Summary
För att observera ultrastruktur av insektssensilla presenterades skanningoch transmissionelektronmikroskopi (SEM respektive TEM) provberedningsprotokoll i studien. Tween 20 lades till i fixeringsmedel för att undvika provdeformation i SEM. Fluorescensmikroskopi var till hjälp för att förbättra skivning noggrannhet i TEM.
Abstract
Denna rapport beskrivs provberedningsmetoder som skanning och transmissionelektronmikroskopobservationer, som visades genom att förbereda bihang av träsborret, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), för båda typerna av elektronmikroskopi. SEM-provpreparatet (Scanning electron microscopy) var baserat på provkemisk fixering, uttorkning i en serie etanolbad, torkning och sputterbeläggning. Genom att lägga tween 20 (Polyoxyethylene sorbitan laurate) till fixerande och tvättlösning, insektkroppsytan av vedeldaskalbagge tvättades mer rent i SEM. Denna studie s överföring elektronmikroskopi (TEM) prov beredning inblandade en rad steg inklusive fixering, etanol uttorkning, inbäddning i harts, positionering med fluorescens mikroskopi, snittning och färgning. Fixeringsmedel med Tween 20 möjliggjorde penetrering insekten kroppen väggen av vedeldaskalbagge lättare än det skulle ha varit utan Tween 20, och därefter bättre fasta vävnader och organ i kroppen, vilket gav klar överföring elektronmikroskop observationer av insektsensilla ultrastructures. Nästa steg i detta preparat var att bestämma positionerna av insektssensilla i provet inbäddad i hartsblocket med hjälp av fluorescensmikroskopi för att öka precisionen i målsensilla positionering. Detta förbättrade skivning noggrannhet.
Introduction
Scanning elektronmikroskopi är ett viktigt verktyg i många morfologi studier, att SEM visar ytstrukturer1,2. Transmissionselektronmikroskopi överklagande är att det kan användas för att studera ett brett spektrum av biologiska strukturer på nanometer skalan, från arkitekturen av celler och ultrastruktur organeller, till strukturen av makromolekylära komplex och proteiner. TEM visar inre strukturer3,4,5.
Coleoptera är den största gruppen av insekter, inklusive cirka 182 familjer och 350 000 arter. De flesta av de coleopteran insekter, i synnerhet vedelsbaggar, livnär sig på växter, av vilka många är viktiga skadedjur av skogar och fruktträd, orsakar förödande skador på träd6. För närvarande har förebyggande och kontroll population av skadedjur baserat på kemisk ekologiteori fått ökad uppmärksamhet7. Effektiva, låggiftiga, föroreningsfria feromonkontrollmetoder har blivit ett effektivt sätt8. Att studera insekters sensillamorfologi och ultrastruktur är en viktig del av insektskemisk ekologiforskning. Skannings- och transmissionselektronmikroskopi (SEM respektive TEM) används för stor effekt för att studera deras morfologi och inre anatomi. Under beredning av insektsprover för elektronmikroskopi (EM) kan dock observationsplatsens objektivitet och äkthet påverkas9. I allmänhet kräver SEM-provberedning av insekter rengöring, vävnadsfixering, uttorkning, metathes, torkning och sputterbeläggning10. På grund av den komplexa miljö där vedelsbaggar lever, har kroppsytan ofta olika föroreningar och deras bihang har ofta många fina långa sensilla eller borst. I synnerhet är vissa träborr er inte tillgängliga från laboratoriehöjning, som samlas in direkt på fältet, och sedan tas i fästvätska för att säkerställa färskhet och därefter tvättas i laboratoriet. Om provet först är fast och sedan tvättas, är det naturligtvis mycket svårare att ta bort skräp eftersom glutaraldehyd starkt fixar det till provet. Tween 20 är en ytaktivt11,12,13,14, som spelar en viktig roll i tvättprocessen, inklusive att minska vattenspänningen och förbättra vattenvätbarheten på ytan av tvätten. I denna studie lades Tween 20 till fästlösningen och PBS rengöringslösning för att minska ytan spänningen i vätskan, och förhindra smuts från att deponera på kroppsytan av vedeldaskalbaggen, som gjorde kroppsytan renare i SEM.
Med Hjälp av TEM kan sensilla på olika organ av insekter skivas för att avslöja de klara strukturerna inuti dem, vilket ger en grund för att analysera sensillafunktioner. När motivet insekt, såsom vedeldskalbagge, är stor, och dess kroppsvägg har en betydande grad av sclerotization, så fixeringen får inte helt mätta organvävnader inuti insektskroppen. Tween 20 kan öka smutsens spridningoch fjädringsförmåga. I denna studie lades Tween 20 till fixeringsmediv för att förbättra fixerande vätskegenomträgenomslag i insektskroppen av vedeldaskalbagge, undvika deformation och kollaps av epidermi11,12,13. Dessutom, med hjälp av allmän skivning teknik, är det svårt att exakt hitta olika typer av sensilla, särskilt för vissa små sensilla15. Baserat på traditionella TEM provberedning kombinerade denna studie fluorescensmikroskopi och SEM för att bestämma insektssensillapositionen i det inbäddade blocket, vilket förbättrar skivningsnoggrannheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
VARNING: Kontakta materialsäkerhetsdatabladen för reagenser innan du använder dem. Flera av de kemikalier som används under provberedningär giftiga, mutagena, cancerframkallande och/eller reproduktionstoxiska. Använd personlig skyddsutrustning (handskar, labbrock, fullängdsbyxor och slutna tåskor) och arbeta under en rökhuv medan du hanterar provet.
1. SEM Prov Beredning och avbildning
- Provfixering och rengöring
- Arbeta i ett område där C. caragana förekommer, locka vuxna till fältfällor agnade med växt attractants, såsom isophorone16. Bevara rena kroppar av vuxna C. caragana i 0,1 mol L-1 fosfat-buffrad saltlösning (PBS, pH 7.2), 2,5% (wt/vol) glutaraldehyd (vattenfri EM Grad), och 0,06% (vol/ vol) Tween 20. Fäst provet vid 4 °C under helgen.
- Ta bort kropparna från konserveringsvätskan och skölj i fosfatbuffert. Med hjälp av ett stereomikroskop, ta bort bihang och rengör dem ultraljud (40 kHz) i en 0,1 molL-1 fosfatbuffrad salin (pH 7.2) med 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST). Efter rengöring i 100 s, överför provet till mikroskopet för att kontrollera om det var rent. Under normala omständigheter, rengör i 400-talet för att säkerställa att provet var tillräckligt rent för att observera och inte skadas.
- Provuttorkning, montering och torkning
- Dehydratera proverna genom att använda 20 min på varandra följande behandlingar i 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, och 100% (alla vol / vol) etanol. Använd dubbelsidig tejp med koldubbelsidig tejp för att separat fixa 3 observationsytor (dorsala ventrala och laterala) på stubbar. Observera att alla visningsytor måste hållas rena och fria från föroreningar. Placera provstadiet i en petriskål som innehåller ett kiselgeltorkare i 48 timmar.
- Sputter-coat och Provinsättning
- Använda Hitachi Koki (E-1010) jonsputteringsinstrument, vrid HUVUDVENTILen till ÖPPET läge, ta bort provkammarlocket och lägg provet i kammaren. Sätt på power-knappen och READY-lampan var på. Ställ sputteringstiden som 45 sekunder och beläggningstjocklek en 70,875 Å. När mekanisk pump vakuum ratten index sjönk under 7, tryck ansvarsfrihet och börja spruta platina. I slutet av experimentet, stäng av strömförsörjningen och ta provet ur kammaren. Sprayfilmtjocklek: d = KIVt ("d" är filmens tjocklek i enheten " Å "; " K" är en konstant, beroende på sputtered metall och gas. Till exempel är K luft 0,07; "I" är enheten mA av plasmaflöde; "V" är den spänning som används i enheten "KV". "t" är tid i sekunder.
- Sätt in stuben som innehåller provet på sem-stadiet. Öppna SEM-programvaran och välj önskad driftspänning med början vid 20 kV.
2. TEM Prov Beredning och avbildning
- Hämta och åtgärda provet som i steg 1.1.1 och 1.1.2.
- Rengöring, sekundär fixering och uttorkning
- Ta bort vuxna C. caragana från bevarandevätskan. Ta bort bihangen med hjälp av ett stereomikroskop, tvätta proverna i PBST i 3 timmar och sedan efter fixa dem i 1 % (wt/vol) osmiumtetroxid i PBS i 1h vid 25 °C. Dehydratera proverna genom att använda 20 min på varandra följande behandlingar i 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, och 100% (alla vol / vol) etanol vid rumstemperatur.
- Harts Bäddinbäddning och polymerisation
- Bädda in proverna i harts i en platt inbäddning sformar. Provet var längst ner på plattan och placerades så nära kanten av det infällda spåret. Placera etiketten i tomset och inkubera plattan som innehåller provet vid 60 °C i 72 timmar. Ta bort kapseln från inkubatorn och kontrollera att hartset hade polymeriserats.
- Exempel på snittning och färgning
- När provet hade stelnat, placera varje harts block under ett fluorescens mikroskop och fotografera dem under blått ljus. Flytta mikroskopets lysrörskälla så att det bestrålade provet ovanifrån. Gör att sensilla i hartsblocket tydligt kan observeras. Fotograferade och mäta avstånd för att rikta in sig på sensilla (Figur 1).
- Se SEM-bilden av palps (figur 2A) och skär ungefär hartsblocket med ett rakblad för att stänga målreceptorn (figur 2B).
- Därefter fotograferar du det grovt skurna hartsblocket med blått ljus smälter in, justera ljuskällan ovanifrån så att sensilla observerades tydligt. Grönt ljus upphetsad av blått ljus skapade en gynnsam observation. Vid avbildning lades objektivmikrometern (DIV 0.01mm) till fluorescensmikroskopstadiet, och sedan mättes avståndet till målet imagej-programvara (US National Institute of Health)(figur 2C). Bilden linjal gjordes av Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). För ultramikrotomerskivning ställer du sedan in skäravståndet med 50-60 nm-skivatjocklekar tills målpositionen nåddes. Använd fluorescensmikroskopi för att identifiera målreceptorn.
- Montera sektionerna på Formvar-belagda koppargaller med 100 maska, dubbelfärgade med uranylacetat och blycitrat.
- För det första tillsätt 3,75 g uranylacetat till 50 ml 50 % metanol. Rostgaller med en filtrerad (0,45 μm) spruta med en mättad lösning av uranylacetat vid rumstemperatur i 10 min. Täcksektioner under färgning för att blockera ljusinducerade fällningar. Skölj 2x i 50 % metanol; 2x filtrerat avgasat vatten.
- För det andra, tillsätt 0,02 g blycitrat till 10 ml avgaserat destillerat vatten i centrifugrör. Tillsätt 0,1 ml 10 N natriumhydroxid, försegla och skaka för att lösa upp. Rostgaller med en lösning av blycitrat i 8 min. Centrifug före användning. Färgning måste göras i en koldioxidfri miljö för att förhindra bildandet av blykarbonatfällning. Placera fläckar på rutor av plast petriskålar. Skölj i avgaserat filtrerat vatten och torka17. Observera dem via TEM som arbetar vid 80 kV.
Figur 1: Ett fluorescerande mikroskop fotograferade ett hartsblock som omsluter bihang till klorforiska caragana. (A) Antennhartsblock; (B)Hartsblock i slutet av ovipositor. Pilen indikerade kanten på hartsblocket; den prickade cirkeln anger målsensilla. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förfaranden för den exakta platsen för sensilla. (A)Det fjärde delsegmentet av en maxillary palp av klorphorus caragana, den prickade cirkeln visade sensilla riktade av SEM. (B) Det 4: e delsegmentet av en maxillary palp av C. caragana ses med fluorescensmikroskopi. Vit pil visade ungefär skärkanten på harts blocket och den prickade cirkeln visade den exakta platsen. (C) Det markerade avståndet från kanten av hartsblocket till maxillary palp målplats (28 μm i detta prov). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med rengöring och fixeringslösning med Tween 20 observerades renare SEM-bild än utan Tween 20 (figur 3). Tween 20 fästlösning trängde igenom glutaraldehyd fixeringslösning i vävnaden. Microtubule struktur sågs tydligt. TEM-bilden av provets inre struktur var suddig utan Tween 20 (figur 4).
Figur 3: Sensilla lokalisera på antenn en chlorophorus caragana under SEM. Jämförelse av SEM bild med Tween 20 (A) och utan Tween 20 (B), som visade att bild A är renare än bild B i allmänhet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Klorophorus caragana ses av överföring elektronmikroskopi av sensilla kvist basiconica på blygdläpparna palps. Jämförelse av TEM-bild med Tween 20 (A) och utan Tween 20 (B). Microtubule struktur bild A är klar, medan bild B är suddig. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vi använde SEM för att studera typer och ultrastrukturer av sensilla på palps av C. caragana, hitta 4 typer av sensilla inklusive 10 sub-typer: 1 Böhm's borst (BB.), 3 sensilla chaetica (Ch.1-Ch.3), 1 digitiform sensilla (Dig.), och 5 sensilla kvist basiconica (S.tb.1-S.tb.5) (Tabell 1). Sensilla identifiering och ultrastruktur baserades på deras morfologi och storlek18,19,20,21,22,23. Våra provberedningsmetoder gjorde tydliga bilder av ytorna och de inre ultrastrukturerna av insektssensilla.
| Nummer | Typ | Längd (μm)a | Diameter vid bas (μm) | Väggen | Tips | Socket | Cuticular porer | Distribution |
| 1 | Bb. | 5.18 ± 1,25 | 1,70 ± 0,47 | Smidig | Skarp | Brett | Nej | överillary palp, blygd palp |
| 2 | Ch.1 (på 1000-) | 38.59 ± 8,20 | 3.15 ± 0,84 | Räfflade | Skarp | Brett | Nej | överillary palp, blygd palp |
| 3 | Ch.2 (på 1960-) | 81,54 ± 18,07 | 3.75 ± 0,88 | Räfflade | Skarp | Brett | Nej | överillary palp, blygd palp |
| 4 | Ch.3 (på 1960-) | 282.06 ± 22.60 | 6.10 ± 0,70 | Räfflade | Skarp | Brett | Nej | (Sundsvall) |
| 5 | Gräva. | 24.77 ± 2,98 | 1.24 ± 0,32 | Smidig | Trubbig | Brett | Nej | Johan Palp |
| 6 | S.tb.1 (på 1000-talet) | 6.51 ± 1,01 | 2.31 ± 0,25 | Räfflade | Med utskjutande delar | Upphöjd och stram | Tips por | överillary palp, blygd palp |
| 7 | S.tb.2 (på 1960-talet) | 5.91 ± 0,90 | 2.24 ± 0,30 | Smidig | Trubbig | Upphöjd och stram | Tips por | överillary palp, blygd palp |
| 8 | S.tb.3 (på 1960-talet) | 6.84 ± 0,98 | 1.96 ± 0,35 | Smidig | Med utskjutande delar | Upphöjd och stram | Tips por | överillary palp, blygd palp |
| 9 | S.tb.4 (på 1960-talet) | 2.21 ± 0,59 | 2.86 ± 0,46 | Räfflade | Med utskjutande delar | Upp | Tips por | överillary palp, blygd palp |
| 10 | S.tb.5 (på 1960-talet) | 1.16 ± 0,29 | 1,05 ± 0,19 | Smidig | Trubbig | Upphöjt och brett | Tips por | överillary palp, blygd palp |
Tabell 1: Typer av sensilla på palps av C. caragana.
För att undersöka ultrastrukturen inuti sensilla på C. caragana palps, använde vi TEM. Ett exempel på dessa studier var kontinuerlig tvärsnittsvy av s.tb.1-pinnens pinne på maxillarypalps. Vyerna visade att dendritiska skidan omringade de yttre dendritiska segmenten och förlängde tills spetsen por(Figur 5A-D). Sju ogrenade yttre dendritiska segment fanns inuti den inre receptorn lymfhåla, som var omgiven av en yttre hålighet (Figur 5D). Tubulär kroppen separerades av en dendritisk slida från andra yttre dendritiska segment vid varje sensillar hylsa (figur 5E). I ciliary regionen noterade vi 8 dendriter av olika diametrar, vilket tyder på förekomsten av 8 bipolär nervceller. Slutligen innehöll ciliärsegmentet 9 perifera mikrotubulidutvpar(figur 5F).
Figur 5: TEM-vy över sensilla typ 1 kvist basiconica (S.tb.1) på en klorophorus caragana maxillary palp30. (A) S.tb.1 med prickade linjer som markerar områden nära de tvärsnitt som tagits för Figs. B-E. (B) Tvärsnitt av fingerformade utskjutande delar som visar spridda cuticula. (C) Tvärsnitt i den basala regionen fingerformade utskjutande delar som visar inre receptorlymfhålor utan yttre dendritiska segment. (DTvärsnitt i mittenregionen i pegen som visar den dritiska skidan som delar sensillum-lymfhålan i både inre och yttre håligheter med 7 yttre dendritiska segment i innerhålan. (E)Basala regionen av pinnen som visar rörkroppen omgiven av en dendritisk skida och separeras från yttre dendritiska segment. En tormogen cell bildar utsidan av dendritiska skidan. (FTvärsnitt i ciliärregionen som visar 8 dendriter med olika diametrar. Förkortningar: bb, basalkropp; cs, ciliärsegment; CW, cuticular vägg; DS, dendritisk slida; iRL, inre receptorlymfhåla; M, mikrotubul; Mi, microvilli; oD, yttre dendritiska segmentet; oRL, yttre receptorlymfhåla; S.tb.1, typ 1 sensilla kvist basiconica; TB, tubulär kropp; TH, thecogen cell; TILL, tormogen cell; TR, trichogencell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenterade vi ett prov förberedelseschema för skanning och överföring elektronmikroskopi för träsborrek. Med hjälp av insektsbihang som ett representativt studieämne visade vi flera förbättringar jämfört med traditionella provberedningsmetoder.
Den flytande oljan lossnat från den fasta ytan emulgeras till små droppar, som kan vara väl spridda och suspenderade i tvättmedel för att minska återinsättning på ytan av objektet. Ytaktiva tvättprestanda omfattar alla grundläggande egenskaper såsom fuktbarhet, permeabilitet, emulgerande egenskap, spridningsförmåga, löslighet11,12,13,14. Effekter av olika rengöringsmedel på elektronmikroskopiska prover beredning av Golden Nematode visade att Tween 20 hade den bästa rengöringseffekten, följt av natriumbikarbonat, och destillerat vatten24. I denna studie fann vi att Tween 20 kan användas för att minska ytan spänningen i vätskan, och förhindra smuts från att deponera på kroppen ytan av insekten, särskilt för vedeldskalbagge samlas in direkt på fältet. Insektskroppsytan tvättades mer rent i SEM. Fixeringsmedel med Tween 20 trängde in i insektskroppen lättare, och därefter bättre fasta vävnader och organ i kroppen i TEM. Fördelen med ytaktivt ämne i preparatet av elektronmikroskopi provet har studerats ingående24,25,26,27,28,29,30,31.
Dessutom antog vi en modifierad lufttorkningmetod för SEM provberedning, där det uttorkade provet placerades i en petriskål som innehåller en kiselgeltorkare som gradvis avdunstar uttorkningsmedlet. Den största fördelen med denna metod är att den är enkel, lätt underhållen, och den håller mikromiljön torr och ingen särskild utrustning som krävs. Den naturliga torkmetoden är en enkel, praktisk och effektiv metod för utsäde, mutter och långsiktigt bevarande av insektsprover. Även om provvolymen krymper under den naturliga torkningsprocessen, behålls provets grundläggande morfologi32. I allmänhet coleoptera insekter har relativt låg vattenhalt, och deras yta är omgiven av hårda chitin väggar. Lufttorka kan uppfylla kraven. Denna torkmetod är dock inte lämplig för torkning av vävnader med en stor vattenhalt, såsom lus, kvalster och larver, eftersom ytspänningen kommer att deformera provet under torkningsprocessen.
För att observera och beräkna typ och antal sensilla fördelade över bihangens yta, dorsala, ventrala och laterala av bihang måste beaktas. Vissa sensilla var få, små, och ibland omfattas, skanna och observera noga från alla vinklar för att hitta dessa sensilla helt sticker ut epidermis eller som härrör från depression. Eftersom många sensilla var relativt långa och hårsliga, tip effekten kan vara betydande. Så elektronmikroskop accelerationsspänningen får inte vara för hög, 5-20kV var bäst och vi använde 20kV.
I TEM-provet samplar in hade provet bättre nära kanten av de platta inbäddningsformarna för att spara tid när du grovar hartsblocket. Den traditionella TEM-metoden för att kontinuerligt skära hartsen är omfattande, och den skärs vanligtvis blint med hjälp av ett optiskt mikroskop17,33. För att förbättra detta utforskade vi först en insektssensilla lokaliseringsteknik i harts-inbäddade block med hjälp av fluorescensmikroskopi för att visa och mäta målavståndet till snittet. Jämfört med den traditionella TEM trimning snuten metod, den här teknologien kanna rädda prov förberedelse tid och mer exakt lokalisera måltavlan sensoren. I avsaknad av mätprogramvara kan en skalad linjal placeras i synfältet för att ungefär mäta målavståndet. Kombinationen av en ultramicrotome med ett fluorescensmikroskop ger tydliga observationer av skärprocessen, vilket ger korrekta skärsnitt av målsensilla och andra lämpliga ämnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingen intressekonflikt att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar generöst stöd från Beijing Vocational College of Agriculture, Institutet för tillämpning av atomenergi (kinesiska Akademin för jordbruksvetenskap), Bioresearch Center i Peking Skogsbruk University och professor Shan-gan Zhang vid Institutet för zoologi, kinesiska vetenskapsakademin. Denna forskning stöddes av National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Inre Mongoliet Agricultural University High-level Talent Research Startup Plan (203206038) och Inre Mongoliet autonoma regionen högre utbildning Research Project (NJZZ18047), Inre Mongoliet autonoma regionen Linxue "Double First-class" Construction Project (170001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anatomical lens | Chongqing Auto Optical limited liability company |
1425277 | |
| Carbon adhesive tape | SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. | 7311 | |
| Carbon tetrachloride | Sigma | 56-23-5 | |
| Copper grids | GilderGrids | G300 | |
| Disodium hydrogen phosphate | Sinopharm group chemical reagent co., LTD | 10039-32-4 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Flat embedding molds | Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | 70900 | |
| Fluorescence microscope | LEICA | DM2500 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | Anhydrous EM Grade |
| Isophorone | Sigma | 78-59-1 | |
| Lead citrate | Sigma | 512-26-5 | |
| Methanol | Sigma | 67-56-1 | |
| Monobasic sodium phosphate | Its group chemical reagent co., LTD | 7558-80-7 | |
| Objective micrometer | Olympus | 0-001-034 | |
| Osmium tetroxide | Sigma | 541-09-3 | |
| Petri dish | Aldrich | 1998 | |
| Razor blade | Gillette | ||
| Resin | Spurr | ERL4221 | |
| Scalpel | Lianhui | GB/T19001-2008 | |
| SEM | Hitachi | S-3400 | |
| Silica gel desiccant | Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. | 112926-00-8 | |
| Small brush | Martol | G1220 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sputter ion instrument | Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan | E-1010 | |
| Stereo microscope | Leica | EZ4 HD | |
| TEM | Hitachi | H-7500 | |
| Tween 20 | Tianjin Damao Chemical Reagent | 9005-64-5 | |
| Ultramicrotome | Leica | UC6 | |
| Ultrasonic cleaner | GT Sonic | GT-X1 | |
| Uranyl acetate | Sigma | 6159-44-0 |
References
- Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
- Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
- Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
- Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
- Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
- Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
- Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
- Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
- Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
- Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. , Springer. 1-40 (2006).
- Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
- Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
- Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
- Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
- Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
- Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. , 83-101 (2015).
- Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
- Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).
- Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
- Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
- Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
- Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
- Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
- Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
- Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
- Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
- Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. , 138-142 (2017).
- Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
- Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
- Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
- Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
- Graef, M. D. Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. , Cambridge University Press. Cambridge. 1 (2003).
