Summary
For at observere ultrakonstruktion af insektsensilla blev der i undersøgelsen fremlagt en prøveforberedelsesprotokol (SEM og TEM) for at observere ultrakonstruktion af insektsensilla. Tween 20 blev tilsat i fiksativ at undgå prøvedeformation i SEM. Fluorescensmikroskopi var nyttigt til at forbedre udskæringsnøjagtigheden i TEM.
Abstract
Denne rapport beskrev prøvepræparatmetoder, scanning og transmission elektron mikroskop observationer, demonstreret ved at forberede vedhæng af træborebillen, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), for begge typer elektron mikroskopi. Prøveforberedelsesprotokollen (scanningselektronmikroskopi) var baseret på prøvekemisk fiksering, dehydrering i en række ethanolbade, tørring og sputter-belægning. Ved at tilføje Tween 20 (Polyoxyethylen sorbitan laurat) til fiksativ og vask opløsning, insektkroppen overflade træborebille blev vasket mere rent i SEM. Denne undersøgelse's transmission elektron mikroskopi (TEM) prøve forberedelse involveret en række trin, herunder fiksering, ethanol dehydrering, indlejring i harpiks, positionering ved hjælp af fluorescens mikroskopi, skæring, og farvning. Fiksativ med Tween 20 aktiveret trænge ind i insektlegemevæggen af træborebille lettere end det ville have været uden Tween 20, og efterfølgende bedre fast væv og organer i kroppen, således gav klar transmission elektron mikroskop observationer af insekt sensilla ultrastrukturer. Det næste skridt i dette præparat var bestemmelse af placeringen af insekt sensilla i prøven indlejret i harpiksblokken ved hjælp af fluorescensmikroskopi for at øge præcisionen af mål sensilla positionering. Denne forbedrede udskæringnøjagtighed.
Introduction
Scanning elektron mikroskopi er et vigtigt redskab i mange morfologi undersøgelser, at SEM viser overfladestrukturer1,2. Transmission elektron mikroskopi appel er, at det kan bruges til at studere en bred vifte af biologiske strukturer på nanometer skalaen, fra arkitekturen af celler og ultrastruktur af organeller, til strukturen af makromolekylære komplekser og proteiner. TEM viser indre strukturer3,4,5.
Coleoptera er den største gruppe af insekter, herunder omkring 182 familier og 350.000 arter. De fleste af de coleopteran insekter, især træboring bille, foder på planter, hvoraf mange er vigtige skadedyr af skove og frugttræer, forårsager ødelæggende skader på træer6. På nuværende tidspunkt har forebyggelse og bekæmpelse af population af skadedyr baseret på kemisk økologi teori fået stigende opmærksomhed7. Effektive, lavgiftige, forureningsfrie feromonkontrolmetoder er blevet en effektiv måde8. Undersøgelse af sensilla morfologi og ultrastruktur af insekter er en vigtig del af insekt kemisk økologi forskning. Scanningog transmission elektron mikroskopi (SEM og TEM, henholdsvis) bruges med stor effekt til at studere deres morfologi og interne anatomi. Under tilberedningen af insektprøver til elektronmikroskopi (EM) kan observationsstedets objektivitet og ægthed dogpåvirkes 9. Generelt kræver fremstilling af SEM-prøve af insekter rengøring, vævsfiksering, dehydrering, metastese, tørring og sputter-belægning10. På grund af det komplekse miljø, hvor træborebille lever, kroppens overflade ofte har forskellige forurenende stoffer og deres vedhæng ofte har mange fine lange sensilla eller børster. Især er nogle træborere ikke tilgængelige fra laboratorieforøgelse, som indsamles direkte i marken, og derefter sættes i fastgørelsesvæske for at sikre friskhed og efterfølgende vasket i laboratoriet. Hvis prøven først er fast og derefter vasket, naturligvis er det meget vanskeligere at fjerne snavs, fordi glutaraldehyd kraftigt løser det til prøven. Tween 20 er et overfladeaktivt11,12,13,14, som spiller en vigtig rolle i vasken, herunder at reducere overfladespændingen af vand og forbedre vådheden af vand på overfladen af vasketøjet. I denne undersøgelse blev Tween 20 tilføjet til fastgørelsesopløsningen og PBS rengøringsopløsningen for at reducere væskens overfladespænding og forhindre snavsi at deponere på borebillens karrosserioverflade, hvilket gjorde kroppens overflade renere i SEM.
Ved hjælp af TEM, sensilla på forskellige organer af insekter kan skæres til at afsløre de klare strukturer inde i dem, hvilket giver et grundlag for at analysere sensilla funktioner. Når emnet insekt, såsom træborebille, er stor, og dens krop væg har en betydelig grad af skleroficering, så fiksativ kan ikke fuldt mætte organvæv inde i insektkroppen. Tween 20 kan forbedre spredningog suspension kapacitet af snavs. I denne undersøgelse, Tween 20 blev tilføjet til fiksativ at forbedre fiksativ væske indtrængning i insektlegeme væggen af træborebille, undgå deformation og sammenbrud af epidermi11,12,13. Hertil kommer, ved hjælp af generelle udskæring teknologi, er det vanskeligt præcist at finde forskellige typer af sensilla, især for nogle små sensilla15. Baseret på traditionelle TEM prøve forberedelse, denne undersøgelse kombineret fluorescens mikroskopi og SEM at bestemme placeringen af insekt sensilla i indlejret blok, og dermed forbedre udskæring nøjagtighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIGTIG: Se reagensarkne for materialesikkerhed, før de anvendes. Flere af de kemikalier, der anvendes under prøvepræparatet, er giftige, mutagene, kræftfremkaldende og/eller reprotoksiske. Brug personlige værnemidler (handsker, laboratoriekittel, bukser i fuld længde og sko med lukket tå) og arbejd under en røghætte, mens prøven håndteres.
1. FREMSTILLING og billedbehandling af SEM-prøver
- Prøvefiksering og rengøring
- Arbejde i et område, hvor C. caragana forekomme, tiltrække voksne i feltfælder lokkemad med plante tiltrækkende stoffer, såsom isophorone16. Bevar rene kroppe af voksen C. caragana i 0,1 mol L-1 fosfat-buffered saltvand (PBS, pH 7,2), 2,5% (wt /vol) glutaraldehyd (Anhydrous EM Grad), og 0,06% (vol/vol) Tween 20. Prøven rettes ved 4 °C i løbet af weekenden.
- Fjern kroppene fra konserveringsvæsken og skyl i fosfatbufferen. Ved hjælp af et stereomikroskop skal du fjerne vedhæng og rengøre dem ultralyd (40 kHz) i en 0,1 mol L-1 fosfatbuffered saltvand (pH 7.2) med 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST). Efter rengøring i 100 s overføres prøven til mikroskopet for at kontrollere, om den var ren. Under normale omstændigheder skal prøven rengøres i 400'erne for at sikre, at prøven var ren nok til at observere og ikke beskadiget.
- Prøve dehydrering, montering og tørring
- Dehydrere prøverne ved hjælp af 20 min successive behandlinger i 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, og 100% (alle vol / vol) ethanol. Under et stereomikroskop skal du bruge co2 dobbeltsidet tape til separat at fastgøre 3 observationsflader (dorsale ventrale og laterale) på stubbe. Bemærk, at alle visningsflader skal holdes rene og fri for kontaminering. Prøvefasen anbringes i en petriskål, der indeholder et silicageltørremiddel i 48 timer.
- Sputter-coat og prøve indsættelse
- Brug Hitachi Koki (E-1010) ion sputtering instrument, rotere hovedventilen til OPEN position, fjerne prøven kammerdækslet, og sætte prøven i kammeret. Tænd for tænd/sluk-kontakten, og READY-lampen var tændt. Indstil sputtering tid som 45 sekunder, og belægning tykkelse som 70.875 Å. Når mekanisk pumpe vakuum dial indeks faldt til under 7, tryk udledning og begynde at sprøjte platin. Når eksperimentet er afsluttet, skal du slukke for strømforsyningen og tage prøven ud af kammeret. Spray film tykkelse: d = KIVt ("d" er tykkelsen af filmen i enheden af " Å "; " K" er en konstant, afhængigt af sputtered metal og gas. For eksempel er K af luft 0,07; "I" er enheden mA af plasma flow; "V" er den spænding, der påføres i enheden "KV". "t" er tid på få sekunder.
- Sæt stuben med prøven på SEM-stadiet. Sørg for, at prøvefasen med prøvestubben havde tilstrækkelig højde til at tillade et godt billede. Åbn SEM-softwaren, og vælg en ønsket driftsspænding, der begynder ved 20 kV.
2. TEM-prøveforberedelse og -billeddannelse
- Prøven hentes og fastgør ser som i trin 1.1.1 og 1.1.2.
- Rengøring, sekundær fiksering og dehydrering
- Fjern voksen C. caragana fra konserveringsvæsken. Ved hjælp af et stereomikroskop skal du fjerne vedhæng, vaske prøverne i PBST i 3 timer og derefter post-fixe dem i 1% (wt/vol) osmiumtroxid i PBS i 1 time ved 25 °C. Dehydrere prøverne ved hjælp af 20 min successive behandlinger i 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, og 100% (alle vol / vol) ethanol ved stuetemperatur.
- Harpiks Indlejring og polymerisering
- Prøverne antages i harpiks i flade indlejringsforme. Prøven var i bunden af pladen og blev placeret så tæt som muligt på kanten af den forsænkede rille. Etiketten anbringes i det tomme, og inkuber derefter pladen, der indeholder prøven, ved 60 °C i 72 timer. Kapslen fjernes fra rugemaskinen, og kontroller, at harpiksen havde polymeriseret.
- Prøveskæring og farvning
- Når det var sikret, at prøven var blevet størknet, skal hver harpiksblok placeres under et fluorescensmikroskop og fotograferdem under blåt lys. Flyt mikroskopets fluorescerende lyskilde, så det bestrålede prøven ovenfra. Gør det muligt at observere sensillaen i harpiksblokken. Fotograferede og måle afstande til at målrette sensilla(figur 1).
- Se SEM-billedet af palps (figur 2A), og skær omtrent harpiksblokken med et barberblad for at lukke målreceptoren (figur 2B).
- Dernæst ved hjælp af blå lys fluorescens mikroskopi, fotografere groft skåret harpiks blok, justere lyskilden ovenfra, således at sensilla blev observeret klart. Grønt lys ophidset af det blå lys skabt en gunstig observation. Ved billedbehandling blev det objektive mikrometer (DIV 0.01mm) føjet til fluorescensmikroskopstadiet, og derefter blev målets afstand målt af ImageJ-software (U.S. National Institute of Health) (figur 2C). Billedlinealen er lavet af Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Derefter, for ultramicrotome udskæring, indstille skærelængde, ved hjælp af 50-60 nm skive tykkelser, indtil målet position blev nået. Brug fluorescensmikroskopi til at lokalisere målreceptoren.
- Monter sektionerne på Formvar-belagte, 100-mesh kobbernet, dobbeltplettet med uranylacetat og blycitrat.
- For det første tilsættes 3,75 g uransylacetat til 50 ml 50 % methanol. Pletgitre med en filtreret (0,45 μm) sprøjte af en mættet opløsning af uranylacetat ved stuetemperatur i 10 min. Dæksektioner under farvning for at blokere lysinducerede bundfald. Skyl 2x i 50 % methanol 2x filtreret afgasset vand.
- For det andet tilsættes 0,02 g blycitrat til 10 ml afgasset destilleret vand i centrifugerør. Tilsæt 0,1 ml 10 N natriumhydroxid, tætning og ryst for at opløse. Pletgitre med en opløsning af blykasse tærsomt i 8 min. Centrifuge før brug. Farvning skal ske i et kuldioxidfrit miljø for at forhindre dannelse af blykarbonatbundbunds. Placer dråber af plet på kvadrater af plast petriskåle. Skyl i afgasset filtreret vand og tør17. Overhold dem via TEM, der opererer ved 80 kV.
Figur 1: Et fluorescerende mikroskop fotograferede en harpiksblok, der omslutter appenmfom af Klorophorus caragana. (A) Antenne harpiks blok; B) Harpiksblok for enden af ovipositoren. Pilen indikerede kanten af harpiksblokken. prikket cirkel angiver målet sensilla. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Procedurer for den præcise sensillalokaliseringsmetode. (A)Det fjerde delsegment af en maxillary palp af Chlorophorus caraganaviste den stiplede cirkel den sensilla, som SEM.(B)det fjerde undersegment af en maxillary palp af C. caragana set ved fluorescensmikroskopi. Hvid pil viste den groft afskårne kant af harpiksblokken, og den prikkede cirkel viste den nøjagtige placering. C) Den mærkede afstand fra harpiksblokkens kant til maxillary palp-målpositionen (28 μm i denne prøve). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af rengørings- og fiksativ opløsning med Tween 20 blev der observeret renere SEM-billede end uden Tween 20 (figur 3). Tween 20 fastgørelsesopløsningtrængte glutaraldehydfastgørelsesopløsningen ind i vævet. Microtubule struktur blev tydeligt set. TEM-billedet af prøvens interne struktur blev sløret uden Tween 20 (figur 4).
Figur 3: Sensillaen, der lokaliserer på antennen af Chlorophorus caragana under SEM. Sammenligning af SEM-billede med Tween 20 (A) og uden Tween 20 (B), som viste, at billede A er renere end billede B generelt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Klorophorus caragana set af transmission elektron mikroskopi af sensilla twig basiconica på labial palps. Sammenligning af TEM-billede med Tween 20 (A) og uden Tween 20 (B). Microtubule struktur af billede A er klar, mens billedet B er sløret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Vi brugte SEM til at studere de typer og ultrastrukturer af sensilla på palps af C. caragana, finde 4 typer af sensilla herunder 10 undertyper: 1 Böhm's børster (BB.), 3 sensilla chaetica (Ch.1-Ch.3), 1 digitiform sensilla (Dig.), og 5 sensilla twig basiconica (S.tb.1-S.tb.5) (Tabel 1). Sensilla identifikation og ultrastruktur var baseret på deres morfologi og størrelse18,19,20,21,22,23. Vores prøveforberedelsesmetoder gengivede klare billeder af overfladerne og de interne ultrastrukturer af insektsensillen.
| Antallet | Type | Længde (μm)a | Diameter ved bund (μm)a | Væg | Tip | Stikket | Kutikulære porer | Distribution |
| 1 | Bb. | 5,18 ± 1,25 | 1,70 ± 0,47 | Glat | Skarpe | Bred | Nej | maxillary palp, labial palp |
| 2 | Ch.1 | 38,59 ± 8,20 | 3,15 ± 0,84 | Rillede | Skarpe | Bred | Nej | maxillary palp, labial palp |
| 3 | Ch.2 | 81,54 ± 18,07 | 3,75 ± 0,88 | Rillede | Skarpe | Bred | Nej | maxillary palp, labial palp |
| 4 | Ch.3 | 282,06 ± 22,60 | 6.10 ± 0,70 | Rillede | Skarpe | Bred | Nej | labial palp |
| 5 | Grave. | 24,77 ± 2,98 | 1.24 ± 0,32 | Glat | Stump | Bred | Nej | maxillary palp |
| 6 | S.tb.1 | 6,51 ± 1,01 | 2,31 ± 0,25 | Rillede | Med fremspring | Hævet og stram | Tip pore | maxillary palp, labial palp |
| 7 | S.tb.2 | 5.91 ± 0,90 | 2,24 ± 0,30 | Glat | Stump | Hævet og stram | Tip pore | maxillary palp, labial palp |
| 8 | S.tb.3 | 6.84 ± 0,98 | 1,96 ± 0,35 | Glat | Med fremspring | Hævet og stram | Tip pore | maxillary palp, labial palp |
| 9 | S.tb.4 | 2,21 ± 0,59 | 2,86 ± 0,46 | Rillede | Med fremspring | Rejst | Tip pore | maxillary palp, labial palp |
| 10 | S.tb.5 | 1,16 ± 0,29 | 1.05 ± 0,19 | Glat | Stump | Hævet og bred | Tip pore | maxillary palp, labial palp |
Tabel 1: Typer af sensilla på palps af C. caragana.
For at undersøge ultrastrukturen inde i sensilla på C. caragana palps, brugte vi TEM. Et eksempel på disse undersøgelser var kontinuerlig tværsnitsvisning af pind af S.tb.1 på maxillary palps. Synspunkterne viste, at dendritiske kappe omringede de ydre dendritiske segmenter og forlænget indtil spidsen pore (Figur 5A-D). Syv uforgrenede ydre segmenter eksisterede inde i den indre receptor lymfehulen, som var omgivet af en ydre hulrum (Figur 5D). Rørkroppen blev adskilt af en dendritisk kappe fra andre ydre dendritiske segmenter ved hver sillarsoklebase (figur 5E). I cilierregionen bemærkede vi 8 dendritter af forskellige diametre, hvilket indikerer tilstedeværelsen af 8 bipolare neuroner. Endelig indeholdt ciliærsegmentet 9 perifere mikrotubuledoubleter (figur 5F).
Figur 5: TEM visninger af sensilla type 1 kvist basiconica (S.tb.1) på en Klorophorus caragana maxillary palp30. A) S.tb.1 med punkterede linjer, der markerer områder tæt på tværsnittet for Figs. B-E. (B) Tværsnit af fingerformede fremspring, der viser spredt cuticula. (C) Tværsnit i den basale region af fingerformede fremspring, der viser indre receptorlymfehuler uden ydre dendritiske segmenter. (D) Tværsnit i den midterste del af pinden, der viser dendritiske kappe, der deler sensillum-lymfehulen i både indre og ydre hulrum med 7 ydre dendritiske segmenter i det indre hulrum. (E) Basal område af pinden viser rørformede krop omgivet af en dendritisk kappe og adskilt fra ydre dendritiske segmenter. En tormogencelle danner ydersiden af dendologi. F) tværsnit i ciliere regionen med 8 dendritter med forskellige diametre. Forkortelser: bb, basal krop; cs, ciliere segment; CW, cutikulær væg; DS, dendritisk kappe; iRL, indre receptor lymfehulrum; M, microtubule; Mi, mikrovilli; oD, ydre dendritiske segment; oRL, ydre receptor lymfehulrum; S.tb.1, type 1 sensilla kvist basiconica; TB, rørformet krop; TH, thecogencelle; TO, tormogen celle; TR, trichogen celle. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterede vi en prøve forberedelse sordning for scanning og transmission elektron mikroskopi for træborebille. Ved hjælp af insektvedhæng som et repræsentativt studieemne viste vi flere forbedringer i forhold til traditionelle prøvepræparatmetoder.
Den flydende olie, der adskilles fra den faste overflade, emulgeres til små dråber, som kan spredes godt og suspenderes i vaskemediet for at reducere gendeponeringpå objektets overflade. Vask ydeevne overfladeaktive omfatter alle de grundlæggende egenskaber såsom befugtning, permeabilitet, emulgering ejendom, dispersibility, opløselighed11,12,13,14. Virkningerne af forskellige rengøringsmidler på elektronmikroskopiske prøver forberedelse af Gyldne Nematode viste, at Tween 20 havde den bedste rengøringseffekt, efterfulgt af natriumbikarbonat, og destilleret vand24. I denne undersøgelse fandt vi, at Tween 20 kan bruges til at reducere overfladen spænding af væsken, og forhindre snavs fra deponering på kroppens overflade af insektet, især for træborebille indsamlet direkte i marken. Insektkropsoverflade blev vasket mere rent i SEM. Fiksativ med Tween 20 trængte lettere ind i insektlegemevæggen og efterfølgende bedre faste væv og organer i kroppen i TEM. Fordelen ved overfladeaktive stoffer i elektronmikroskopiprøvepræparat er blevet grundigt undersøgt24,25,26,27,28,29,30,31.
Vi vedtog også en modificeret lufttørringsmetode til fremstilling af SEM-prøver, hvor den dehydrerede prøve blev anbragt i en petriskål, der indeholder et silicageltørremiddel, der gradvist fordamper dehydreringsmidlet. Den største fordel ved denne metode er, at den er enkel, let vedligeholdt, og det holder mikromiljøet luft tør og intet særligt udstyr, der kræves. Den naturlige tørringsmetode er en enkel, praktisk og effektiv metode til frø, møtrik og langsigtet konservering af insektprøver. Selv om prøvevolumenet krymper under den naturlige tørringsproces, bevares prøvens grundlæggende morfologi32. Generelt har Coleoptera insekter relativt lavt vandindhold, og deres overflade er omgivet af hårde chitin vægge. Lufttørrer er i stand til at opfylde kravene. Denne tørringsmetode er dog ikke egnet til tørring af væv med et stort vandindhold, såsom lus, mider og larver, fordi overfladespændingen vil deformere prøven under tørringsprocessen.
For at observere og beregne typen og antallet af sensilla, der er fordelt over overfladen af vedhæng, ryg, ventral og lateral af vedhæng, skal overvejes. Nogle sensilla var få, små, og undertiden dækket, scanne og observere omhyggeligt fra alle vinkler for at finde disse sensilla fuldt fremspringende epidermis eller som følge af depression. Da mange sensilla var relativt lange og hårlignende, kan spidsen effekt være betydelig. Så elektronmikroskop acceleration spænding må ikke være for høj, 5-20kV var bedst, og vi brugte 20kV.
I TEM-prøven smlukker prøven bedre tæt på kanten af den flade indlejring skimmelrer groovefor at spare tid, når skrub harpiks blok. Den traditionelle TEM metode tilløbende at skære harpiksen er omfattende, og det er normalt blindt skåret ved hjælp af et optisk mikroskop17,33. For at forbedre dette, vi først udforsket en insekt sensilla lokalisering teknik i harpiks-indlejrede blokke ved hjælp af fluorescens mikroskopi til at se og måle målet afstand til snittet. Sammenlignet med den traditionelle TEM-trimningsmetode kan denne teknologi spare prøveforberedelsestiden og mere præcist finde målsensoren. I mangel af målesoftware kan en skaleret lineal placeres i synsfeltet for groft at måle målafstanden. Kombinationen af et ultramikrotomme med et fluorescensmikroskop giver klare observationer af skæringsprocessen, hvilket giver nøjagtige nedskæringer i målsensillen og andre relevante emner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Vi sætter pris på den generøse bistand fra Beijing Vocational College of Agriculture, Institut for Anvendelse af Atomenergi (Kinesisk Academy of Agricultural Science), Bioresearch Center i Beijing Skovbrug University og professor Shan-gan Zhang fra Institut for Zoologi, Kinesisk Videnskabsakademi. Denne forskning blev støttet af National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Skovvidenskabelig forskning i Kinas offentlige velfærd (201504304), Indre Mongoliet Agricultural University High-level Talent Research Startup Plan (203206038), og Indre Mongoliet autonome region videregående uddannelse Forskningsprojekt (NJZZ18047), Indre Mongoliet autonome region Linxue "Double First-class" Construction Project (170001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , Springer. 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , Cambridge University Press. Cambridge. 1 (2003).
