + (pbs [-]) ।
- महाप्राण पीबीएस (-), ०.५% trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ें-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान, और ९० के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते जब तक वे एक गोल आकार प्राप्त ।
- trypsinization को रोकने के लिए prewarmed संस्कृति माध्यम के 9 मिलीलीटर जोड़ें । 1:6 के अनुपात में संस्कृति माध्यम के साथ कोशिकाओं को पतला ।
- 12-कूप प्लेटों में पी-लेपित coverslips पर पतला कोशिकाओं के बीज 1 मिलीलीटर ।
- हिप्पोकैम्पल ंयूरों की तैयारी-astrocyte मिश्रित संस्कृति चूहों या चूहों से
नोट: अनुभागों १.३ और १.४ पहले की समीक्षा की जानी चाहिए और एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित और देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग के लिए आधिकारिक तौर पर अनुमोदित प्रक्रियाओं का पालन करना चाहिए । न्यूरोनल कल्चर प्रोटोकॉल का फ़्लोचार्ट चित्रा 2में दिखाया गया है ।- लैबिनर फ्लो हुड के तहत सभी अभिकर्मकों तैयार । प्लेस है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) २ १०० मिमी संस्कृति व्यंजन में (लगभग 20 मिलीलीटर/एक icebox में हैं ।
- DMEM और 20 मिमी 4 से बना विच्छेदन मध्यम की ५० मिलीलीटर तैयार करें-(2-hydroxyethyl) -1-पिपरजेनिनेथानेस्कुलफोनिक एसिड (HEPES) ( सामग्री की मेजदेखें) और ३ ६० मिमी संस्कृति व्यंजन में मध्यम वितरण (लगभग 7 मिलीलीटर/ संस्कृति व्यंजन (लगभग 2 मिलीलीटर/ एक और icebox में व्यंजन प्लेस ।
- ऊष्मायन खारा के ५० मिलीलीटर तैयार, हैंक्स संतुलित नमक 20 मिमी HEPES के साथ पूरक समाधान से बना ( सामग्री की मेजदेखें), और एक 15 मिलीलीटर बर्फ पर शंकु ट्यूब में खारा की 8 मिलीलीटर जगह ।
- बी-27, ग्लूटामाइन, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ ंयूनतम आवश्यक माध्यम (मेम) पूरक के साथ चढ़ाना मध्यम तैयार करें । कमरे के तापमान (20-28 डिग्री सेल्सियस) पर इस माध्यम को बनाए रखें ।
- ७०% इथेनॉल के साथ शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित ।
- एक गिलास जार में एक ढक्कन और isoflurane के 1 मिलीलीटर के साथ एक कागज तौलिया प्लेस । 1 मिनट के लिए आइसोफ्लूराइन वाष्पीकरण होने दें ।
- एक गर्भवती चूहा या जार में एक माउस जगह 1.3.6 कदम के अनुसार तैयार है और जार में जानवर रखने तक यह गहरी ऊपर है (लगभग 30 एस 1 मिनट के लिए) ।
- जार से बाहर ऊपर जानवर ले लो और उंहें ७०% इथेनॉल के साथ छिड़काव द्वारा पशु और विच्छेदन उपकरण कीटाणुरहित । मानक विदारक कैंची और चिमटी के साथ अधर मिडलाइन काटें और गर्भवती चूहा या माउस से गर्भाशय को निकालें ।
- निकालने E18-एक संवेदनाहरण महिला चूहे या माउस के गर्भाशय से 19 भ्रूण, नाजुक विदारक कैंची का उपयोग कर, और ठंडे बेहोशी के लिए एक 10 सेमी डिश में बर्फ में एक अंगूठी संदंश के साथ निकाले भ्रूण जगह-ठंड ऊपर ।
- भ्रूण को बारीक विच्छेदन कैंची से डिकैटेट करें और सिर को बर्फ में ठंडे डमेम में 10 सेमी डिश में रखें ।
- एक 13 सेमी घुमावदार सेमकेन संदंश और ठीक सुझावों के साथ संदंश के साथ प्रत्येक भ्रूण से मस्तिष्क निकालें । बर्फ के ठंडे विच्छेदन माध्यम में मस्तिष्क को ६० मिमी डिश में रखें ।
- हिप्पोकैम्पी निकालें, ठीक सुझावों के साथ दो संदंश का उपयोग, बर्फ में ठंडा विच्छेदन मध्यम में ३५ मिमी व्यंजन और ऊष्मायन खारा बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रखा में अलग ऊतक को बनाए रखने ।
- हिप्पोकैम्पी को उष्मायन खारा और सेते के साथ ट्रिप्सिन (१.२५ मिग्रा/एमएल) और डनेज I (०.२५ मिलीग्राम/एमएल) के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उष्मायन खारा में धोएं । की सिफारिश की ऊष्मायन मात्रा ऊष्मायन खारा, 20x स्टॉक trypsin के १५० μL के २.७ मिलीलीटर है, और 20x स्टॉक DNase के १५० μL ( सामग्री की मेजदेखें) ।
- हिप्पोकैम्पी 3x को आइस-कोल्ड इनक्यूबेशन खारा के साथ धो लें ।
- ऊष्मायन खारा और चढ़ाना माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ने DNase मैं (स्टॉक समाधान के 10 μL; सामग्री की मेजदेखें) । एक सेल काउंटर और Trypan नीले परख का उपयोग कर, 20x से अधिक नहीं और व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व को मापने के द्वारा ऊतक निलंबित ।
- चूहों के लिए १.४ x 105 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के लिए हिप्पोकैम्पल कोशिकाओं को पतला और २.५ x 105 व्यवहार्य कोशिकाओं/ 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में PEI लेपित coverslips पर पतला सेल निलंबन के बीज 1 मिलीलीटर ।
- 2-3 दिनों के लिए एक CO2 इनयूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखें ।
- चढ़ाना मध्यम निकालें । कोशिकाओं को सूखने न दें । धीरे से और जल्दी से prewarmed रखरखाव मध्यम जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) ।
- चूहा वल्कुट ंयूरोन की तैयारी-astrocyte मिश्रित संस्कृति और जमे हुए कोशिकाओं, और जमे हुए संस्कृतियों के पुनरुद्धार
नोट: वल्कुट कोशिकाओं के लिए एक cryopreservation विधि previously11 वर्णित किया गया था । यहां, एक संशोधित प्रोटोकॉल है जिसमें वल्कुट कोशिकाओं पर संग्रहित किया जा सकता है-८० डिग्री सेल्सियस कम 3 महीने के लिए प्रदान की जाती है । इस प्रोटोकॉल के लिए फ़्लोचार्ट चित्रा 2में दिखाया गया है ।- DMEM, विच्छेदन मध्यम, ऊष्मायन खारा, और चढ़ाना माध्यम के रूप में कदम 1.3.1 में संकेत-1.3.4, और सामग्री की मेजतैयार करते हैं ।
- DMEM, हीट-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन ( सामग्री की मेजदेखें), यदि आवश्यक हो, के गठन धोने के माध्यम तैयार करते हैं ।
- एक संवेदनाहरण महिला चूहे या माउस के गर्भाशय से E18-19 भ्रूण निकालने, नाजुक विच्छेदन कैंची का उपयोग, और ठंड बेहोशी के लिए बर्फ में प्रत्येक निकाले भ्रूण जगह करने के लिए अंगूठी संदंश का उपयोग करें ।
- भ्रूण से दिमाग निकालें और उन्हें बर्फ-शीत विच्छेदन माध्यम में रखें. कॉर्टेक्स निकालें और बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में रखा ऊष्मायन खारा में उन्हें बनाए रखने.
- कॉर्टिक्सस को ऊष्मायन लवण से धोएं और ट्रिप्सिन (१.२५ मिग्रा/मिली) और डनेज I (०.२५ एमजी/एमएल) के साथ कॉर्टेक्स को ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ऊष्मायन लवण में रखें । 12 cortexes के लिए अनुशंसित ऊष्मायन मात्रा ऊष्मायन खारा, 20x स्टॉक trypsin के ३०० μL के ५.४ मिलीलीटर है, और 20x स्टॉक DNase मैं के ३०० μL ।
- बर्फ ठंडा ऊष्मायन खारा के साथ cortexes 3x धो लें ।
- supernatant निकालें और जोड़ने के 2 मिलीलीटर मध्यम पूरक के साथ १५० μL DNase मैं शेयर की । 20 से कम स्ट्रोक्स का उपयोग कर कोशिकाओं को अलग कर दें, और ७० μm के एक ताकना आकार के साथ एक सेल छलनी का प्रयोग कोशिकाओं को फिल्टर ।
- चढ़ाना के लिए चढ़ाना माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ सेल छलनी धो लो । फ्रोजन सेल स्टॉक की तैयारी के लिए, धोने के माध्यम के 20 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने ( सामग्री की मेजदेखें)
- व्यवहार्य कोशिकाओं के घनत्व को मापने, एक सेल काउंटर और Trypan ब्लू विधि का उपयोग कर ।
- वल्कुट कोशिकाओं को पतला मध्यम चढ़ाना के साथ १.४ x 105 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल के घनत्व के लिए और 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में पी लेपित coverslips के लिए पतला सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- 2-3 दिनों के लिए एक सह2 इनयूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को बनाए रखने और रखरखाव के माध्यम से संस्कृति माध्यम बदल जाते हैं ।
- कदम 1.4.9 के बाद, एक स्विंग रोटर का उपयोग कर, 3 मिनट के लिए १८७ x जी पर कोशिकाओं अपकेंद्रण द्वारा जमे हुए वल्कुट सेल स्टॉक तैयार करते हैं ।
- supernatant महाप्राण और cryopreservation मध्यम जोड़ने ( सामग्री की मेजदेखें) 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा, 1 x 107 कोशिकाओं के एक सेल घनत्व प्राप्त करने के लिए/ सेल के 1 मिलीलीटर को क्रायोजेनिक ट्यूबों में निलंबन ।
- एक सेल जमने वाले कंटेनर में ट्यूबों को जमने की दर से-1 डिग्री सेल्सियस/मिनट तक रखें, जब तक कि-८० डिग्री सेल्सियस तक पहुंच न जाए, और हिमांक कंटेनर को एक-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीज़र में स्थानांतरित कर देना । -८० डिग्री सेल्सियस से कम 3 महीने के लिए कोशिकाओं को संग्रहित किया जा सकता है ।
- जमे हुए कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने के लिए, धोने मध्यम prewarm (प्रत्येक क्रायोजेनिक ट्यूब के लिए लगभग 13 मिलीलीटर) और जमे हुए वल्कुट कोशिकाओं के लिए रखरखाव के माध्यम ( सामग्री की मेजदेखें).
- जमे हुए कोशिकाओं को एक पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर तेजी से गल ।
- गल कोशिकाओं धीरे prewarmed धोने के माध्यम से पतला । सेंट्रीफ्यूज १८७ एक्स जी पर 3 मिनट के लिए कोशिकाओं, एक स्विंग रोटर का उपयोग कर ।
- धोने के माध्यम के 1 मिलीलीटर में गोली निलंबित और व्यवहार्य कोशिका घनत्व को मापने ।
- जमे हुए वल्कुट कोशिकाओं के लिए रखरखाव के माध्यम से कोशिकाओं को पतला करने के लिए ३.० x 105 व्यवहार्य कोशिकाओं/एमएल के एक सेल घनत्व उपज, और बीज 1 मिलीलीटर सेल निलंबन के बेई लेपित 12-कूप प्लेटों में ।
2. झिल्ली की अभिव्यक्ति-लक्षित GECIs
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कोशिकाओं का ट्रांसफेक्शन
- जोड़ें २५० जीसीआई प्लाज्मिड के एनजी (यानी, lck-GCaMP6f, lck-RCaMP2, या oer-cmv प्रवर्तक के साथ GCaMP6f)7, 8, 9 कम सीरम मध्यम के १०० μl ( सामग्री की मेजदेखें) के प्रति अच्छी तरह से । lck-RCaMP2 और oer-GCaMP6f के cotransfection के लिए, प्रत्येक अच्छी तरह से कम सीरम मध्यम के १०० μl में प्रत्येक प्लाज्मिड के २५० एनजी का उपयोग करें ।
- ट्रांफेक्शन अभिकर्मक के ०.५ μL जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रति अच्छी तरह से plasmid में कम सीरम मध्यम मिश्रण । Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f के cotransfection के लिए, अच्छी तरह से प्रति ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के ०.५ μL जोड़ें ।
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान (20-28 डिग्री सेल्सियस) पर मिश्रण सेने ।
- एक बूंद वार तरीके से प्रत्येक coverslip करने के लिए मिश्रण के १०० μL जोड़ें ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक सह2 इनयूबेटर में 48-72 एच के लिए कोशिकाओं को सेको की अभिव्यक्ति की अनुमति के लिए ।
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transfection और adeno-हिप्पोकैम्पल या वल्कुट ंयूरॉंस के वायरस के संक्रमण से जुड़े
नोट: 3-5 दिनों के लिए विट्रो (DIV) में अभिकर्मक न्यूरॉन्स के लिए एक उच्च अभिकर्मक दर में परिणाम. 6 में ट्रांसफेक्शन-8 DIV astrocytes में GECIs के इष्टतम अभिव्यक्ति के लिए पसंद है । 9 DIV के बाद वियोजित संस्कृति ंयूरॉंस में gecis की अभिव्यक्ति के लिए, adeno के संक्रमण से जुड़े वायरस (aav) वैक्टर एक बेहतर अभिव्यक्ति प्रभावकारिता प्रदान करता है । AAV वैक्टर Lck की अभिव्यक्ति के लिए-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, और OER-GCaMP6f EF1a प्रवर्तकों के तहत पहले वर्णित के रूप में तैयार थे, HEK293 कोशिकाओं12 का उपयोग ( सामग्री की मेजदेखें) ।- अभिकर्मक के लिए 3-8 दिनों के बाद चढ़ाना, लेबल दो ट्यूबों, एक प्लाज्मिड डीएनए के लिए और अन्य अभिकर्मक अभिकर्मक के लिए.
- कम सीरम मध्यम की ५० μL जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक ट्यूब के लिए ।
- प्रति coverslip और पूरक के 1 μl के साथ ०.५ μg प्लाज्मिड डीएनए के ंयूरॉंस के लिए अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रति अच्छी तरह से प्लाज्मिड डीएनए ट्यूब के लिए । lck-RCaMP2 और oer-GCaMP6f के cotransfection के लिए, प्रत्येक प्लाज्मिड के ०.५ μg और पूरक के 1 μl अच्छी तरह से प्रति कम सीरम मध्यम के ५० μl में मिलाया जाता है ।
- ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक के 1 μl जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) प्रति अच्छी तरह से अभिकर्मक अभिकर्मक ट्यूब में । ट्रांसफेक्शन अभिकर्मक की एक ही राशि cotransfection के लिए प्रयोग किया जाता है ।
- भंवर के लिए दोनों ट्यूबों 1 – 2 एस.
- अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण (कदम 2.2.4 से) डीएनए मिश्रण (2.2.3 कदम से) जोड़ें । धीरे से पिख्ता और मिश्रण (१०० μL प्रति coverslip) 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते द्वारा मिक्स ।
- इस मिश्रण को एक बूंद-वार तरीके से कोशिकाओं पर लोड कर दें ।
- 2-3 दिनों के लिए एक सह2 इनयूबेटर में कोशिकाओं को इंसेबेट जब तक मार्कर प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं ।
- AAV संक्रमण के लिए, अच्छी तरह से मिश्रित neuron-astrocyte संस्कृति के लिए प्रति AAV के 3 μL जोड़ें । डिश का कमाल करके धीरे से मिक्स कर लें । Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f के दोहरे संक्रमण के लिए, प्रत्येक AAV के 3 μL के प्रति अच्छी तरह से पेश किया जाता है । यदि GECIs व्यक्त कोशिकाओं की संख्या अपर्याप्त हैं, संक्रमण के लिए इष्टतम AAV राशि निर्धारित किया जाना चाहिए ।
- 1 के लिए संस्कृति को बनाए रखने-2 सप्ताह तक GECIs व्यक्त कर रहे हैं ।
3. Ca2 + इमेजिंग
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Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f व्यक्त कोशिकाओं की एक साथ इमेजिंग
नोट: एक साथ Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f संकेतों को रिकॉर्ड करने के लिए, छवि विभाजन प्रकाशिकी आवश्यक हैं । प्रकाशिकी RCaMP2 और GCaMP6f और कैमरे के एक ही फोटो फ्रेम पर उनके प्रक्षेपण के पृथक्करण सक्षम (चित्रा 3A) । एक साथ इमेजिंग भी (1) प्रकाश स्रोतों है कि एक साथ नीले रंग में उत्तेजन प्रकाश (450-490 एनएम) और हरे रंग (500-560 एनएम) स्पेक्ट्रा, (2) डबल बैंड फिल्टर और माइक्रोस्कोप में dichroic दर्पण सेट का उत्सर्जन कर सकते है की आवश्यकता है, और (3) RCaMP2 के लिए एमिशन फिल्टर और GCaMP6f । विवरण के लिए, सामग्री की तालिकाको देखें ।- रिकॉर्डिंग करने से पहले इमेजिंग डिवाइसेस और कंप्यूटर्स को कम 30 मिनट पर चालू करें । खुर्दबीन हीटिंग चैंबर ३७ डिग्री सेल्सियस Prewarm । छवि-विभाजक डिवाइस, फ़िल्टर्स, और प्रकाश स्रोत सेट करें । छवि विभाजक प्रकाशिकी को संरेखित करें ताकि दृश्य का एक ही फ़ील्ड कैमरे पर दिखाई दे । उचित उद्देश्य लेंस चुनें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
- Lck-RCaMP2 और OER-रिकॉर्डिंग चैंबर में GCaMP6f के साथ transfected कोशिकाओं युक्त coverslip माउंट, चैंबर में उपयुक्त इमेजिंग मध्यम या बफर (18 मिमी coverslip के लिए ४०० μL) जोड़ने के लिए, और यह माइक्रोस्कोप मंच पर जगह है । माध्यम के वाष्पीकरण से बचने के लिए रिकार्डिंग कक्ष पर ढक्कन लगाएं ।
- दोनों Lck-RCaMP2 और OER-फ्लोरोसेंट इमेजिंग द्वारा GCaMP6f व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाएँ । photoब्लीचिंग और photobleaching को रोकने के लिए उत्तेजन प्रकाश तीव्रता को कम करने.
- ढक्कन निकालें और 10 हर्ट्ज पर एक समय चूक रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं । इस रिकॉर्डिंग के दौरान, चैंबर के लिए एगोनिस्ट Ca के लिए2 + प्रतिक्रियाएं (उदा, HeLa कोशिकाओं के लिए हिस्टामिन, COS-7 कोशिकाओं के लिए एटीपी) जोड़ें ।
- हार्ड डिस्क ड्राइव (HDD) में समय चूक डेटा सहेजें ।
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें ।
-
रिकॉर्डिंग एस्ट्रोसाइट्स की सहज गतिविधियों Lck एक्सप्रेस-RCaMP2 और OER-GCaMP6f
नोट: छवि विभाजन प्रकाशिकी के बिना, Ca2 + प्लाज्मा झिल्ली पर संकेत और ईआर के आसपास उन एक ही सेल में नजर रखी जा सकती है । यहां, एक ही astrocytes में Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f की अनुक्रमिक रिकॉर्डिंग बताई गई है । १.३ से बड़ा एक संख्यात्मक छिद्र के साथ एक तेल विसर्जन उद्देश्य अत्यधिक सहज Ca2 + गतिविधि के लिए सिफारिश की है ।- माइक्रोस्कोप, कैमरा, प्रकाश स्रोत, और माइक्रोस्कोप हीटिंग चैंबर रिकॉर्डिंग से पहले कम से 30 मिनट पर बारी ।
- coverslip Lck-RCaMP2 और OER-रिकॉर्डिंग चैंबर में GCaMP6f के साथ transfected कोशिकाओं युक्त माउंट और इमेजिंग माध्यम के ४०० μL जोड़ें । कक्ष के शीर्ष पर एक ढक्कन रखें ।
- GCaMP6f और प्रकाश स्रोत (नीले उत्तेजन प्रकाश, उदाहरण के लिए ४७०-४९० एनएम; सामग्री की मेजदेखें) के लिए सेट फिल्टर चुनें । एस्ट्रोसाइटीज व्यक्त OER-GCaMP6f का पता लगाएँ ।
- एक फिल्टर सेट और RCaMP2 के लिए प्रकाश स्रोत चुनें (ग्रीन उत्तेजन प्रकाश, उदाहरण के लिए, 510-560 एनएम; सामग्री की मेजदेखें) और पुष्टि करें कि क्या Lck-RCaMP2 एक ही astrocytes में व्यक्त की है । photoब्लीचिंग को रोकने के लिए प्रकाश स्रोत के लिए लंबे समय जोखिम से बचें ।
- 2 मिनट के लिए 2 हर्ट्ज पर Lck-RCaMP2 की रिकॉर्ड समय चूक छवियों. HDD पर इमेजिंग डेटा सहेजें ।
- GCaMP6f के लिए उस पर फ़िल्टर सेट परिवर्तित करें । दृश्य के एक ही क्षेत्र में OER-GCaMP6f के रिकॉर्ड समय चूक छवियों, 2 मिनट के लिए 2 हर्ट्ज पर. HDD पर डेटा सहेजें ।
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें ।
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रिकॉर्डिंग सहज न्यूरोनल गतिविधि और प्रेरित Ca2 + ंयूरॉंस में ऊंचाई
नोट: न्यूरोनल इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप सेटअप है कि धारा ३.२ में वर्णित के रूप में ही है । यहां, सहज Ca के इमेजिंग2 + Lck-GCaMP6f और Ca2 के कारण ऊंचाई + MGLUR सक्रियण के कारण oer-GCaMP6f से प्रेरित ऊंचाई वर्णित है ।- सहज न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, रिकॉर्डिंग चैंबर में Lck-GCaMP6f को व्यक्त करने और इमेजिंग माध्यम के ४०० μL जोड़ने कोशिकाओं युक्त coverslip माउंट. कक्ष के शीर्ष पर एक ढक्कन रखें ।
- फिल्टर और प्रकाश स्रोत (नीले उत्तेजन, उदा 470-790 एनएम; सामग्री की मेजदेखें) GCaMP6f के लिए उन लोगों के लिए सेट करें । Lck-GCaMP6f व्यक्त ंयूरॉंस का पता लगाएं और सहज गतिविधि दिखा ।
- 2 हर्ट्ज या तेजी से पर छवियों को प्राप्त. HDD पर डेटा सहेजें ।
- छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण करें ।
- प्रेरित Ca2 + उन्नयन रिकॉर्ड करने के लिए, ४०० μl इमेजिंग माध्यम के साथ oer-GCaMP6f व्यक्त कोशिकाओं युक्त coverslips माउंट. कक्ष के शीर्ष पर एक ढक्कन रखें ।
- GCaMP6f के लिए फ़िल्टर सेट का उपयोग करना, ंयूरॉंस व्यक्त OER-GCaMP6f का पता लगाएं ।
- ढक्कन हटा दें । 2 हर्ट्ज या तेजी से समय-चूक रिकॉर्डिंग शुरू करो । रिकॉर्डिंग के दौरान, एक gq के लिए एगोनिस्ट जोड़ें-प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जैसे, mGluR5 एगोनिस्ट [रुपये]-3, 5-dihydroxyphenylglycine [dhpg]) एक Ca 2 का आह्वान करने के लिए+ ईआर से रिहाई ।
- HDD पर समय चूक छवियों को बचाने और डेटा का विश्लेषण ।
Representative Results
lck-RCaMP2 और oer-GCaMP6f HeLa कोशिकाओं में व्यक्त किए गए थे, और दोनों संकेतों को एक साथ छवि विभाजन प्रकाशिकी, 24 h अभिकर्मक के बाद का उपयोग कर दर्ज किया गया (चित्रा 3a और वीडियो 1) । छवियों 10 हर्ट्ज पर अधिग्रहीत किया गया था. हिस्टामाइन (उसकी, 1 μm), जो ईआर से Ca2 + रिहाई लाती, रिकॉर्डिंग के दौरान जोड़ा गया था. अपने आवेदन पर, Lck के संकेत तीव्रता-RCaMP2 और OER-GCaMP6f वृद्धि हुई है, के रूप में ΔF के स्यूडोकलर प्रदर्शन/F0 है, जो प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता से परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है (चित्रा 3B) द्वारा दिखाया गया है । के समय पाठ्यक्रमों सीए2 + ऊंचाई (Δf/F0) lck द्वारा रिपोर्ट-RCAMP2 और Oer-GCaMP6f ब्याज (रॉय) (चित्रा 3c) के एक ही क्षेत्र में तुलना की गई । ΔF/F0 मान अलग अभिव्यक्ति स्तर और वितरण है जो दो अलग GECIs, के बीच समय पाठ्यक्रम तुलना को सक्षम करने के लिए उनके सर्वोच्च मान के लिए सामांयीकृत किए गए थे । दोनों सेंसर एक दोलन की तरह Ca2 + ऊंचाई की सूचना दी । Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f Ca के लिए एक ही समय पाठ्यक्रम दिखाया2 + पांच सेल प्रकार की जांच के बीच दो कोशिकाओं में ऊंचाई (चित्रा 3 सी, रॉय 1 और 3) । हालांकि, Ca2 + उंनयन Lck-RCaMP2 द्वारा दिखाया गया है कि Oer-GCaMP6f (चित्रा 3 सी, रॉय 2, 4, और 5) द्वारा दिखाए की तुलना में एक उच्च स्तर पर बने रहे । परिणाम से संकेत मिलता है कि Ca2 + तरक्की प्लाज्मा झिल्ली के आसपास लंबे समय तक है, जबकि यह ईआर, जो इस Ca2 + संकेत उसकी उत्तेजना से प्रेरित है के आसपास पहले समाप्त हो गया है ।
सहज Ca2 + ंयूरोन-astrocytes से मिश्रित संस्कृति में astrocytes से सिग्नल चूहा हिप्पोकैम्पी (चित्र 4a) और Cortexes (चित्रा 4b) Lck द्वारा दिखाए गए थे-RCaMP2 And oer-GCaMP6f (चित्रा 4, वीडियो 2, वीडियो 3 , वीडियो 4, और वीडियो 5) । Cortical संस्कृतियों जमे हुए स्टॉक है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में तैयार किया गया था से पुनर्जीवित किया गया । lck-RCaMP2 और oer-GCaMP6f संकेतों क्रमिक रूप से एक ही कोशिकाओं से 2 हर्ट्ज पर दर्ज किए गए थे । इस क्षेत्र में तीन रॉइस का चयन किया गया जो प्रत्येक GECI द्वारा Ca2 + उंनयन दिखाया गया है, और Δf/Fआधार के समय पाठ्यक्रम (यानी, प्रतिदीप्ति तीव्रता) पूरी रिकॉर्डिंग अवधि के दौरान औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता से बदल (एफआधार ). जब आधार रेखा प्रतिदीप्ति स्थिर है और ca2 + उंनयन कम लगातार कर रहे हैं, Fआधार Ca2 + ऊंचाई घटनाओं का पता लगाने के लिए एक उपयोगी आधार रेखा बन जाता है । सहज Ca2 + उंनयन केवल astrocytic प्रक्रिया पर दिखाई देते थे, सेल शरीर पर नहीं । इस परिणाम पर पिछले रिपोर्टों के साथ संगत है astrocytic सहज Ca2 + संकेतों द्वारा अन्य gecis में कल्पना13 और vivo14में विट्रो. दोनों हिप्पोकैम्पल और वल्कुट astrocytes में, Ca2 + उंनयन lck-RCaMP2 (ऊपर) द्वारा दिखाए गए oer द्वारा दिखाए गए उन लोगों की तुलना में अधिक अक्सर थे GCaMP6f. यह परिणाम हमारे पिछले प्रदर्शन के साथ संगत है कि सीए2 + एलिकेशंस Lck-GCaMP6f के कारण astrocytes में अधिक बार Oer-GCaMP6f7 के कारण उन लोगों की तुलना में पाया गया और पता चलता है कि इस धारणा पर भी लागू होता है एकल-कक्ष स्तर ।
सहज Ca2 + उंनयन द्वारा lck-GCaMP6f में अपरिपक्व चूहा हिप्पोकैम्पल ंयूरॉंस (10 DIV) 2 हर्ट्ज (चित्रा 5a और 6 वीडियो) में देखा गया । ΔF/F0 के पांच अलग ROIs में समय पाठ्यक्रमों का सुझाव है कि इन सीए2 + उंनयन स्थानीय subcellular डोमेन तक ही सीमित हैं । चित्रा 5B (7 वीडियो) से पता चलता है Ca 2 परिपक्व माउस हिप्पोकैम्पल ंयूरॉंस में प्रतिक्रियाएं+ (30 DIV) oer-GCAMP6F-अभिव्यक्ति aav वैक्टर के साथ संक्रमित । ंयूरॉंस १०० μm dhpg, जो मेटाकोट्रॉपिक ग्लूटोमेट रिसेप्टर्स के लिए एगोनिस्ट है के साथ प्रेरित थे, Ca2 + रिहाई उत्प्रेरण । DHPG-प्रेरित Ca2 + oer के कारण रिलीज-GCaMP6f का पता चला था ।
चित्र 1: झिल्ली-लक्षित GECIs दिखा आरेख । प्लाज्मा झिल्ली के योजनाबद्ध आरेख-लक्षित GECIs (Lck-GCaMP6f और Lck-RCaMP2) और बाहरी ईआर झिल्ली-लक्षित GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
चित्रा 2: हिप्पोकैम्पल और वल्कुट सेल तैयारी, प्लाज्मिड ट्रांसफेक्शन, और aav संक्रमण के लिए फ़्लोचार्ट. सूक्ष्म छवियां प्रतिनिधि, हौसले से मढ़वाया DIV-6 वल्कुट कोशिकाओं (बाएं) और जमे हुए स्टॉक से कोशिकाओं को पुनर्जीवित कर रहे है (सही) । स्केल बार = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: Lck के युगपत इमेजिंग का उदाहरण-RCaMP2 और OER-HeLa कोशिकाओं में GCaMP6f । (क) छवि-विपाटन प्रकाशिकी के साथ सिगनल पृथक्करण का योजनाबद्ध निरूपण । Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f के लिए एक ही क्षेत्र देखने के कैमरे पर एक साथ पेश है । एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग 10 हर्ट्ज पर एक CMOS कैमरा द्वारा अधिग्रहीत वीडियो 1में प्रदान की जाती है, और इस रिकॉर्डिंग के एक फ्रेम एक (दाएँ) पैनल में दिखाया गया है. (ख) Lck-GCaMP2 (ऊपर) और Oer-GCaMP6f (नीचे) के लिए Δf/F0 के छद्म रंग छवियों । हिस्टामाइन (उसका, 1 μM) 0 एस में जोड़ा गया था । (ग) प्रतिनिधि सामान्य Δf/F0 समय पाठ्यक्रम के Lck-GCaMP2 (magenta) और Oer-GCaMP6f (green). डेटा को प्रत्येक प्लॉट के लिए अधिकतम ΔF/F0 मान को सामांयीकृत किया गया था । ग्रे सलाखों के अपने आवेदन के समय का संकेत मिलता है । डेटा एक कस्टम निर्मित सॉफ्टवेयर TI कार्यक्षेत्र15के साथ विश्लेषण किया गया । स्केल बार = ५० μm (माइक्रोस्कोपिक छवि) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: सहज Ca2 + astrocytes में ऊंचाई Lck-RCAMP2 और Oer-GCaMP6f अभिव्यक्ति के लिए निगरानी की । (क) प्रतिनिधि हिप्पोकैम्पल और (ब) कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स lck-RCaMP2 (ऊपर) और ओईआर-GCaMP6f (नीचे) से संक्रमित होते हैं । फ्रोजन स्टॉक संस्कृतियों से Cortical कोशिकाओं को पुनर्जीवित किया गया । Lck-RCaMP2 और OER-GCaMP6f छवियों क्रमिक रूप से एक ही सेल में प्राप्त किया गया, 2 हर्ट्ज पर, एक EM-सीसीडी कैमरा के साथ. बाईं ओर के भूखंड सूक्ष्म प्रतिबिंब में दर्शाए गए रोइस में मापा गया ΔF/Fbase के समय पाठ्यक्रमों को दर्शाते हैं । डेटा TI Workbench के साथ विश्लेषण किया गया. वास्तविक फिल्मों वीडियो 2, वीडियो 3, 4वीडियो, और 5 वीडियोमें प्रदान की जाती हैं । स्केल बार = 20 μm (माइक्रोस्कोपिक छवि) । आधारभूत बहाव वैश्विक Ca2 + स्तर में परिवर्तन कक्ष में सुझाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 5: Ca2 के उदाहरण + lck के साथ ंयूरॉंस में इमेजिंग-GCAMP6F और Oer-GCaMP6f । (क) प्रतिनिधि चूहा हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन्स ने डिव 10 (बाएँ) पर Lck-GCaMP6f को व्यक्त करते हुए और भूखंडों को रोइस (पीले घेरे) में मापा Δf/F0 के समय के पाठ्यक्रमों को दर्शाने वाली छवि (दाएँ) में दर्शाया गया है । समय पाठ्यक्रम में संख्या छवि में रॉय संख्या के अनुरूप है । ध्यान दें कि सीए 2 के लौकिक पैटर्न+ तरक्की ब्याज के विभिंन क्षेत्रों के बीच अलग है । आधारभूत बहाव इस ंयूटन में वैश्विक Ca2 + स्तर में वृद्धि का सुझाव है । (ख) परिपक्व माउस हिप्पोकैम्पल ंयूरॉंस के एक उदाहरण (DIV 30) oer-GCAMP6F अभिव्यक्ति aav वैक्टर (बाएं) से संक्रमित । ΔF/F0 मापा के समय पाठ्यक्रम प्लॉट १०० μM (RS)-3, 5-dihydroxyphenylglycine (DHPG) ग्रे बार द्वारा दिखाए गए समय पर लागू करने के लिए Ca2 + प्रतिक्रिया से पता चलता है । पीले घेरे रोइस की स्थिति दिखाते हैं, जहां समय पाठ्यक्रम प्राप्त किया गया था । छवियों को 2 हर्ट्ज पर एक ठंडा-सीसीडी कैमरा (पैनल ए) या एक EM-सीसीडी कैमरा (पैनल बी) और TI workbench के साथ विश्लेषण के साथ अधिग्रहीत किया गया । स्केल बार = 20 μm (माइक्रोस्कोपिक छवि) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
1 वीडियो: Lck की एक साथ इमेजिंग का उदाहरण-RCaMP2 और OER-HeLa कोशिकाओं में GCaMP6f । प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग 10 हर्ट्ज पर प्राप्त की और चित्रा 3में प्रस्तुत किया. स्केल बार = ५० μm । कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
2 वीडियो: सहज सीए2 + क्षणिक हिप्पोकैम्पल astrocyte में lck-RCaMP2 में मनाया । 2 हर्ट्ज (चित्रा 4a), वीडियो 3के रूप में देखने के एक ही क्षेत्र में दर्ज की गई प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग । स्केल बार = 20 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
3 वीडियो: सहज Ca2 + क्षणिक oer में मनाया-GCaMP6f एक हिप्पोकैम्पल astrocyte में. 2 हर्ट्ज (चित्रा 4a), वीडियो 2के रूप में देखने के एक ही क्षेत्र में प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग प्राप्त की । स्केल बार = 20 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
4 वीडियो: सहज Ca2 + क्षणिक एक वल्कुट astrocyte प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग में lck-RCaMP2 में मनाया 2 हर्ट्ज (चित्रा 4b), वीडियो 5के रूप में देखने के एक ही क्षेत्र में दर्ज की गई. स्केल बार = 20 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
वीडियो 5: सहज Ca2 + क्षणिक एक वल्कुट astrocyte में oer-GCaMP6f में मनाया । 2 हर्ट्ज (चित्रा 4B) पर प्राप्त प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग, वीडियो 4के रूप में देखने के एक ही क्षेत्र में. स्केल बार = 20 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
6 वीडियो: Ca के उदाहरण2 + एक चूहा हिप्पोकैम्पल ंयूरून (10 DIV) में lck द्वारा इमेजिंग-GCaMP6f । 2 हर्ट्ज (चित्रा 5a) पर दर्ज की गई न्यूरोनल Ca2 + संकेतों का उदाहरण. स्केल बार = 20 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
7 वीडियो: Ca2 + रिहाई में एक माउस हिप्पोकैम्पल ंयूरोन (DIV 30) व्यक्त oer-GCaMP6f । न्यूरोनल Ca 2 का उदाहरण+ एक माउस हिप्पोकैम्पल ंयूरोन में दर्ज संकेतों oer के साथ संक्रमित-GCaMP6f अभिव्यक्ति aav वैक्टर (चित्रा 5b) । ंयूरोन १०० μM dihydroxyphenylglycine के साथ उत्तेजित किया गया था (DHPG) 30 एस पर लागू करने के लिए एवोके Ca2 + ईआर से रिहाई । स्केल बार = 20 μm. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
Discussion
विविध जैविक outputs सीए2 + संकेतों द्वारा शुरू कर रहे हैं । Ca2 + एक बहुमुखी intracellular संकेतन दूत है । Ca 2+ संकेतों के लिए विशिष्ट outputs आह्वान एक मौलिक जैविक सवाल किया गया है, और ca 2+ इमेजिंग तकनीकों ca2 की विविधता का वर्णन करने के लिए + संकेतों की आवश्यकता है । वर्तमान में विस्तृत प्रोटोकॉल प्लाज्मा झिल्ली और ईआर पर अलग Ca2 + संकेतों का पता लगाने में सक्षम बनाता है (चित्रा3 और चित्रा 4) और एक सेल के अंदर स्थानीय सीए2 + microdomains (चित्रा 4 और चित्रा 5). यह intracellular Ca2 + संकेतों की विविधता का वर्णन करने के लिए योगदान देता है । सीए2 + संकेतों के लौकिक संकल्प भी प्लाज्मा झिल्ली और ईआर में gecis को लक्षित करने के द्वारा सुधार किया गया था क्योंकि यह ca के तीन आयामी प्रसार के प्रभाव से बचने कर सकते हैं2 + और स्वयं gecis, और यह पता लगाने की क्षमता है बहुत Ca के पल2 + तांता या ca2 + रिहाई, जो झिल्ली पर होता है ।
प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं । उपयोगकर्ताओं को ध्यान में रखना चाहिए कि पता लगाया संकेतों का संकलन है "ca के पल2 + आमद या रिहाई" और "ca2 + मूल ca 2 से बाहर विसरित + स्रोत ", विशेष रूप से बड़े ca के लिए2 + संकेतों. उदाहरण के लिए, हालांकि HeLa कोशिकाओं में उसकी उत्तेजना ईआर से Ca2 + रिहाई, इसके परिणामी Ca2 + सिग्नल न केवल ईआर द्वारा लक्षित oer-GCaMP6f लेकिन यह भी प्लाज्मा-झिल्ली द्वारा लक्षित lck-RCaMP2 (चित्रा 3) का पता लगाया है । एक और सीमा है कि Ca के spatioलौकिक पैटर्न2 + संकेतों के उत्पादन का केवल निर्धारक नहीं हो सकता है ca2 + संकेतों. डाउनस्ट्रीम इफेक्टर प्रोटीन्स (जैसे सीए2 +-आश्रित किनसेस और फॉस्फेट) का वितरण भी एक निर्धारक कारक2हो सकता है । पूरी तरह से intracellular Ca2 + संकेतों को समझाना, बहाव एंजाइम व्यवहार का विश्लेषण, जो इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं है, बिल्कुल आवश्यक है ।
सफल Ca 2 के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक+ इमेजिंग इमेजिंग सेटअप और छवि अधिग्रहण की स्थिति है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अंय लाइव इमेजिंग अध्ययन के लिए । हम पहले से पता चला है कि सीए2 + सेल में प्रतिक्रियाएं अत्यधिक उत्तेजना की अवधि और तीव्रता और छवि अधिग्रहण की स्थिति पर निर्भर कर रहे हैं, जोखिम समय और अधिग्रहण आवृत्ति16सहित । उत्तेजन प्रदीप्ति शक्ति सबसे महत्वपूर्ण कारक है, क्योंकि यह प्रकाश विषाक्तता और GECIs के photoब्लीचिंग पैदा कर सकता है । एक्सपोज़र समय, रिकॉर्डिंग आवृत्ति, उत्तेजन प्रकाश तीव्रता, और रिकॉर्डिंग की अवधि की रिकॉर्डिंग शर्तों प्रयोग के उद्देश्य के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिए । हम सेल के लिए photoब्लीचिंग और photobleaching से बचने के लिए संभव के रूप में ज्यादा के रूप में जोखिम समय और उत्तेजना प्रकाश तीव्रता को कम करने की सलाह देते हैं । रिकॉर्डिंग आवृत्ति और रिकॉर्डिंग की अवधि सीए2 + ब्याज की तरक्की की घटनाओं को कवर करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, लेकिन photoब्लीचिंग और photobleaching से बचने के लिए भी संभव के रूप में कम रखा जाना चाहिए. हम रिकॉर्डिंग आवृत्ति और पहले अवधि को निर्धारित करने और प्रकाश तीव्रता और जोखिम समय का अनुकूलन ताकि GECIs के photoब्लीडिंग कम है की सिफारिश । एक अंय महत्वपूर्ण कारक GECIs के अभिव्यक्ति स्तर है । GECIs एक Ca2 +-buffering प्रभाव के रूप में वे सीए2 +-बाध्यकारी प्रोटीन हैं । इसलिए, overexpression का gecis परिणाम में बफ़रिंग Ca2 +, जो भौतिक रूप से कक्षों के लिए आवश्यक है । GECIs की उच्च मात्रा व्यक्त इमेजिंग कोशिकाओं से बचने के लिए की मात्रा को कम किया जाना चाहिए ।
अंत में, Ca के विच्छेदन 2 एक subcellular संकल्प पर सिग्नल+ intracellular Ca2 + संकेत है कि उत्पादन जैविक घटना का निर्धारण करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक है । इस प्रोटोकॉल को इन संकेतों के बीच विविधता का वर्णन करने के लिए Ca2 + संकेतों के विच्छेदन के लिए एक नई विधि प्रदान करता है । वर्तमान में, यह तकनीक इन विट्रो प्रयोगों के लिए सीमित है । हालांकि, Lck-GCaMP6f पहले से ही में vivo Ca2 + 17चूहों में इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, और oer-GCaMP6f सीमें वीवी मोटर ंयूरॉंस में vivo में ca2 + संकेतों पर नजर रखने की पुष्टि की थी 7 । इसलिए, subcellular डिब्बे में GECIs को लक्षित करने के लिए भविष्य में vivo इमेजिंग में विस्तार किया जा करने की क्षमता है, इस प्रकार सीए2 + विच्छेदन को सक्षम करने में vivo ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह काम निम्नलिखित अनुदानों द्वारा समर्थित है: जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST)/भ्रूण विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए प्रीसरी रिसर्च (PRESTO) (JPMJPR15F8, जापान); विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS)/सहायता में वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), टाकेडा फाउंडेशन । लेखकों ने AAV वैक्टर प्रदान करने के लिए और AAV तैयारी के बारे में निर्देशों के लिए RCaMP2 और आर्थर J.Y. हुआंग और थॉमस McHugh (RIKEN सीबीएस) प्रदान करने के लिए हर्हिको बिटो (टोक्यो विश्वविद्यालय) धंयवाद । लेखक भी वीडियो फिल्माने और संपादन के साथ उनकी मदद के लिए Visualized प्रयोगों के जर्नल में संपादकों का शुक्रिया अदा करना होगा ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
| 0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30 °C. |
| 0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
| 100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250-750 µL and store at -30 °C. |
| 100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20 °C. After thawing, the solution can be maintained at 4 °C for 2 months. |
| 12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
| 18 mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18 mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2-7.6 |
| 2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30 °C. |
| 50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30 °C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
| 70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
| Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
| B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
| B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
| Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
| Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
| Cell strainer | Falcon | #352350 | |
| CO2 incubator | Maintain at 37 °C, 5% CO2. | ||
| Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
| Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
| Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 U/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
| Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
| DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
| DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
| Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1,500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
| Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
| HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
| Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
| Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), ImageJ (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
| Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
| Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
| Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
| Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
| Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
| Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
| Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
| Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
| MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
| Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
| Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
| Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
| Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37 °C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
| Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
| Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
| Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
| Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
| PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
| PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
| Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 U/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
| Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
| Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 U/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
| Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
| Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
| Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
| Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13 cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
| Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
| Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
| Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
| Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |
References
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