Summary
为了观察昆虫的超结构，在研究中提出了扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM，分别为SEM和TEM）的样品制备方案。在SEM中加入Tween 20，以避免样品变形。 荧光显微镜有助于提高TEM的切片精度。
Abstract
本报告描述了扫描和传输电子显微镜观察的样品制备方法，通过制备木钻甲虫、氯磷酸二甲AA和Wang（2012年）的附属物来证明这两种电子显微镜。扫描电子显微镜（SEM）样品制备方案基于样品化学固定、一系列乙醇浴中的脱水、干燥和溅射涂层。通过在固定液和洗涤溶液中加入Tween 20（聚氧乙烯山梨酸盐），在SEM中更干净地清洗了木钻甲虫的昆虫体表面。本研究的透射电子显微镜（TEM）样品制备涉及一系列步骤，包括固定、乙醇脱水、嵌入树脂、使用荧光显微镜定位、切片和染色。修复与Tween 20能够穿透昆虫体壁的木钻甲虫比没有Tween 20更容易，随后更好的固定组织和器官在体内，从而产生清晰的传输电子显微镜观察昆虫感性超结构。此制备的下一步是使用荧光显微镜确定嵌入树脂块中的样品中的昆虫敏菌的位置，以提高目标感镜定位的精度。这提高了切片精度。
Introduction
扫描电子显微镜是许多形态学研究中的重要工具，SEM显示表面结构1，2。透射电子显微镜的吸引力是，它可用于研究纳米尺度上的多种生物结构，从细胞结构和细胞器的超微结构，到大分子复合物和蛋白质的结构。TEM显示内部结构3，4，5。
科洛普特拉是最大的昆虫群，包括大约182个家族和35万种昆虫。大多数的科林托普兰昆虫，特别是木质甲虫，以植物为食，其中许多是森林和果树的重要害虫，对树木造成毁灭性的破坏。目前，基于化学生态学理论的病虫害防治工作已日益受到重视。高效、低毒、无污染信息素控制方法已成为一种有效的方法。昆虫的感性形态学和超微结构研究是昆虫化学生态学研究的重要组成部分。扫描和透射电子显微镜（SEM和TEM分别）对它们的形态学和内部解剖学的研究有很大的效果。然而，在电子显微镜（EM）昆虫样品的制备过程中，观测点的客观性和真实性可能会受到影响。一般来说，昆虫的SEM样品制备需要清洗、组织固定、脱水、转移、干燥和溅射涂层10。由于林甲虫生活的环境复杂，人体表面往往有各种各样的污染物，其附属物往往有许多细长的鼻孔或毛刺。特别是，一些木钻孔机不能从实验室饲养，直接收集在现场，然后放入固定流体，以确保新鲜度，随后在实验室洗涤。如果样品先固定然后清洗，显然要清除碎屑要困难得多，因为谷醛会强烈地将其固定在样品上。Tween 20 是表面活性剂 11、12、13、14，在洗涤过程中起着重要作用，包括降低水的表面张力和提高洗衣表面水的润湿性。在这项研究中，将Tween 20添加到固定溶液和PBS清洁溶液中，以降低液体的表面张力，防止污垢沉积在木质甲虫的体表面，使SEM的车身表面更清洁。
使用TEM，可以对昆虫的不同器官进行切片，以揭示昆虫体内的清晰结构，从而为分析昆虫功能提供依据。当昆虫，如木钻甲虫，是大，其身体壁有相当程度的硬化，所以固定可能无法完全饱和器官组织内的昆虫体内。补间20可以增强污垢的分散和悬浮能力。在这项研究中，Tween 20被添加到固定剂中，以增强固定流体渗透到虫体壁的木刺甲虫，避免表皮11、12、13的变形和坍塌。此外，使用一般的切片技术，很难准确定位不同类型的感菜，特别是对于一些小的森西拉15。本研究在传统TEM样品制备的基础上，结合荧光显微镜和SEM，确定昆虫感菌在嵌入块中的位置，从而提高切片精度。
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Protocol
注意：在使用前，请查阅试剂的材料安全数据表。样品制备过程中使用的几种化学品具有毒性、诱变性、致癌性和/或再毒性。使用个人防护设备（手套、实验室外套、全长裤子和闭趾鞋），在处理样品时在烟罩下工作。
1. SEM 样品制备和成像
- 样品固定和清洁
- 在发生C.卡拉干纳的区域工作，吸引成年人进入田间陷阱，诱饵植物吸引剂，如异磷16。在 0.1 摩尔L-1磷酸盐缓冲盐水 （PBS， pH 7.2）， 2.5% （wt/vol） 谷醛 （非水化 EM 梯度） 和 0.06% （vol/vol） 补间 20 中保存成人C. 卡拉干纳的清洁身体。在周末将样品固定在 4°C。
- 从保鲜液中取出身体，用磷酸盐缓冲液冲洗。使用立体显微镜，取出附属物，并在 0.1 摩尔L-1磷酸盐缓冲盐水 （pH 7.2） 中用 0.06% （vol/vol） 补间 20 （PBST） 超声波清洗它们。清洁 100 s 后，将样品转移到显微镜上，检查其是否清洁。在正常情况下，清洁 400s，以确保样品足够清洁，可以观察且不会损坏。
- 样品脱水、安装和干燥
- 在50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%和100%（全vol/vol）乙醇中连续使用20分钟，使样品脱水。在立体显微镜下，使用碳双面胶带将3个观察表面（背腹和侧侧）分别固定在存根上。请注意，所有观察表面必须保持清洁且无污染。将样品阶段放入含有硅胶干燥剂的培养皿中，为期48小时。
- 溅射涂层和样品插入
- 使用日立 Koki （E-1010） ion 溅射仪，将 MAIN VALVE 旋转到打开位置，拆下样品室盖，并将样品放入腔室。打开电源开关，打开"就绪"指示灯。将溅射时间设置为 45 秒，将涂层厚度设置为 70.875 Ω。一旦机械泵真空表盘指数降至7以下，按"放电"并开始喷洒铂金。在实验结束时，关闭电源并将样品带出腔室。喷涂膜厚度：d = KIVt（"d"是薄膜的厚度，单位为"*";"K" 是一个常数，具体取决于溅射的金属和气体。例如，空气的 K 为 0.07;"I"是等离子体流的单位mA;"V"是"KV"单元中施加的电压。"t"是时间（以秒为单位）。
- 将包含样本的存根插入 SEM 的舞台上。确保带有样本存根的样本阶段具有足够的高度，以允许良好的图像。打开 SEM 软件并选择所需的工作电压，从 20 kV 开始。
2. TEM样品制备和成像
- 如步骤 1.1.1 和 1.1.2 所示，获取并修复示例。
- 清洁、二次固定和脱水
- 从保鲜液中取出成年C.卡拉干纳。使用立体显微镜，取出附属物，在PBST中清洗样品3小时，然后在PBS中用1%（wt/vol）四氧化二氮在PBS中将其固定1小时，在25°C下。在室温下，在50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%和100%（全vol/vol）乙醇下，连续20分钟对样品进行脱水。
- 树脂嵌入和聚合
- 将样品嵌入树脂中，嵌入平面嵌入模具中。样品位于板的底部，并尽可能靠近凹陷槽的边缘。将标签放在空白处，然后在60°C孵育含有样品的板，72小时。从培养箱中取出胶囊，并验证树脂是否聚合。
- 样品切片和染色
- 确保样品已凝固后，将每个树脂块置于荧光显微镜下，并在蓝光下拍摄。移动显微镜的荧光光源，使其从上面照射样品。使树脂块中的感菜清晰可见。拍摄并测量距离以瞄准森西拉（图1）。
- 请参阅掌上心形的SEM图像（图2A），用剃刀刀片大致切割树脂块以关闭目标受体（图2B）。
- 接下来，使用蓝光荧光显微镜，拍摄大致切割的树脂块，从上面调整光源，以便清楚地观察到感理。蓝光激发的绿光创造了一个有利的观察。成像时，将目标微米（DIV 0.01mm）添加到荧光显微镜阶段，然后通过ImageJ软件（美国国家卫生研究院）测量目标的距离（图2C）。图像标尺由 Adobe Photoshop CS5（Adobe 系统公司，加利福尼亚州圣何塞，美国）制作。然后，对于超微缩切片，使用 50-60 nm 切片厚度设置切割距离，直到达到目标位置。使用荧光显微镜精确定位目标受体。
- 将部分安装在 Formvar 涂层的 100 个网状铜网格上，双色与醋酸乙烯和铅酸盐染色。
- 首先，将3.75克醋酸二酯加入50mL的50%甲醇中。在室温下用过滤（0.45 μm）注射器过滤乙酸乙酯饱和溶液10分钟染色的染色网格。在50%甲醇中冲洗2次;2x过滤脱气水。
- 其次，在离心管中加入0.02克铅酸盐，加入10mL的脱气蒸馏水中。加入0.1 mL的10 N氢氧化钠，密封和摇动溶解。使用前使用含铅酸盐溶液的染色网格为8分钟。必须在无二氧化碳的环境中进行染色，以防止碳酸铅沉淀的形成。将污渍滴放在塑料培养皿的方块上。在脱气过滤水中冲洗并干燥17。通过在 80 kV 下运行的 TEM 观察它们。
图1：荧光显微镜拍摄了一个树脂块，包裹着氯磷酸的附属物。（A） 天线树脂块;（B） 排卵器末端的树脂块.箭头指示树脂块的边缘;虚线圆圈表示目标感。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：精确感感定位方法的程序。（A）氯磷酸卡拉干那的上颌触电的第4子段，虚线圆圈显示SEM所针对的感西拉。 （B） 荧光显微镜观察的C. 卡拉干纳上颌电的第四子段。白色箭头显示树脂块的大致切割边缘，虚线圆圈显示准确位置。（C） 从树脂块边缘到上颌触觉目标位置的标记距离（本样品为 28 μm）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Representative Results
使用使用 Tween 20 的清洁和固定溶液，比没有补间 20 的更清洁 SEM 图像（图 3）。补间20固定溶液将谷醛固定溶液渗透到组织中。微管结构清晰可见。没有Tween20（图4），样品内部结构的TEM图像被模糊了。
图3：SEM下氯磷酸卡拉加纳天线上的感突。SEM图像与Tween 20 （A） 和无 Tween 20 （B） 的比较显示，图片 A 比图片 B 一般更干净.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：通过透射电子显微镜观察的氯磷酸二苯基骨在实验室的掌上基本。TEM 图像与 Tween 20 （A） 和无补间 20 （B） 的比较图片 A 的微管结构清晰，而图 B 的微管结构模糊。请点击此处查看此图的较大版本。
我们使用 SEM 来研究C. Caragana的掌上香杉的类型和超结构，发现了 4 种香精，包括 10 种子类型：1 Böhm 的毛刷 （BB.），3 感西拉茶 （Ch.1-Ch.3），1 个三维形感性森西拉 （Dig.） 和 5 个感性辛西拉 twig 基本体 （S.tb.1.s.1.森西拉鉴定和超微结构是基于他们的形态和大小18，19，20，21，22，23。我们的样品制备方法可清晰呈现昆虫感突的表面和内部超结构图像。
| 数量 | 类型 | 长度 （μm）a | 基部 （μm）a | 墙 | 提示 | 插座 | 可爱孔隙 | 分布 |
| 1 | Bb。 | 5.18 × 1.25 | 1.70 ± 0.47 | 光滑 | 尖锐 | 宽 | 不 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 2 | 第1号 | 38.59 × 8.20 | 3.15 ± 0.84 | 槽 | 尖锐 | 宽 | 不 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 3 | 第2次 | 81.54 × 18.07 | 3.75 ± 0.88 | 槽 | 尖锐 | 宽 | 不 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 4 | 第3次 | 282.06 × 22.60 | 6.10 ± 0.70 | 槽 | 尖锐 | 宽 | 不 | 实验室触手 |
| 5 | 挖。 | 24.77 × 2.98 | 1.24 ± 0.32 | 光滑 | 钝 | 宽 | 不 | 上垂触形 |
| 6 | S.tb.1 | 6.51 × 1.01 | 2.31 ± 0.25 | 槽 | 与突起 | 凸起和紧 | 提示孔 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 7 | S.tb.2 | 5.91 ± 0.90 | 2.24 ± 0.30 | 光滑 | 钝 | 凸起和紧 | 提示孔 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 8 | S.tb.3 | 6.84 ± 0.98 | 1.96 ± 0.35 | 光滑 | 与突起 | 凸起和紧 | 提示孔 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 9 | S.tb.4 | 2.21 ± 0.59 | 2.86 × 0.46 | 槽 | 与突起 | 提出 | 提示孔 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
| 10 | S.tb.5 | 1.16 ± 0.29 | 1.05 ± 0.19 | 光滑 | 钝 | 凸起和宽 | 提示孔 | 上颌掌液， 实验室触手可及 |
表1：在C.卡拉加纳的掌上，感性的种类。
为了检查C.卡拉干纳触觉上的超结构，我们使用了TEM。这些研究的一个例子是S.tb.1在上颌面上的钉连续横截面视图。视图显示，树突状护套包围了外树突状段并延伸到尖端孔隙（图 5A-D）。内受体淋巴腔内存在七个未分枝的外树突状段，外腔被外腔包围（图5D）。管状体由树突状护套从每个森西尔耳套底的其他外树突状段分离（图5E）。在纤毛区域，我们注意到8个不同直径的树突，表明存在8个双极神经元。最后，纤细段包含9个外周微管双子（图5F）。
图5：在氯磷酸卡拉干那上30的森西拉类型1型树枝基本尼卡（S.tb.1）的TEM视图。（A. S.tb.1 ， 虚线标记区域靠近图的横截面.B-E.（B） 手指形突起的横截面，显示零散的切口。（C） 手指形突起的基底区域的横截面，显示内受体淋巴腔，无外树突段。（D） 钉的中间区域的横截面，显示树突状护套将森西尔-淋巴腔分为内腔和外腔，内腔内有7个外树突段。（E） 钉的基底区域，显示管状体被树突状护套包围，与外树突状段分离。托莫根细胞形成树突状护套的外侧。（F） 长毛区域的横截面，显示8个不同直径的树突。缩写：bb，基体;cs， 纤毛段;CW，可爱墙;DS， 树突状护套;iRL，内受体淋巴腔;M，微管;米，微维利;oD，外树突状段;oRL，外受体淋巴腔;S.tb.1， 类型 1 型感性树枝基本性;结核病，管状体;TH，科根细胞;TO，托莫根细胞;TR，三角细胞。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文介绍了一种木钻甲虫扫描和透射电子显微镜的样品制备方案。以昆虫附属项为代表研究课题，对传统的样品制备方法进行了一些改进。
从固体表面分离的液体油被乳化成小液滴，小液滴可以很好地分散并悬浮在洗涤介质中，以减少在物体表面的再沉积。表面活性剂的洗涤性能包括所有基本特性，如润湿性、渗透性、乳化特性、分散性、溶解性11、12、13、14等。不同洗涤剂对金线虫电子显微样品制备的影响表明，Tween 20具有最佳的清洁效果，其次是碳酸氢钠和蒸馏水24。在这项研究中，我们发现Tween 20可用于降低液体的表面张力，并防止污垢沉积在昆虫的体表面，特别是直接在田间采集的木甲虫。昆虫体表面在SEM中洗得更干净。用Tween20固定剂更容易穿透昆虫体壁，随后在TEM中更好地固定体内的组织和器官。表面活性剂在电子显微镜制备中的优势已被广泛研究24，25，26，27，28，29，30，31。
此外，我们采用了SEM样品制备的改性空气干燥方法，其中脱水样品被放入含有硅胶干燥剂的培养皿中，逐渐蒸发脱水剂。该方法的最大优点是简单、易于维护，使微环境空气干燥，无需特殊设备。自然干燥法是种子、坚果和昆虫标本长期保存的一种简单、实用、有效的方法。虽然样品体积在自然干燥过程中收缩，但样品的基本形态保留32。一般来说，科洛普特拉昆虫的含水量相对较低，其表面被坚硬的赤丁墙包围。风干能够满足要求。然而，这种干燥方法不适合干燥含水量较大的组织，如虱子、虫子和幼虫，因为表面张力在干燥过程中会变形样品。
为了观察和计算分布在附属项表面的感性的种类和数量，必须考虑附属项的背、腹和侧。一些感性是很少，小，有时覆盖，扫描和仔细观察，从各个角度，以发现那些感性完全突出表皮或产生于抑郁症。由于许多感性是相对长和头发一样，提示效果可以显著。所以，电子显微镜加速度电压不能太高，5-20kV是最好的，我们使用20kV。
在 TEM 样品嵌入中，样品最好靠近平面嵌入模具凹槽的边缘，以便在粗加工树脂块时节省时间。传统的连续切割树脂的TEM方法很广泛，通常使用光学显微镜17、33进行盲目切割。为了改进这一点，我们首先在树脂嵌入块中探索了一种昆虫感构定位技术，使用荧光显微镜来查看和测量到切口的目标距离。与传统的TEM修剪方法相比，该技术可以节省样品制备时间，更准确地定位目标传感器。在没有测量软件的情况下，可以将缩放的标尺放置在视场中，以大致测量目标距离。超微缩物与荧光显微镜相结合，可清晰观察切割过程，从而精确切割靶敏菌和其他适当对象。
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Disclosures
我们没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
我们感谢北京农业职业学院、中国农科院原子能应用研究所、北京林业大学生物研究中心和山根教授的慷慨援助。中国科学院动物学研究所张。该研究得到了国家重点研发项目（2017YFD0600103）、国家自然科学基金（授权号31570643、81774015）、中国公益林科学研究（201504304）、内蒙古农业大学高层次人才研究启动计划（203206038）和内蒙古自治区高等教育研究项目（NJZZ18047）、内蒙古自治区林雪"双一"建设工程（170001）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
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