Summary
Utfordringen med epilepsi forskning er å utvikle nye behandlinger for pasienter der klassisk terapi er utilstrekkelig. Ved hjelp av en ny protokoll-med hjelp av et implanterbare stoff leveringssystem-vi er i stand til å kontrollere beslag i anesthetized mus ved Elektroforetiske levering av GABA i epileptiske fokus.
Abstract
Epilepsi er en gruppe nevrologiske lidelser som rammer millioner av mennesker over hele verden. Selv om behandling med medisiner er nyttig i 70% av tilfellene, alvorlige bivirkninger påvirker livskvaliteten til pasientene. Dessuten, en høy andel av epileptiske pasienter er resistente; i deres tilfelle, nevrokirurgi eller neurostimulation er nødvendig. Derfor er det viktigste målet med epilepsi forskning å oppdage nye terapier som enten er i stand til å kurere epilepsi uten bivirkninger eller forebygge tilbakevendende beslag i narkotika-resistente pasienter. Neuroengineering gir nye tilnærminger ved å bruke romanen strategier og teknologier for å finne bedre løsninger for å kurere epileptiske pasienter i fare.
Som en demonstrasjon av en roman eksperimentell protokoll i en akutt mus modell av epilepsi, en direkte in situ Elektroforetiske narkotika levering systemet brukes. Nemlig, en neural sonde som omfatter en mikrovæskebasert ion pumpe (μFIP) for on-demand narkotika levering og samtidig opptak av lokale nevrale aktivitet er implantert og demonstrert for å være i stand til å kontrollere 4-aminopyridin-indusert (4AP-indusert) beslag-lignende aktiviteten (SLE). Den γ-aminobutyric acid (GABA) konsentrasjon holdes i fysiologiske området ved nøyaktig kontroll av GABA levering for å nå en antiepileptika effekt i beslaget fokus, men ikke for å forårsake overinhibition-indusert rebound sprekker. Metoden tillater både påvisning av patologisk aktivitet og intervensjon for å stoppe beslag ved å levere hemmende nevrotransmittere direkte til epileptiske fokus med presis spatiotemporal kontroll.
Som et resultat av utviklingen til den eksperimentelle metoden, SLEs kan bli indusert i en svært lokalisert måte som gjør at anfall kontroll av nøyaktig innstilt GABA levering ved anfall utbruddet.
Introduction
Epilepsi er den fjerde vanligste nevrologiske lidelsen: om lag 1% av befolkningen lider av epilepsi, og om lag en tredel av de berørte har tilbakevendende beslag. I de fleste tilfeller, anfall kan kontrollert med medication. Narkotikabehandling må imidlertid stilles inn for hver enkelt pasient, der riktig dosering kan ta år å finne1,2. I tillegg har de fleste av medisinen alvorlige bivirkninger som reduserer kvaliteten på livet3,4,5,6,7. Til slutt, i 30% av tilfellene pasientene er resistente mot medisiner, og i tilfelle av en konstant enkelt beslag generator geometrisk, bare resective nevrokirurgi kan dempe forekomsten av beslag8. Derfor er et stort initiativ i moderne epilepsi forskning å oppdage nye strategier som kan hindre tilbakevendende beslag hos pasienter i fare, samtidig redusere nødvendigheten av sterke narkotika terapier og invasive resective operasjoner.
Epileptiske anfall oppstår når det er en ubalanse i eksitatoriske og hemmende kretser enten gjennom hjernen (generalisert epilepsi) eller i en lokalisert del av hjernen (fokal epilepsi), slik at neurons utflod i en unormal måte9 , 10 andre , 11. antiepileptika narkotika kan opptre på to forskjellige måter i beslag forebygging: enten synkende eksitasjon eller styrke hemming12. Spesielt kan de enten endre den elektriske aktiviteten i neuronal celler ved å påvirke ion-kanaler i cellemembranen13 eller handle på kjemisk overføring mellom neurons ved å påvirke hemmende signal for GABA eller eksitatoriske glutamat i synapser14,15. For noen medisiner, handlings modus er ukjent18. Også narkotika behandlinger har en kontinuerlig effekt på pasienter og kan ikke tilpasse seg utbredelsen dynamikken i beslag. Ideelt sett ville medikamenter med konkrete virkningsmekanismer virke på underliggende epileptiske prosesser. En optimal behandling ville ikke berøre hjernen interictally men ville handle umiddelbart når et anfall begynner å utvikle. I motsetning til det, i alle tilfeller av epilepsi, betyr medisinering nå en systematisk behandling, påvirker hele hjernen og hele kroppen av pasienten9.
Epileptiske anfall kan forekomme mange år etter den første fornærmelse, slik som hjerne traumer. Perioden mellom den innledende fornærmelse og forekomsten av de første spontane beslagene er preget av betydelige molekylære og cellulære omorganiseringer, inkludert neuronal død med forsvinningen av neuronal nettverkstilkoblinger og axonal spirende/neosynaptogenesis med utseendet på nye tilkoblinger19,20,21. Når beslagene blir tilbakevendende, deres hyppighet og alvorlighetsgrad har en tendens til å øke, som involverer flere hjerneregioner. Det er viktig å skille områder av anfall utbruddet (epileptogenic regioner) fra forplantning nettverk, som reglene for beslag Genesis og forplantning kan variere. Forskning utført på menneskelig vev og eksperimentelle modeller av epilepsi har gitt viktige data om omorganisering av kretser og deres evne til å generere beslag20,21,22, 23. det er imidlertid vanskelig å avgjøre om disse omorganiseringer er Adaptive responser eller om de er causally relatert til epileptogenesis eller beslag Genesis og forplantning12.
Derfor, lokalisere av epileptiske fokus og anvende antiepileptika narkotika lokalt er en av de viktigste utfordringene i moderne epilepsi forskning. Flere eksperimenter med dyremodeller av epilepsi og noen kliniske studier som mål å finne utbruddet av anfall hendelser og definere de underliggende mekanismene i hjernen24,25,26,27. For dette formålet, utviklet vi en ny eksperimentell protokoll ved hjelp av 4AP-indusert epilepsi modell28,29,30,31 i en akutt mus forberedelse, som tillater nøyaktig innsetting av tre enheter inn i gitt område av hippocampus, hvor nettverksaktivitet in vivo er manipulert på en svært lokalisert måte. Lokalisert 4AP injeksjon av et glass micropipette bidrar til å indusere epileptiske SLEs i et lokalisert sted i hippocampus, mens med hjelp av romanen polymer-baserte μFIP sonde kontrollen av beslaget aktiviteten oppnås samtidig ved å registrere neuronal elektrisk aktivitet med enhetens opptaks nettsteder. Hippocampus lokale felt aktivitet overvåkes også med en flerkanals silisium sonde i et lag-spesifikk måte i cortex og i hippocampus samtidig.
Den nylig oppfunnet μFIP sonder arbeid ved hjelp av en anvendt elektrisk felt for å skyve ladet legemidler som er lagret i en mikrovæskebasert kanal over en ion utveksling membran (IEM) og ut til omkringliggende vev (figur 1). IEM transporterer selektivt bare én type ion (anion) og dermed arbeider for å begrense både passiv diffusjon i "off"-tilstand og transport av oppositely arter fra det omliggende vevet inn i enheten. Det elektriske feltet er opprettet på forespørsel ved å bruke en liten spenning (< 1 V) mellom kilde elektroden som er intern til mikrovæskebasert kanalen og en mål elektrode som er ekstern til enheten (i dette tilfellet, hodet skruen på dyret modell). Frekvensen av legemiddellevering er proporsjonal med den brukte spenningen og den målte strømmen mellom kilde-og mål elektrodene. Den presise justeringsevne av legemiddellevering er en av de viktigste fordelene med μFIP. En annen kritisk fordel, sammenlignet med fluidic eller trykk-baserte medikament leveringssystemer, er at i μFIP er det bare en ubetydelig TRYKKØKNING på stoffet levering utløp som narkotika leveres over IEM uten deres transportør løsning.
Det er en liten mengde passive lekker av GABA når μFIP er "off", men dette ble funnet ikke å effekten SLEs. De μFIP er skreddersydd etter konvensjonelle microfabrication metoder som vi rapporterte tidligere31.
Siden en måte å forebygge tilbakevendende beslag er blokaden av nettverket utslipp helt i begynnelsen eller før den første anfall hendelsen, presenterte metoden for å levere hemmende signalstoffet GABA i epileptiske fokus har stor terapeutisk potensial for anfall kontroll hos pasienter med fokal epilepsi. Siden GABA er en endogene substrat, etterlater det indre neuronal egenskaper uendret i fysiologiske konsentrasjoner. Den lokale anvendelsen av lave nivåer av GABA vil bare påvirke celler naturlig mottakelig for hemming, og vil bare føre til liknende effekter til fysiologisk hemming, i motsetning til dyp hjerne stimulering (DBS), som har løs handlinger ved å stimulere alle celler av neuronal nettverk i sitt miljø, forårsaker en blandet respons som involverer både eksitasjon og hemming. Som konklusjon, den foreslåtte metoden gir en mer spesifikk tilnærming til anfall kontroll enn DBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i henhold til de etiske retningslinjene for Institut de Neurosciences des systèmes og godkjent av lokale etiske komiteer og veterinær kontorer.
Merk: Sytten voksne mannlige OF1 mus ble brukt for eksperimenter. Mus ble entrained til en 12 h lys/mørk syklus med mat og vann tilgjengelig annonse lib.
1. anestesi
- Injiser intraperitonealt en blanding av ketamin og xylazine (henholdsvis 100 mg/kg kroppsvekt og 10 mg/kg kroppsvekt) for å bedøve dyret.
-
Sjekk nivået av anestesi ved å observere respirasjonsfrekvensen og visping og ved å sjekke musen respons på smerte.
Merk: når musen puster blir vanlig, ingen visping kan observeres, og dyret reagerer ikke på halen klyper, anestesi er dypt nok til å fortsette.- Plasser dyret på en elektrisk programmerbar varmepute. Dekke rektal temperatur sonde med en Petroleum gelé-basert produkt (se tabell over materialer) og legg den forsiktig inn i endetarmen (1 – 2 cm dyp) av musen for å overvåke kroppstemperaturen. Oppretthold en kroppstemperatur mellom 36,5 og 37,5 ° c under kirurgiske prosedyrer og eksperimentelle opptak.
- Overvåk anestesi nivået ved å sjekke muse reflekser, whisker bevegelser, og hyppigheten av pusting. Tatt i betraktning nivået av anestesi registreres minst hver 30 min, gi en liten dose av en ketamin-xylazine cocktail (20 – 50 μL, den samme konsentrasjonen brukt som før) intramuskulært.
2. kirurgi/Kraniotomi
- Fest hodet på musen i en stereotaxic ramme. Bruk en 30 G nål, Injiser lokale smertestillende ropivacaine (5 μL, 7,5 mg/mL, se tabell over materialer) subkutant på det planlagte snittstedet. Tillat 5 min for at den skal tre i kraft.
- Lag en rett snitt midtlinjen i huden over skallen med en skalpell. Trekk forsiktig huden mot sidene med fin tang og klemme den til side med Bulldog serrefine klemmer å forlate skallen utsatt for videre arbeid.
- Rengjør skallen på konseptet med en skalpell eller lignende verktøy. I tilfelle overfladisk blødning, fjerne blod med bomullspinner eller små biter av papir håndkle.
- Ta en Poly (3, 4-etylendioxythiofen) polystyren kalsiumalkarylsulfonat (PEDOT: PSS)-belagt bakken skrue (størrelse: #00, diameter: 0,047 i, lengde: 1/8 i, se tabell over materialer) med en loddet wire og koble den med en kontakt til forsterkeren headstage.
- Fukt skallen på det ønskede hullet området og bore et hull i høy hastighet ved hjelp av en fin, rund Drill bit (med en 0,4 mm diameter) på skallen over lillehjernen til Dura er synlig. Sett jord skruen inn i hullet og skru den inn med en presisjonsskrutrekker til den når toppen av lillehjernen.
Merk: Hodet skruen var DIP-belagt med en PEDOT: PSS løsning som inneholder 1% 3-glycidyloxypropyl) trimetoksysilan (GOPS) etter vekt etterfulgt av bakervarer ved 140 ° c for 90 min. PEDOT: PSS er en bøyd polymer med et volum kapasitans som er kjent for å være biokompatible. GOPS er en krysskobling blandet med PEDOT: PSS for å øke stabiliteten i vandige medier (figur 2). - Med hjelp av stereotaxic ramme, måle stereotaxic koordinater for den ønskede hjernen regionen. For eksempel er regionen av interesse hippocampus, anteroposterior (AP)-1,8 mm og mediolateral (ML) 1,8 mm fra Bregma punktet basert på hjernen Atlas for mus32.
Merk: Dette er koordinater for høyre halvkule (figur 2). - Tynn en ca 1 til 2 mm diameterområde av skallen over målet regionen ved hjelp av en pålitelig Dental Drill (se tabell over materialer) satt i en rask hastighet til en tynn, godt polert, transparent bein membran gjenstår.
- Så, hvis tykkelsen av bein membranen er tynn nok (< 200 μm), lage et lite hull med tynne tang og forsiktig fjerne det tynne laget av benet33. Bruk skreddersydd nål-tippet nål for å fjerne Dura. Minimer størrelsen på kraniotomi og durotomy for å hindre utvikling av edemas og for å minimere hjerte-og/eller respirasjons pulseringer i hjernen.
Merk: Kraniotomi må fylles med en dråpe saltoppløsning for å hindre tørking og deretter jevnlig etterfylles under eksperimentet (figur 2).
3. innsetting av flerkanals Silicon probe
- Bruk stereotaxic armer i en liten AP vinkel (20 °) for silisium sonde å forlate god plass for posisjonering av de to andre implantater og å ha innspillingen og injeksjon nettsteder av elektroden, ion pumpe, og micropipette så nært som mulig.
Merk: Elektroder, sprøyter, og Ion pumper var dekket med en dråpe DiI flekk løsning (1, 1 '-dioctadecyl-3, 3, 3 ', 3 '-tetramethylindocarbocyanine perklorat [DiI]), for post hoc visualisering av implantation spor (0,5 mg/ml DiI i dimethyl sulfoxide). - Plasser silisium sonden på stereotaxic armen festet til en magnetisk holder og plasser den ved siden av stereotaxic ramme. Still inn AP-vinkelen (20 °), og koble deretter sonden til headstage og til jord skruen.
-
Senk silisium sonden langsomt inn i hippocampus ved hjelp av den mikron presise stereotaxic armen eller en motorisert micromanipulator for å unngå sideveis bevegelse (figur 2 og Figur 3).
- Start opptaksprogramvaren og ta opp – med headstage, den tilkoblede forsterkeren og en datamaskin – elektriske neuronal signaler mens du flytter flerkanals silisium sonden fra toppen av cortex til den målrettede dorsoventral (DV) er nådd (- 1 800 μm fra kortikale overflate). Ta opp og se det lokale feltet potensielle signal (LFP) under penetrasjon på dataskjermen.
Merk: Kontroller nedstigningen av sonden slik at den beveger seg langsomt og kontinuerlig under opptak, å ha bedre visuell kontroll for penetrasjon og for å nå mål sonen. - Bruk ring aktivitet i det pyramideformet laget av hippocampus formasjon i den innspilte LFP som en markør for mål sonen.
Merk: Ripple aktivitet er synlig på en eller to nabokommunene kanaler av flerkanals silisium (si) sonde har en 100 μm avstand mellom opptaks sider (Figur 4). - Vanlig LFP signaler fra lagene i cortex og hippocampus samtidig gjennom flerkanals forsterkeren programvare (se tabell over materialer) ved hjelp av flerkanals si sonder (Figur 4).
- Start opptaksprogramvaren og ta opp – med headstage, den tilkoblede forsterkeren og en datamaskin – elektriske neuronal signaler mens du flytter flerkanals silisium sonden fra toppen av cortex til den målrettede dorsoventral (DV) er nådd (- 1 800 μm fra kortikale overflate). Ta opp og se det lokale feltet potensielle signal (LFP) under penetrasjon på dataskjermen.
4. innsetting av μFIP
- Koble rør (se tabell over materialer) til innløpet til μFIP og fylle sonden med 0,05 M GABA løsning. Fjern rørene og Lukk innløpet med para fin film innpakning. Koble elektriske ledninger til kilde målings enheten.
- Sett inn μFIP ved hjelp av stereotaxic armen i en mediolateral (MP) vinkel (20 °). Si sonden forblir satt inn under hele prosessen.
Merk: μFIP er svært fleksibel og kan ha nytte av støtte fra en liten og ren pensel for å holde den rett til den når hjernen overflaten. Etter dette trinnet, μFIP kan senkes forsiktig med aksial bevegelser. - Senk μFIP langsomt med aksial bevegelser og aldri la den bøye under banen før den når dorsoventral (DV) koordinat (-1 200 μm fra kortikale overflaten).
Merk: Prøv å sette de to enhetene (μFIP og silisium sonde) så nær hverandre som mulig, med tanke på 300 μm avstand fra utløpet fra μFIP spissen.
FORSIKTIG: unngå mekaniske problemer mellom enhetene og kontaktene under innsetting (figur 2b og figur 3b).
5. utarbeidelse av enheter for anfall induksjon
- Bytt metall nålen på sprøyten (10 μL) (se tabell over materialer). Fjern metall delen for nål holde, plasser og fest micropipette (ytre diameter [OD]: 1,2 mm, indre diameter [ID]: 0,75 mm, spissdiameter: 20 – 50 μm med ± 0,5 cm av skaftet), og erstatt deretter nåle holde elementet.
- Plasser sprøyten og den vedlagte Borosilikatglass micropipette ved en 20 ° lateromedial (LM) vinkel for injeksjon av 4AP (50 mM i kunstig spinalvæske [ACSF]).
Forsiktig: Ikke bruk metall nålen på sprøyten eller en micropipette med et spiss som er større enn 50 μm. - Draw 500 nL – 1 μL av 50 mM 4AP ved hjelp av en automatisert microinjection pumpe.
6. innsetting av glass pipette festet til en sprøyte for 4AP injeksjon
- Senk glass micropipette som er festet til sprøyten, til den mål-DV-posisjonen (-1 500 μm), og Injiser deretter 250 nL på 4AP-løsningen (figur 2 og Figur 3). Start innspillingen med opptaksprogramvaren. Se på skjermen og vent til den første interictal Spike vises.
- Start GABA levering av μFIP umiddelbart med utseendet på den første interictal pigg. Lever GABA ved å bruke 1 V mellom kilde og mål for 100 s etterfulgt av 1 s av, for 30 sykluser. Med hjelp av innspillingen programvare, rekord for minimum 2 t.
Merk: Den totale massen av leverte GABA er rundt 1 nmol (figur 5). - På slutten av forsøket, forsiktig fjerne innsatte sonder og bakken skruen, og fjerne dyret fra stereotaxic utstyr. Dyrene ble euthanized ved hjelp av en overdose av narkotika (i. p. 100mg/kg pentobarbital). Døden ble bekreftet ved opphør av pusten og sirkulasjon.
7. evaluering av plassering av implantater
- Etter euthanizing av dyret, perfuse det transcardially, først med 50 mL saltvann og deretter med 150 mL av en iskald bindemiddel løsning inneholdende 4% paraformaldehyde (PFA) i 0,1 M fosfat buffer (PB)34.
Forsiktig: PFA er farlig og må håndteres med forsiktighet. - Halshugge dyret, og deretter fjerne huden og muskelen fra toppen og sidene av skallen. Starter fra foramen Magnum, gjør lateral snitt i skallen mot ørene og en sagittal midtlinjen snitt, tar stor forsiktighet for ikke å skade hjernen. Fjern forsiktig skallen med et bein trimmer. Fjern hjernen, og deretter kutte en vev blokk fra regionen av interesse (fra Bregma punktet,-1 til-3 mm AP) ved hjelp av en hjerne matrise (se tabell over materialer).
- Lim vevet blokken til prøve holderen til en vibratome, sett stativet inn i den, og sett vibratome til 40 i et PB bad gjør 40 μm koronale seksjoner.
- Vask mye med 0,1 M PB. Følg histologiske protokoll for gliacellene fibrillary surt protein (GFAP) farging31.
- Monter seksjoner på lysbildene og dekk dem med et monterings medium som inneholder 2-(4-amidinophenyl)-1H-indol-6-carboxamidine (DAPI) (se tabell over materialer).
Åttende konfokalmikroskopi mikroskopi
- Plasser lysbildene med fargede koronale seksjoner under et 20x mål for et konfokalmikroskopi mikroskop. Velg målområdet.
- Velg optimale eksitasjon og utslipp (eks/EMS) filter sett for fargestoffer som følger: DAPI = 358/461 NM, DiI = 551/569 NM, og fluorescein (se tabell over materialer) = 490/525 NM.
Merk: Siden farging varierer per del, et riktig utvalg av minimal og maksimal eksitasjon og deteksjon må fastsettes for hver del, der de minst tette og mest tett regioner både viser utslipp. - Velg det minst tette området og angi laser intensitet og-gjenkjenning til høye verdier, og kontroller deretter i de tetteste områdene om disse verdiene forårsaker oversaturation av oppdagede utslipp. Hvis det er tilfelle, senker du verdiene og sjekker dem på igjen med det minst tette området. Gjenta disse trinnene til du kommer til høyest mulig påvisning ved lave fargenivåer og riktig, ikke overmettet nivåer på svært fargede områder. Gjenta denne prosessen for alle fargestoffer.
- Bruk flisen skannefunksjon av mikroskopet med 512 x 512 piksler per flis for å få en stor oversikt over sonden innsetting nettsteder med en tilstrekkelig oppløsning for post hoc prosessering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren som presenteres her med en 4AP epilepsi modell i anesthetized mus, kan kontroll av epileptiske anfall oppnås i epileptiske fokus. Den presise lokalisering av implantater (figur 2) bidro til posten hippocampus lokale feltet potensialer (LFPs, Figur 4), for å indusere små hippocampus beslag og å levere GABA ved anfall utbruddet. Lokalisering av implantater ble verifisert etter hvert eksperiment med post hoc histologi (Figur 3).
I tilfelle når SLEs var til stede bare i hippocampus, ble epileptiske aktivitet satt under full kontroll. Figur 5 viser et representativt eksempel på når SLEs kan stoppes med levering av GABA av romanen neuronal sonde som omfatter en μFIP. Da 4AP ble injisert i et større område eller på toppen av cortex, ble epileptiske anfall generalisert, slik at den leverte GABA ikke var i stand til å endre omfanget av epileptiske anfall (figur 6). Leveringen av natrium ioner hadde ikke en merkbar effekt på 4AP-indusert aktivitet (figur 7).
Figur 1: oversikt over μFIP-proben. Skjematisk visning og reell størrelse på μFIP sonde. (a) skjematisk av implantert ende av en μFIP-sonde som viser primære funksjoner. (b) bilde av en μFIP probe med en nål-lignende implantert ende peker opp. Den røde blokken er for fluidic tilkoblinger. Skala bar = 1 cm. (c) mikroskop bilde av en μFIP sonde SPISSEN uten IEM. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kranio-durotomy og lokalisering av implantater i musen hjernen. (A) skjematisk visning av kirurgi, kraniotomi, og målet for implantater i musen hjernen. (B) brukte stereotaxic koordinater og vinkler for implantation av de tre enhetene. μFIP = 20 ° mediolateral (ML),-1 200 μm DV (grønn). Flerkanals silisium sonde = 20 ° AP,-1 800 μm DV (blå). Micropipette med sprøyte = 20 ° LM,-1 500 μm DV (rød). Midten av kraniotomi er 1,8 mm ML,-1,8 mm AP for høyre halvkule. Dette tallet er endret fra Proctor et al.31 (Copyright distribuert under Creative Commons Attribution ikke-kommersiell lisens 4,0 (CC by-NC). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: histologiske evaluering av implantation plasseringen. Panel (A) viser en skjematisk 3D figur på lokalisering av hippocampus formasjon i musen hjernen (grønn). Paneler (B, C og D) viser spor av implantert utstyr-μFIP, micropipette med sprøyte og flerkanals silisium sonde (DiI, rød, piler), henholdsvis31. Paneler (ba, ca, da) viser en høy forstørrelse bilde; paneler (bb, CB, DB) viser tilsvarende side av Paxinos og Franklin Mouse Brain Atlas, mens (BC, CC, DC) viser en lav forstørrelse bilde på hele koronale delen av høyre Halvkule. Scale bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Flerkanals innspilling fra cortex og hippocampus. LFP innspilling med en flerkanals silisium sonde med en 100 μm avstand mellom opptaks steder, fra lagene i cortex (hvit) og hippocampus formasjon (lilla, CA1 = Cornu Ammonis område 1; blå, DG = dentate gyrus. Merk Ripple aktivitet av CA1 stratum pyramidale. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: kontroll av et 4AP-indusert anfall av GABA. Representative elektrofysiologi innspillinger fra hippocampus. (A) innspilling i fravær av μFIP behandling med SLEs starter ca 30 min etter en 4AP injeksjon, etterfulgt av status epilepticus. (B) innspilling av en sak der μFIP-behandlingen ble initiert rett etter den første SLE. Opptaket viser ingen ytterligere patologiske hendelser etter at behandlingen har startet. (C) innspilling der μFIP behandling ble initiert før en 4AP injeksjon, viser ingen patologiske hendelser. De røde pilene indikerer en 4AP injeksjon. Heldekkende grønne piler angir starten på μFIP-behandlingen, og åpne grønne piler markerer slutten på μFIP-behandlingen. Skarpe topper på 100 s intervaller etter en grønn pil er gjenstander fra μFIP behandling31. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: unnlatelse av kontroll av et 4AP-indusert anfall av GABA. Representative elektrofysiologisk innspilling fra hippocampus i en sak der 4AP ble injisert med den metalliske nålen på sprøyten, så epileptiske anfall påvirket et større hjerne område. Merk at GABA levering ikke påvirke anfall intensitet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: kjøretøy eksperiment. Kontroll eksperimenter som leverer en tilsvarende dose natrium ion (na+) i stedet for GABA hadde ikke en merkbar effekt på 4AP-indusert aktivitet, viser at det ikke er anvendt strøm fra ion pumpen som modulerer elektrofysiologisk aktivitet, men heller de leverte molekylene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved å utvikle en ny eksperimentell protokoll i en akutt mus modell av epilepsi, SLEs kunne med hell styres ved hjelp av en μFIP implantert i epileptiske fokus. Takket være sin evne til å levere GABA med Temporal og romlig presisjon, 4AP-indusert SLEs ble kontrollert ved utbruddet av beslag. Behandling av epilepsi er teoretisk mulig hvis kontroll av nettverk utslipp oppnås på stedet av beslaget start. Den presenterte protokollen beviste dette mulig hvis lokalisering av injisert hemmende signalstoffet, GABA, er presis nok til å nå epileptiske fokus i tid. Men i de tilfeller der epileptiske anfall påvirker større områder av hjernen, beslag kontroll av presist lokaliserte GABA levering er ikke mulig. Området av påvirkning av μFIP sonden ble anslått med en radius på ca 550 μm fra uttaket. Det ble bevist at SLEs bare kunne bli påvirket hvis 4AP injeksjon var lokalisert til dette området31.
Metoden er derfor nyttig når epileptiske anfall er lokalisert, men det var ikke mulig å kontrollere eller stoppe epilepsi når beslagene ble multifoci eller generalisert. Likeledes, metoden er blitt bevist inne anesthetized gnagere; i fritt bevegelige dyr, er kroniske søknader fortsatt nødvendig for å undersøke effektiviteten av denne protokollen.
Mens epilepsi har flere former og er forårsaket av ulike underliggende mekanismer, er det bevist at ca 60% av pasientene har ett epileptiske brennpunkt35. Derfor, fordelen av den lokale administrasjonen av en endogene hemmende signalstoffet gir et nyttig verktøy for videre eksperimentelle dyrestudier og presenterer en ny strategi i behandlingen av fokal epilepsi. Den beskrevne metoden viste nytten av μFIP behandling i en akutt mus studie og åpnet veien for videre teknologisk utvikling for å sikre sin kroniske søknaden. Vi tror at nøyaktig målrettede Elektroforetiske medikamentlevering enheter kan videre tilpasses til å behandle ikke bare epilepsi, men andre nevrodegenerative sykdommer også.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
C.M.P. erkjenner finansiering fra et Whitaker International Scholar-stipend administrert av Institute for International Education. A.K. ble sponset av Marie Curie IEF (nr. 625372). A.W. erkjenner finansiering fra European Research Council (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram (gi avtale nr. 716867). A.W. erkjenner i tillegg Excellence Initiative av Aix-Marseille University-A * MIDEX, et fransk "Investissements d'Avenir" program. Forfatterne erkjenner Dr. Ilke Uguz, Dr. Sahika Inal, Dr. Vincenzo Curto, Dr. Mary Donahue, Dr. Marc Ferro, og Zsófia Maglóczky for sin deltakelse i fruktbare diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4AP | Sigma | 275875 | |
| Alexa Fluor 488 | Abcam | ab15007 | |
| Amplifier | Neuralynx, Montana, USA | Digital Lynx 4SX | |
| Amplifier | Ampliplex | KJE-1001 | |
| Atlas Stereotaxique | Allen Atlas | 978-0470054086 | |
| Borosilica glass pipette | Sutter | BF120-69-15 | |
| Brain Matrix | WPI | RBMA-200C | |
| Bone trimmer | FST | 16109-14 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Connector | INSTECH | SC20/15 | |
| Coton tige | Monoprix | EMD 6107OD | |
| Cover slip | Menzel-Glass | 15747592 | |
| DiI Stain | Thermo Fisher | D282 | |
| DMSO | Sigma | 11412-11 | |
| Drill | FOREDOM | K1070 | |
| Forceps | F.S.T. | 11412-11 | |
| GABA | Sigma | A2129 | |
| GFAP Monoclonal Antibody | Thermofisher | 53-9892-80 | |
| GOPS | Sigma | 440167-100M | |
| Hamilton seringe | Hamilton | 80330 | |
| Headscrew | Component Supply | TX00-2FH | |
| Heating pad | Harvard apparatus | 341446 | |
| Injection Pump | WPI | UMP3-3 | |
| Keithley | Tektoronix | 216A | |
| Ketamine | Renaudin | 5787419 | |
| Magnetic holder | Supertech Instruments | MH-1 | |
| Mice | Charles River | 612 | |
| Motoric manipulator | Scientifica, UK | IVM | |
| Na2HPO4 | Sigma | 255793 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 7558807 | |
| NeuroTrace DiI | Thermofisher | N22880 | |
| Paper towel | KIMBERLY CLARK | 7552000 | |
| PB | Sigma | P4417 | |
| PEDOT:PSS | CLEVIOS | 81076212 | |
| PFA | Acros Organic | 30525-89-4 | |
| Rectal temperature probe | Harvard apparatus | 521591 | |
| Ropivacaine | KABI | 1260216 | |
| Saline | Sigma | 7982 | |
| Scalpel | F.S.T | AUST R195806 | |
| Seringue | BD Medical | 324826 | |
| Serrefine clamp | F.S.T | 18050-28 | 4 is recommended |
| Silicon probe | NeuroNexus, Michigan, USA | A2x16-10mm-50-500-177 or A1x16-5mm-150-703 | |
| Stereotoxic frame | Stoelting | 51733U | |
| Superfrost Slide | ThermoScientific | J38000AMNZ | |
| Tubing | INSTECH | LS20 | |
| Vaseline | Laboratoire Gilbert | 3518646126611 | |
| Vectashield DAPI | Vector Laboratories, California, USA | H-1200-10 | |
| Vibratome, Leica VT1200S | Leica Microsystems | 1491200S001 | |
| Xylazine | Bayer | 4007221032311 | |
| Silicon probe | Neuromicrosystems Ltd | A1x32_dbl_5.0_50_0_176_50 |
References
- Kwan, P., Palmini, A. Association between switching antiepileptic drug products and healthcare utilization: A systematic review. Epilepsy & Behavior. 73, 166-172 (2017).
- Belleudi, V., et al. Studies on drug switchability showed heterogeneity in methodological approaches: a scoping review. Journal of Clinical Epidemiology. 101, 5-16 (2018).
- Chen, B., et al. Psychiatric and behavioral side effects of antiepileptic drugs in adults with epilepsy. Epilepsy & Behavior. 76, 24-31 (2017).
- Brodie, M. J., et al. Epilepsy, Antiepileptic Drugs, and Aggression: An Evidence-Based Review. Pharmacological Reviews. 68 (3), 563-602 (2016).
- Hamed, S. A. The auditory and vestibular toxicities induced by antiepileptic drugs. Expert Opinion on Drug Safety. 16 (11), 1281-1294 (2017).
- Hamed, S. A. The effect of epilepsy and antiepileptic drugs on sexual, reproductive and gonadal health of adults with epilepsy. Expert Review of Clinical Pharmacology. 9 (6), 807-819 (2016).
- Roff Hilton, E. J., Hosking, S. L., Betts, T. I. M. The effect of antiepileptic drugs on visual performance. Seizure. 13 (2), 113-128 (2004).
- Stafstrom, C. E., Carmant, L. Seizures and epilepsy: an overview for neuroscientists. Cold Spring Harbor Perspective in Medicine. 5 (6), (2015).
- Arzimanoglou, A., et al. A Review of the New Antiepileptic Drugs for Focal-Onset Seizures in Pediatrics: Role of Extrapolation. Paediatric Drugs. 20 (3), 249-264 (2018).
- Avoli, M., et al. Specific imbalance of excitatory/inhibitory signaling establishes seizure onset pattern in temporal lobe epilepsy. Journal of Neurophysiology. 115 (6), 3229-3237 (2016).
- Badawy, R. A., Freestone, D. R., Lai, A., Cook, M. J. Epilepsy: Ever-changing states of cortical excitability. Neuroscience. 222, 89-99 (2012).
- Loscher, W., Brandt, C. Prevention or modification of epileptogenesis after brain insults: experimental approaches and translational research. Pharmacological Reviews. 62 (4), 668-700 (2010).
- Porter, R. J. Mechanisms of action of new antiepileptic drugs. Epilepsia. 30, Suppl 1. S29-34, discussion S64-28 (1989).
- Rogawski, M. A. Diverse mechanisms of antiepileptic drugs in the development pipeline. Epilepsy Research. 69 (3), 273-294 (2006).
- Czapinski, P., Blaszczyk, B., Czuczwar, S. J.
- Ye, H., Kaszuba, S. Inhibitory or excitatory? Optogenetic interrogation of the functional roles of GABAergic interneurons in epileptogenesis. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 93 (2017).
- Loscher, W., Klitgaard, H., Twyman, R. E., Schmidt, D. New avenues for anti-epileptic drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 757-776 (2013).
- Manchishi, S. M. Recent Advances in Antiepileptic Herbal Medicine. Current Neuropharmacology. 16 (1), 79-83 (2018).
- Pitkanen, A., Sutula, T. P. Is epilepsy a progressive disorder? Prospects for new therapeutic approaches in temporal-lobe epilepsy. Lancet Neurology. 1 (3), 173-181 (2002).
- Cohen, I., Navarro, V., Clemenceau, S., Baulac, M., Miles, R. On the origin of interictal activity in human temporal lobe epilepsy in vitro. Science. 298 (5597), 1418-1421 (2002).
- Huberfeld, G., et al. Glutamatergic pre-ictal discharges emerge at the transition to seizure in human epilepsy. Nature Neuroscience. 14 (5), 627-634 (2011).
- Bui, A., Kim, H. K., Maroso, M., Soltesz, I. Microcircuits in Epilepsy: Heterogeneity and Hub Cells in Network Synchronization. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 5 (11), (2015).
- Prince, D. A., Gu, F., Parada, I. Antiepileptogenic repair of excitatory and inhibitory synaptic connectivity after neocortical trauma. Progress in Brain Research. 226, 209-227 (2016).
- Nilsen, K. E., Cock, H. R. Focal treatment for refractory epilepsy: hope for the future. Brain Research: Brain Research Reviews. 44 (2-3), 141-153 (2004).
- Martinkovic, L., Hecimovic, H., Sulc, V., Marecek, R., Marusic, P. Modern techniques of epileptic focus localization. International Review of Neurobiology. 114, 245-278 (2014).
- Nagaraj, V., et al. Future of seizure prediction and intervention: closing the loop. Journal of Clinical Neurophysiology. 32 (3), 194-206 (2015).
- Osman, G. M., Araujo, D. F., Maciel, C. B.
- Slezia, A., et al. Uridine release during aminopyridine-induced epilepsy. Neurobiology of Disease. 16 (3), 490-499 (2004).
- Baranyi, A., Feher, O. Convulsive effects of 3-aminopyridine on cortical neurones. Electroencephalography Clinical Neurophysiology. 47 (6), 745-751 (1979).
- Szente, M., Baranyi, A. Mechanism of aminopyridine-induced ictal seizure activity in the cat neocortex. Brain Research. 413 (2), 368-373 (1987).
- Proctor, C. M., et al. Electrophoretic drug delivery for seizure control. Science Advances. 4 (8), eaau1291 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. Paxinos and Franklin’s the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates Fourth Edition. , Academic Press. (2012).
- Pinault, D. A new stabilizing craniotomy-duratomy technique for single-cell anatomo-electrophysiological exploration of living intact brain networks. Journal of Neuroscience Methods. 141 (2), 231-242 (2005).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Picot, M. C., Baldy-Moulinier, M., Daures, J. P., Dujols, P., Crespel, A. The prevalence of epilepsy and pharmacoresistant epilepsy in adults: a population-based study in a Western European country. Epilepsia. 49 (7), 1230-1238 (2008).
- Pati, S., Alexopoulos, A. V. Pharmacoresistant epilepsy: from pathogenesis to current and emerging therapies. Cleve Clinical Journal of Medicine. 77 (7), 457-467 (2010).
