Summary
For å observere ultrastruktur av insektssensilla, skanning og overføring elektron mikroskopi (SEM og TEM, henholdsvis) prøveforberedelse protokoll ble presentert i studien. Tween 20 ble lagt inn i fikserende for å unngå prøvedeformasjon i SEM. Fluorescence mikroskopi var nyttig for å forbedre kutting nøyaktighet i TEM.
Abstract
Denne rapporten beskrev eksempelforberedelsesmetoder som skanner og overføreelektronmikroskopobservasjoner, demonstrert ved å forberede vedlegg av trebeleiningsboblen, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), for begge typer elektronmikroskopi. Skanningelektronmikroskopi (SEM) prøveforberedelsesprotokollen var basert på prøvekjemisk fiksering, dehydrering i en serie etanolbad, tørking og sputter-belegg. Ved å legge Tween 20 (Polyoxyehylene sorbitan laurate) til fikserende og vaskeløsningen, ble insektkroppsoverflaten av trebetebille vasket rent i SEM. Denne studiens transmisjonselektronmikroskopi (TEM) prøveforberedelse involverte en rekke trinn, inkludert fiksering, etanoldehydrering, innebygging i harpiks, posisjonering ved hjelp av fluorescensmikroskopi, snitting og farging. Fikserende med Tween 20 aktivert trenge insektkroppen veggen av treboring bille lettere enn det ville ha vært uten Tween 20, og senere bedre faste vev og organer i kroppen, dermed gitt klar overføring elektron mikroskop observasjoner av insekt sensilla ultrastructures. Det neste trinnet i dette preparatet var å bestemme posisjonene til insektssensilla i prøven innebygd i harpiksblokken ved hjelp av fluorescensmikroskopi for å øke presisjonen til målsensilla posisjonering. Denne forbedrede kuttingnøyaktigheten.
Introduction
Skanning elektronmikroskopi er et viktig verktøy i mange morfologistudier, at SEM viser overflatestrukturer1,2. Transmisjonelektronmikroskopi appell er at den kan brukes til å studere et bredt spekter av biologiske strukturer på nanometerskalaen, fra arkitekturen av celler og ultrastrukturen av organeller, til strukturen av makromolekylære komplekser og proteiner. TEM viser indre strukturer3,4,5.
Coleoptera er den største gruppen insekter, inkludert om lag 182 familier og 350.000 arter. De fleste av coleopteran insekter, spesielt trebeleielse bille, mate på planter, hvorav mange er viktige av skog og frukttrær, forårsaker ødeleggende skade på trær6. I dag har forebygging og kontroll av basert på kjemisk økologiteori fått økende oppmerksomhet7. Effektive, lavgiftige, forurensningsfrie feromonkontrollmetoder har blitt en effektiv måte8. Å studere sensilla morfologi og ultrastruktur av insekter er en viktig del av insektkjemisk økologiforskning. Skanning og overføring elektron mikroskopi (SEM og TEM, henholdsvis) brukes til stor effekt for å studere deres morfologi og indre anatomi. Under utarbeidelse av insektprøver for elektronmikroskopi (EM) kan imidlertid objektiviteten og ektheten av observasjonsstedet påvirkes9. Generelt krever SEM-prøvefremstilling av insekter rengjøring, vevfiksering, dehydrering, metatese, tørking og sputter-belegg10. På grunn av det komplekse miljøet der trebeleielsesbille lever, har kroppsoverflaten ofte ulike forurensende stoffer, og deres vedlegg har ofte mange fine lange sensilla eller bust. Spesielt er noen treborere ikke tilgjengelige fra laboratorieheving, som samles direkte i feltet, og deretter satt i festevæske for å sikre friskhet og deretter vasket i laboratoriet. Hvis prøven først er fast og deretter vasket, er det åpenbart mye vanskeligere å fjerne rusk fordi glutaraldehyd løser det sterkt til prøven. Tween 20 er en overflateaktivt11,12,13,14, som spiller en viktig rolle i vaskeprosessen, inkludert å redusere overflatespenningen av vann og forbedre fuktbarheten av vann på overflaten av vaskeriet. I denne studien ble Tween 20 lagt til festeløsningen og PBS rengjøringsløsning for å redusere væskeens overflatespenning, og forhindre at smusset avponerer på trehusboblens kroppsoverflate, noe som gjorde kroppsoverflaten renere i SEM.
Ved hjelp av TEM kan sensilla på forskjellige organer av insekter kuttes for å avsløre de klare strukturene inni dem, og dermed gi grunnlag for å analysere sensilla-funksjoner. Når motivet insekt, som trebeleielse bille, er stor, og dens kroppsvegg har en betydelig grad av sclerotization, slik at fiksering kan ikke fullt ut mette organvev inne i insektkroppen. Tween 20 kan forbedre spredning og suspensjon kapasitet av smuss. I denne studien ble Tween 20 lagt til fikserende for å forbedre fikserende væskepenetrasjon i insektlegemeveggen til trebeleiningsbille, unngå deformasjon og kollaps av epidermi11,12,13. I tillegg, ved hjelp av generell kuttteknologi, er det vanskelig å nøyaktig finne ulike typer sensilla, spesielt for noen små sensilla15. Basert på tradisjonell TEM-prøveforberedelse kombinerte denne studien fluorescensmikroskopi og SEM for å bestemme plasseringen av insektssensilla i den innebygde blokken, og dermed forbedre kuttnøyaktigheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FORSIKTIG: Se de materielle sikkerhetsdatabladene til reagensene før du bruker dem. Flere av kjemikaliene som brukes under prøvetilberedning er giftige, mutogene, kreftfremkallende og/eller reprotoksiske. Bruk personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk, bukser i full lengde og lukkede tåsko) og arbeid under en røykhette mens du håndterer prøven.
1. SEM Prøve forberedelse og bildebehandling
- Eksempel på fiksering og rengjøring
- Arbeide i et område der C. caragana oppstår, tiltrekke voksne i feltfeller baited med plante attractants, som isofhorone16. Bevar rene kropper av voksen C. karagana i 0,1 mol L-1 fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,2), 2,5 % (wt/vol) glutaraldehyd (Anhydrous EM Grad) og 0,06 % (vol/vol) Tween 20. Fest prøven ved 4 °C i løpet av helgen.
- Fjern kroppene fra bevaringsvæsken og skyll i fosfatbuffer. Bruk et stereomikroskop, fjern vedleggene og rengjør dem ultrasonisk (40 kHz) i en 0,1 mol L-1 fosfatbufret saltvann (pH 7,2) med 0,06% (vol / vol) Tween 20 (PBST). Etter rengjøring i 100 s, overføre prøven til mikroskopet for å sjekke om den var ren. Under normale omstendigheter, rengjør i 400s for å sikre at prøven var ren nok til å observere og ikke skadet.
- Eksempel dehydrering, montering og tørking
- Dehydrere prøvene ved hjelp av 20 min påfølgende behandlinger i 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, og 100% (alle vol / vol) etanol. Under et stereomikroskop bruker du karbondobbeltsidig tape for å strikke 3 observasjonsoverflater separat (dorsal ventral og lateral) på stubs. Vær oppmerksom på at alle visningsflater må holdes rene og fri for forurensning. Plasser prøvestadiet i en petriskål som inneholder en silikageltørkemiddel i 48 timer.
- Sputter-coat og prøveinnsetting
- Bruk Av Hitachi Koki (E-1010) ion sputtering instrument, roter hovedventilen til åpen posisjon, fjern prøvekammerdekselet, og sett prøven i kammeret. Sett på STRØMbryteren, og KLAR-lampen var på. Sett Sputtering tid som 45 sekunder, og belegg tykkelse som 70.875 Å. Når mekanisk pumpe vakuumskiveindeks falt under 7, trykker du på DISCHARGE og begynner å sprøyte platina. På slutten av eksperimentet, slå av strømforsyningen og ta prøven ut av kammeret. Spray film tykkelse: d = KIVt ("d" er tykkelsen på filmen i enheten av " Å "; " K" er en konstant, avhengig av sputtered metall og gass. For eksempel er K av luft 0,07; "I" er enheten mA av plasmaflyt; "V" er spenningen som brukes i enheten "KV". "t" er tid i sekunder.
- Sett inn stubben som inneholder prøven på scenen i SEM. Kontroller at prøvestadiet med prøvestubben hadde nok høyde til å tillate et godt bilde. Åpne SEM-programvaren, og velg ønsket driftsspenning fra 20 kV.
2. TEM Prøve Forberedelse og Bildebehandling
- Få tak i og løs eksemplet som i trinn 1.1.1 og 1.1.2.
- Rengjøring, sekundær fiksering og dehydrering
- Fjern voksen C. caragana fra bevaringsvæsken. Bruk et stereomikroskop, fjern vedleggene, vask prøvene i PBST i 3 timer, og etter fiks dem i 1% (wt / vol) osmiumtetroksid i PBS i 1t ved 25 °C. Dehydrere prøvene ved hjelp av 20 min påfølgende behandlinger i 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, og 100% (alle vol / vol) etanol ved romtemperatur.
- Harpiks Innebygging og polymerisering
- Bygg inn prøvene i harpiks i en flat innebygging former. Prøven var nederst på platen og ble plassert så nært som mulig til kanten av det innfelte sporet. Plasser etiketten i det tomme og inkuber platen som inneholder prøven ved 60 °C i 72 timer. Fjern kapselen fra inkubatoren og kontroller at harpiksen hadde polymerisert.
- Eksempel på snitting og farging
- Når du har sørget for at prøven var størknet, plasserer du hver harpiksblokk under et fluorescensmikroskop og fotograferer dem under blått lys. Flytt mikroskopets fluorescerende lyskilde slik at den bestrålte prøven ovenfra. Gjør det mulig å observere sensilla i harpiksblokken tydelig. Fotografert og mål avstander for å målrette sensilla (Figur 1).
- Se SEM-bilde av palper (Figur 2A), og kutt omtrent harpiksblokken med et barberblad for å lukke målreseptoren (Figur 2B).
- Deretter, ved hjelp av blålett fluorescensmikroskopi, fotograferer du den grovt kuttede harpiksblokken, justerer lyskilden ovenfra slik at sensillaen ble observert tydelig. Grønt lys begeistret av det blå lyset skapte en gunstig observasjon. Når bildebehandling, objektive mikrometer (DIV 0.01mm) ble lagt til fluorescens mikroskop scenen, og deretter avstanden til målet ble målt av ImageJ programvare (US National Institute of Health) (Figur 2C). Bildelinjalen ble laget av Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Deretter, for ultramicrotome slicing, sette skjæreavstanden, ved hjelp av 50-60 nm skive tykkelser, til målposisjonen ble nådd. Bruk fluorescensmikroskopi for å finne målreseptoren.
- Monter seksjonene på Formvar-belagte kobbergitter med 100 mesh, dobbeltfarget med uranylacetat og blysitrat.
- For det første tilsett 3,75 g uranylacetat til 50 ml 50 % metanol. Flekkgitter med en filtrert (0,45 μm) sprøyte av en mettet løsning av uranylacetat ved romtemperatur i 10 min. Dekkseksjoner under farging for å blokkere lysinduserte utfellinger. Skyll 2x i 50 % metanol; 2x filtrert avgasset vann.
- For det andre, tilsett 0,02 g blysitrat til 10 ml avgasset destillert vann i sentrifugerør. Tilsett 0,1 ml 10 N natriumhydroksid, forsegle og rist for å oppløses. Flekkgitter med en løsning av blysitrat i 8 min. Sentrifuge før bruk. Farging må gjøres i et karbondioksidfritt miljø for å forhindre dannelse av blykarbonatutfellinger. Plasser dråper flekk på firkanter av plastpetriretter. Skyll i avgassert filtrert vann og tørk17. Vær oppmerksom på dem via TEM som opererer ved 80 kV.
Figur 1: Et fluorescerende mikroskop fotografert en harpiksblokk som omslutter vedlegget til Chlorophorus-karaganaen. (A) Antenne harpiks blokk; (B) Harpiks blokk på slutten av ovipositor. Pilen indikerte kanten av harpiksblokken; stiplet sirkel indikerer målet sensilla. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Prosedyrer for den nøyaktige sensilla plasseringsmetoden. (A) Det fjerde undersegmentet av en maksillær palp av Chlorophorus caragana,den stiplede sirkelen viste sensilla målrettet av SEM. (B) Den fjerde undersegmentet av en maksillær palp av C. caragana sett av fluorescens mikroskopi. Hvit pil viste omtrent kuttet kanten av harpiksblokken og den stiplede sirkelen viste nøyaktig plassering. (C) Den markerte avstanden fra kanten av harpiksblokken til den maksillære palp-målplasseringen (28 μm i denne prøven). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av rengjørings- og fikserende oppløsning med Tween 20 ble renere SEM-bilde observert enn det uten Tween 20 (Figur 3). Tween 20 festeløsning penetrerte glutaraldehydfikseringsløsningen i vevet. Microtubule struktur ble tydelig sett. TEM-bilde av den indre strukturen i prøven ble uskarpt uten Tween 20 (Figur 4).
Figur 3: Sensilla som lokaliserer på antennen av Chlorophorus caragana under SEM. Sammenligning av SEM-bilde med Tween 20 (A) og uten Tween 20 (B), som viste at bilde A er renere enn bilde B generelt. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Chlorophorus caragana sett ved overføring elektron mikroskopi av sensilla kvist basiconica på labial palps. Sammenligning av TEM-bilde med Tween 20 (A) og uten Tween 20 (B). Microtubule struktur av bilde A er klart, mens bildet B er uskarpt. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Vi brukte SEM til å studere typer og ultrastrukturer av sensilla på palps av C. caragana, finne 4 typer sensilla inkludert 10 undertyper: 1 Böhm's bust (BB.), 3 sensilla chaetica (Ch.1-Ch.3), 1 digitiform sensilla (Dig.), og 5 sensilla kvist basiconica (S.tb.1-S.tb.5) (Tabell 1). Sensilla identifikasjon og ultrastruktur var basert på deres morfologi og størrelse18,19,20,21,22,23. Våre prøveforberedelsesmetoder gjorde klare bilder av overflatene og interne ultrastrukturer av insektssensilla.
| Nummer | Type | Lengde (μm)a | Diameter ved sokkel (μm)a | Veggen | Tips | Socket | Kutan porer | Distribusjon |
| 1 | Bb. | 5,18 ± 1,25 | 1,70 ± 0,47 | Glatt | Skarpe | Bredt | nei | maxillary palp, labial palp |
| 2 | 1. 1. | 38,59 ± 8,20 | 3,15 ± 0,84 | Rillet | Skarpe | Bredt | nei | maxillary palp, labial palp |
| 3 | Ch.2 (andre) | 81,54 ± 18,07 | 3,75 ± 0,88 | Rillet | Skarpe | Bredt | nei | maxillary palp, labial palp |
| 4 | Ch.3 (andre) | 282,06 ± 22,60 | 6,10 ± 0,70 | Rillet | Skarpe | Bredt | nei | labial palp |
| 5 | Grave. | 24,77 ± 2,98 | 1,24 ± 0,32 | Glatt | Sløv | Bredt | nei | maxillary palp |
| 6 | S.tb.1 | 6,51 ± 1,01 | 2,31 ± 0,25 | Rillet | Med fremspring | Hevet og stramt | Tips pore | maxillary palp, labial palp |
| 7 | S.tb.2 (Andre) | 5,91 ± 0,90 | 2,24 ± 0,30 | Glatt | Sløv | Hevet og stramt | Tips pore | maxillary palp, labial palp |
| 8 | S.tb.3 (Andre) | 6,84 ± 0,98 | 1,96 ± 0,35 | Glatt | Med fremspring | Hevet og stramt | Tips pore | maxillary palp, labial palp |
| 9 | S.tb.4 (Andre) | 2,21 ± 0,59 | 2,86 ± 0,46 | Rillet | Med fremspring | Hevet | Tips pore | maxillary palp, labial palp |
| 10 | S.tb.5 (Andre) | 1,16 ± 0,29 | 1,05 ± 0,19 | Glatt | Sløv | Hevet og bred | Tips pore | maxillary palp, labial palp |
Tabell 1: Typer sensilla på palps av C. caragana.
For å undersøke ultrastrukturen inne i sensilla på C. caragana palps, brukte vi TEM. Et eksempel på disse studiene var kontinuerlig tverrsnittsvisninger av s.tb.1-pinnen på maksillære palper. Visningene viste at dendrittisk kappe omringet de ytre dendrittiske segmentene og utvidet til spissen pore (Figur 5A-D). Syv uforgrenede ytre dendrittiske segmenter eksisterte inne i det indre reseptorlymfhulen, som var omgitt av et ytre hulrom (Figur 5D). Den rørformede kroppen ble separert av en dendrittisk hylse fra andre ytre dendrittiske segmenter ved hver sensillar socket base (Figur 5E). I ciliary-regionen noterte vi 8 dendritter av forskjellige diametre, noe som indikerer tilstedeværelsen av 8 bipolare nevroner. Til slutt inneholdt ciliary-segmentet 9 perifere mikrotubule dobler (figur 5F).
Figur 5: TEM visninger av sensilla type 1 kvist basiconica (S.tb.1) på en Chlorophorus caragana maxillary palp30. (A) S.tb.1 med stiplede linjer merking regioner nær tverrsnitttatt for Figs. B-E. (B) Tverrsnitt av fingerformede fremspring som viser spredt cuticula. (C)Tverrsnitt av basalområdet av fingerformede fremspring som viser indre reseptorlymfhulrom uten ytre dendrittiske segmenter. (D)Tverrsnitt av den midterste delen av pinnen som viser dendrittisk kappe som deler sensillum-lymfehulen i både indre og ytre hulrom med 7 ytre dendrittiske segmenter i det indre hulrommet. (E) Basal-regionen på pinnen som viser den rørformede kroppen omgitt av en dendrittisk hylse og atskilt fra ytre dendrittiske segmenter. En tormogencelle danner utsiden av dendrittisk kappe. (F) Tverrsnitt av ciliary regionen viser 8 dendritts av forskjellige diametre. Forkortelser: bb, basal kropp; cs, ciliary segment; CW, cuticular vegg; DS, dendrittisk kappe; iRL, indre reseptor lymfehulrom; M, mikrotubule; Mi, microvilli; oD, ytre dendrittisk segment; oRL, ytre reseptor lymfehulrom; S.tb.1, type 1 sensilla kvist basiconica; TB, rørformet kropp; TH, thekogencelle; TIL, tormogen celle; TR, trichogen celle. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikkelen presenterte vi et prøveforberedelsesskjema for skanning og overføring elektronmikroskopi for trebeleiningsbille. Ved hjelp av insektvedlegg som representativt studiefag demonstrerte vi flere forbedringer over tradisjonelle prøveforberedelsesmetoder.
Flytende olje som slippes ut fra den faste overflaten er emulgert i små dråper, som kan spres godt og suspenderes i vaskemediet for å redusere redeponering på overflaten av objektet. Vaskeytelse av overflateaktivt middel inkluderer alle de grunnleggende egenskapene som fuktbarhet, permeabilitet, emulgering eiendom, dispergering, løseliggjøring11,12,13,14. Effekter av forskjellige vaskemidler på elektronmikroskopiske prøver tilberedning av Golden Nematode viste at Tween 20 hadde best rengjøringseffekt, etterfulgt av natriumbikarbonat og destillert vann24. I denne studien fant vi at Tween 20 kan brukes til å redusere væskeens overflatespenning, og forhindre at smusset deponerer på insektets kroppsoverflate, spesielt for trebeleielsesbille samlet direkte i feltet. Insektskroppsoverflaten ble vasket mer rent i SEM. Fikserende med Tween 20 penetrerte insektlegemeveggen lettere, og deretter bedre faste vev og organer i kroppen i TEM. Fordelen med overflateaktivt middel i elektronmikroskopi prøveforberedelse har blitt grundig studert24,25,26,27,28,29,30,31.
Vi vedtok også en modifisert lufttørkemetode for SEM-prøveforberedelse, der den dehydrerte prøven ble plassert i en petriskål som inneholder et silikageltørkemiddel som gradvis fordamper det dehydrerende middelet. Den største fordelen med denne metoden er at den er enkel, lett vedlikeholdt, og det holder mikromiljøluften tørr og ingen spesialutstyr kreves. Den naturlige tørkemetoden er en enkel, praktisk og effektiv metode for frø, mutter og langsiktig bevaring av insektprøver. Selv om prøvevolumet krymper under den naturlige tørkeprosessen, beholdes prøvens grunnleggende morfologi32. Generelt har Coleoptera insekter relativt lavt vanninnhold, og overflaten er omgitt av harde chitinvegger. Lufttørking er i stand til å oppfylle kravene. Denne tørkemetoden er imidlertid ikke egnet for tørking av vev med et stort vanninnhold, som lus, kvaler og larver, fordi overflatespenningen vil deformere prøven under tørkeprosessen.
For å observere og beregne type og antall sensilla fordelt over overflaten av vedlegget, må dorsal, ventral og lateral av vedlegget vurderes. Noen sensilla var få, små, og noen ganger dekket, skanne og observere nøye fra alle vinkler for å finne de sensilla fullt utstående epidermis eller som følge av depresjonen. Siden mange sensilla var relativt lang og håraktig, kan spissen effekten være betydelig. Så, elektron mikroskop akselerasjon spenning må ikke være for høy, 5-20kV var best, og vi brukte 20kV.
I TEM-prøveinnbygging hadde prøven bedre nær kanten av den flate innebyggingsformene for å spare tid når du roughing harpiksblokken. Den tradisjonelle TEM-metoden for kontinuerlig å kutte harpiksen er omfattende, og den er vanligvis blindt kuttet ved hjelp av et optisk mikroskop17,33. For å forbedre dette utforsket vi først en insektsensilla lokaliseringsteknikk i harpiksinnebygde blokker ved hjelp av fluorescensmikroskopi for å vise og måle målavstanden til kuttet. Sammenlignet med den tradisjonelle TEM-trimmemetoden, kan denne teknologien spare prøveforberedelsestid og mer nøyaktig finne målsensoren. I fravær av måleprogramvare kan en skalert linjal plasseres i visningsfeltet for å måle målavstanden på omtrent. Kombinasjonen av et ultramikrotome med et fluorescensmikroskop gir klare observasjoner av skjæreprosessen, noe som gir nøyaktige kutt av målsensilla og andre passende forsøkspersoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Vi setter pris på den sjenerøse hjelpen fra Beijing Vocational College of Agriculture, Institute for Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), Bioresearch Center of Beijing Forestry University og professor Shan-gan Zhang fra Institutt for zoologi, det kinesiske vitenskapsakademiet. Denne forskningen ble støttet av National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Indre Mongolia Agricultural University High-level Talent Research Startup Plan (203206038), og Indre Mongolia Autonome Region Higher Education Research Project (NJZZ18047), Indre Mongolia autonome regionen Linxue "Double First-class" Construction Project (170001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , Springer. 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , Cambridge University Press. Cambridge. 1 (2003).
