Summary
Aquí presentamos un protocolo para aislamiento de células de la pulpa Dental humana y propagación con el fin de evaluar la expresión de la proteína del prión durante el proceso de diferenciación neuronal.
Abstract
Cuestiones bioéticas relacionadas con la manipulación de células madre embrionarias han impedido avances en el campo de la investigación médica. Por esta razón, es muy importante obtener las células madre adultas de diferentes tejidos como el adiposo, cordón umbilical, médula ósea y sangre. Entre las posibles fuentes, la pulpa dental es particularmente interesante porque es fácil de obtener con respecto a consideraciones bioéticas. De hecho, células de madre pulpa Dental humana (hDPSCs) son un tipo de células madre adultas capaces de diferenciarse en células neuronales y puede obtenerse desde el tercer molar de pacientes sanos (edades de 13-19). En particular, la pulpa dental elimina con una excavadora, cortar en pequeñas rodajas, trataron con colagenasa IV y cultivada en un matraz. Para inducir la diferenciación neuronal, hDPSCs fueron estimuladas con EGF/bFGF durante 2 semanas. Previamente, hemos demostrado que durante el proceso de diferenciación del contenido de priónica celular proteína (PrPC) en hDPSCs aumentado. El análisis cytofluorimetric mostró una expresión temprana de PrPC que aumentó después del proceso de diferenciación neuronal. Ablación de PrPC por siRNA PrP previene la diferenciación neuronal inducida por EGF/bFGF. En este artículo ilustramos que mejoramos el aislamiento, separación y en vitro métodos de cultivo de hDPSCs con varios procedimientos fáciles, más eficientes células clones eran obtenido y gran expansión de las células madre mesenquimales (MSCs) se observó. También mostramos cómo hDPSCs, obtenidos con métodos detallados en el protocolo, son un excelente modelo experimental para estudiar el proceso de diferenciación neuronal de MSCs y los procesos celulares y moleculares posteriores.
Introduction
Las células madre mesenquimales se han aislado de varios tejidos, incluyendo la médula ósea, sangre del cordón umbilical, la pulpa dental humana, tejido adiposo y sangre1,2,3,4,5 , 6. según varios autores, hDPSCs Mostrar adhesión de plástico, una típica morfología de fibroblasto-como. Estos representan una población muy heterogénea con diferentes clones y diferencias en la capacidad proliferativa y de diferenciación7,8. hDPSCs expresan marcadores específicos de células madre mesenquimales (es decir, CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), son negativos para algunos marcadores hematopoyéticos (como CD14 y CD19) y son capaces de diferenciación in vitro del multilineage9, 10,11.
Varios autores han demostrado que estas células son capaces de diferenciarse en neuronas-como las células utilizando diferentes protocolos, que incluyen la adición de NGF, bFGF, EGF en combinación con determinados medios y suplementos de7,12. Además, muchas proteínas están involucradas durante el proceso de diferenciación neuronal y, entre estos, varios trabajos muestran un papel relevante y significativa expresión de la proteína priónica celular (PrPC), tanto en las células madre embrionarias y adultas13, 14. PrPC representa una molécula pleiotrópica capaz de realizar diferentes funciones dentro de las células como cobre metabolismo, apoptosis, y resistencia a oxidativo estrés15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
En nuestro anterior documento23, investigamos el papel de PrPC en el proceso de diferenciación neuronal hDPSCs. De hecho, hDPSCs expresar precozmente PrPC y, después de la diferenciación neuronal, fue posible observar un aumento adicional. Otros autores la hipótesis de un posible papel del PrPC en los procesos de diferenciación neuronal de células madre. De hecho, PrPC conduce a la diferenciación de células madre embrionarias humanas en neuronas, oligodendrocitos y astrocitos24. El propósito de este estudio era hacer hincapié en la metodología para la obtención de células madre de pulpa dental, su proceso de diferenciación y la función de PrPC durante la diferenciación neuronal.
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Protocol
Terceros molares en el estudio fueron suprimidos de los pacientes (13-19 años) sin historia previa de consumo de alcohol o drogas, todas para no fumadores y con adecuada higiene oral. En el día de la explicación, en el Departamento de ciencia odontología y maxilofacial de la Universidad "Sapienza" de Roma, se obtuvo consentimiento informado de los pacientes o los padres. Consentimiento informado se obtuvo basado en consideraciones éticas y la aprobación del Comité de ética.
1. el diente y la extracción de la pulpa Dental
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Preparación de medio apropiado para la conservación o el transporte.
- Preparar media baja concentración modificado Eagle de Dulbecco de glucosa (DMEM-L) con L-glutamina (494,5 mL).
- Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) y 0.5 mL de anfotericina (0,1%).
- Extraer el tercer molar de la paciente, rápidamente lavar con PBS, colocar en un tubo de ensayo de 15 mL con el medio y transferir al laboratorio en menos de 2 h.
- Bajo una campana de biohazard, abrir el diente con una fresa de pasada de corte coronal paralelo y tangente a través del techo de la cámara pulpar.
- Suavemente Retire la pulpa con una excavadora pequeña y colóquela en un tubo de ensayo.
- Lavar con PBS tres veces y centrifugar a 2.500 x g durante 10 min a TA.
2. procesamiento de la pulpa Dental y liberación de células madre
- Eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en solución de Hank y colocar en una placa Petri. Incubar por 2 h a 37 ° C en 5% CO2.
-
Tipo de preparación de solución de colagenasa IV.
- Preparar 0,8 mL de DMEM-L.
- Derretir 1 mg de colagenasa de tipo IV en 0,8 mL de DMEM-L y agitar durante varios minutos.
- Agregar DMEM-L a tener una concentración final 1 mL 1 mg/mL.
- Filtrar la solución con un filtro de 0,22 μm.
- Retire la solución de Hank por centrifugación a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente y dividir la pulpa en rebanadas pequeñas de aproximadamente 1 mm cada uno con un bisturí desechable.
- Colocar las rebanadas de la pulpa en un plato de petri e incubar con 1 mL de colagenasa tipo IV durante 15 min a 37 ° C en 5% CO2.
-
Preparación de medio de cultivo (500 mL).
- A 445 mL de DMEM-L con L-glutamina.
- Añadir 50 mL de suero bovino Fetal (FBS) (10%).
- Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).
- Centrifugar la muestra a 2.500 x g durante 10 min a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante, Resuspender el precipitado en el medio (paso 2.5) y la cultura en T25 frasco específico para células madre a 37 ° C en 5% CO2.
3. propagación y cultivo de células de vástago
- Cada día Compruebe la cultura y, después de 3 días de crecimiento, observar diferentes clones de células adherentes dentro de la mufla.
- Cada 3 días cambiar el medio de cultivo.
- Entre 7 y 12 días, una vez que las células adherentes tienen alcance confluencia, separar la les, tratar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C o con la ayuda de un raspador celular.
- Añadir 4 ml (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina.
- Centrifugue la suspensión de células de 6 min a 259 x g, quite el sobrenadante y colocar las células en un frasco de T25 para propagar.
Nota: Cada 3 días las células llegar a confluencia. - Se propagan las células hasta los 21 o 28 días (aproximadamente 6-8 pasos) para evitar la presencia de no madre como las células en el cultivo.
- Separar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37 ° C o raspando suavemente. Centrifugue la suspensión de células de 6 min a 259 x g.
- Quite el sobrenadante y las células para el análisis de cytofluorimetric (paso 6).
4. transitorio PrPC silenciar por siRNA
- Las placas de 6 pozos de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5) por 24 h de cultivo.
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Al día siguiente, preparar medio de PrP de siRNA (400 μL).
- A un tubo de ensayo estéril, añadir 384 μl DMEM-L.
- Añadir 1 μl de cada tipo de siRNA PrP DMEM-l para una concentración final de 5 nM (4 siRNA PrP fueron utilizados y verificados por el proveedor para garantizar una eficiencia de precipitación ≥70%).
- Añadir 12 μl de transfectionreagent DMEM-l.
- Vórtice la mezcla e incubar 10 min a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de transfección.
- Añadir 400 μL de medio de PrP siRNA a cada muestra e incubar durante 6 h a 37 ° C.
- Sin descartar el medio de PrP de siRNA, añadir 1,6 mL (relación de 1 a 5) del medio de cultivo (paso 2.5).
- Salir de las células durante 72 h a 37 ° C.
- Quite el sobrenadante y lavar 3 veces con 2 mL de PBS a TA.
- Añadir 2 mL de medio de cultivo neuronal por 7 o 14 días (paso 5.1).
- Cambiar el medio de cultivo neuronal cada 3 días.
Nota: Reemplazar el siRNA PrP solución cada reemplazo de tiempo el medio de cultivo neuronal. - En el final del tiempo, lavar 3 veces con 2 mL de PBS a temperatura ambiente y prueba de antígenos de la superficie neuronales por análisis de Western Blot.
5. neuronal proceso de inducción de hDPSCs
-
Preparación de medio de cultivo neuronal (500 mL).
- Preparar 444,7 mL de medio basal a las células neuronales.
- Al medio de añadir 50 mL de suplemento libre de suero que utiliza para apoyar la viabilidad a largo plazo de células embrionarias y adultas del vástago neuronales (10%).
- Añadir 200 μL de básico Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) (concentración final 40 ng/mL) y 100 μl de Factor de crecimiento epidérmico (EGF) en el medio (concentración final 20 ng/mL).
- Añadir 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) en el medio.
- Cultura hDPSCs en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/mL) hasta 28 días de la separación de la pulpa y estimular con 2 mL de medio de cultivo neuronal.
- Cada 3 días deseche el sobrenadante y lavar 3 veces con 2 mL de PBS a temperatura ambiente vuelva a colocar 2 mL de medio de cultivo neuronal.
- Después de 7 o 14 días, separar las células con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C o suavemente con una espátula.
- Añadir 4 mL (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina.
- Prueba para la presencia de antígenos de superficie neuronales (paso 6) o la expresión de la proteína del prión (paso 7) por análisis de citometría de flujo.
6. Caracterización de la hDPSCs por citometría de flujo
- Estromal mesenquimal (MSC) de seleccionar-antígenos de superficie específicos o neuronales.
- La cultura hDPSCs en placas de 6 pocillos (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5).
- Soltar hDPSCs a los 28 días de la separación de la pulpa dental o después de 14 días de medio de cultivo neuronal (paso 5.1) con 1 mL de tripsina-EDTA durante 3 minutos a 37 ° C o ligeramente raspador.
- Añadir 4 ml (relación 1:5) del medio de cultivo (paso 2.5) para detener la acción de la tripsina y centrifugado a 259 x g durante 6 min a TA. lavar otro 2 veces con 2 mL de PBS a TA.
- Fijar la hDPSCs no tratada o tratada con paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a 4 ° C.
- Permeabilizar hDPSCS con tensioactivo no iónico 0,1% (v/v) en PBS durante 10 minutos adicionales a TA.
- Realizar el bloqueo con 5% leche en polvo descremada en 1 mL de PBS durante 1 h a TA.
- Lavar 3 veces con 1 mL de PBS e incubar las células con anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 las células), anti β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 células), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 células) y anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 células) mAb por 1 h a TA.
- Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS e Incube anti-ratón PE (1:50 / 5 x 105 células) o anti-conejo CY5 (1:50 / 5 x 105 células) mAb para adicional 1 h a TA.
- Utilizar los anticuerpos secundarios para bloquear las células immunopositive (PE anti-ratón o anti-conejo CY5 mAb) y analizar todas las muestras con un citómetro de flujo y adquirir por lo menos 20.000 eventos.
7. evaluación de la expresión de PrPC en hDPSCs por análisis de citometría de flujo
- Las placas de 6 pozos de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) con 2 mL de medio de cultivo (paso 2.5) de la cultura.
- Quitar hDPSCs a los 21 y 28 días de la separación de la pulpa dental y después de 7 o 14 días con medio de cultivo neuronal (paso 5.1) con 1 mL de tripsina-EDTA y detener la acción de la tripsina como se describe en el paso 6.4. Fijar a las muestras con paraformaldehído al 4% en PBS por 10 min a 4 ° C.
- Permeabilizar con 0,1% (v/v) no iónicos surfactantin PBS durante 10 minutos en RT. eliminar el sobrenadante y las células con conejo anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 células) la mancha mAb por 1 h a RT. incubar con anti-conejo CY5 (1:50 / 5 x 105 células) mAb para adicional 1 h a TA.
- Analizar todas las muestras con un citómetro de flujo y adquirir por lo menos 20.000 eventos.
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Representative Results
Los procedimientos de aislamiento y separación de hDPSCs de la pulpa dental, obtenida del tercer molar, son procesos complejos en que pequeños cambios pueden provocar un resultado ruinoso. En este trabajo, utilizamos el protocolo de Arthur et al.. 12 con varias mejoras. Figura 1muestra un esquema representativo de los procedimientos.
hDPSCs representa una población heterogénea de células con distintos clones y diferencias en la capacidad proliferativa y de diferenciación7,8. Después de la separación de la pulpa y la siembra de pequeños fragmentos de pulpa, observamos grupos de células en expansión en la periferia. La figura 2 muestra un pequeño grupo de células en 1 día (panel izquierdo), 4 (panel central) y 7 días (panel derecho) de la separación de la pulpa dental. Generalmente, estos racimos de células crecen hasta alcanzar la confluencia aproximadamente entre 7 y 12 días.
Estas células, después de la diferenciación neuronal inducida por EGF/bFGF, reducen su crecimiento y, después de dos semanas es posible observar cambios significativos en la consecuencia de morfología y los neurites de la célula (figura 3).
En la figura 4, mostramos que hDPSCs express multipotentes mesenquimales estromales específicos antígenos de superficie como CD44, CD90, CD105, CD73 y STRO-15,9. De lo contrario, tras estímulos de inducción neuronal apropiado, hDPSCs expresan marcadores neuronales específicos como β3-tubulina, NFH y GAP43. hDPSCs, estímulos no tratada o tratada con inducción neuronal, no expresan marcadores hematopoyéticos como CD14 y CD19.
En la figura 5, nos muestran que hDPSCs expresar precozmente PrPC (21 y 28 días) y, tras el proceso de diferenciación neuronal inducido por EGF/bFGF adicional 7 y 14 días, el PrPC contenido mayor (figura 5A). Ya que varios autores informaron que el PrPC está implicada en la diferenciación neuronal celular, evaluamos el papel del PrP endógenaC en este proceso. Por lo tanto, un ARN interferente pequeño (siRNA PrP) se aplicó para ablar PrPC y su función. Tratamiento previo con siRNA para 72 h antes estímulos de EGF/bFGF por 14 días evita la expresión de marcadores neuronales B3-tubulina y NHF (figura 5B). Los datos muestran que el silenciamiento de PrPC por siRNA afectado el proceso de diferenciación neuronal de hDPSCs, inducida por EGF/bFGF después de 2 semanas.
Figura 1 : Esquema de la separación de la pulpa Dental del tercer molar. El diente se ha abierto con una herramienta de corte por pasada de corte coronal paralelo y tangente a través del techo de la cámara pulpar y la pulpa era suavemente bajo condiciones estériles con una excavadora pequeña y colocada en un tubo de ensayo. La pulpa, después del tratamiento de solución de hank, fue cortada en rodajas y tratada con colagenasa IV durante 15 min y propagada en un matraz T25. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : hDPSCs morfología en diferentes días de la separación de la pulpa dental por microscopio de contraste de fase. Morfología del hDPSCs de la pulpa dental en días distintos (1, 4, 7) de la separación de la pulpa dental. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Consecuencia del Neurite de hDPSCs por microscopio de contraste de fase. Morfología de hDPSCs de dental de la pulpa no tratada o tratada con EGF/bFGF durante 14 días. Barras de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : caracterización de la hDPSCs. Análisis de citometría de flujo de CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-tubulina, NFH y GAP43 expresión hDPSCs sin tratamiento o tratamiento con EGF/bFGF durante 14 días. Histogramas representan log fluorescencia vs numero de celular, terreno en la población de la célula de un histograma de dispersión (SS/FS) de dispersión/adelante de lado. Cada panel se comparó con los correspondientes anticuerpos secundarios como control negativo. Se muestra un experimento representativo entre 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Papel del PrPC durante la diferenciación neuronal de hDSPCs. (A) análisis Cytofluorimetric de la expresión de PrPC no tratan (21 y 28 días de la separación de la pulpa dental) y después de 7 y 14 días con medios de inducción neuronal EGF/bFGF. Cada panel se comparó con el correspondiente control de negativo del isotipo IgG. Se muestra un experimento representativo entre 3. (B) análisis de Western blot de marcadores neuronales β3-tubulina y de expresión de NFH (28 días de la separación de la pulpa dental) y después de 14 días con medios de inducción neuronal EGF/bFGF en la presencia o ausencia de siRNA PrP. Esta figura 5 (A, B) se ha modificado del "Papel de los complejos multimoleculares de prión proteína EGFR durante la diferenciación neuronal de dentales pulpa derivada de células madre humanas" 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este trabajo, nos enfocamos en la metodología para el aislamiento y la diferenciación neuronal de hDPSCs; Además, evaluamos el papel del PrPC en este proceso. Existen varios métodos para aislar y diferenciar hDPSCs neurona-como las células y pasos críticos durante el proceso. hDPSCs son capaces de diferenciarse en varios linajes como condroblastos, adipocitos, osteoblastos y las neuronas. En nuestro trabajo, hemos investigado los mecanismos de la diferenciación neuronal y la presencia de PrPC. Como hemos comentado anteriormente, estas células expresan típico mesenquimales estroma específico antígenos de superficie como el CD44, CD90, CD105, CD73 y STRO-110,25,26.
En el protocolo, varios pasos críticos pueden provocar el fracaso del procedimiento de separación. El primer paso crítico es representado por la elección de pacientes27. En nuestra experiencia, encontramos que aumento de la edad de los donantes (> 20) reduce gradualmente la capacidad de proliferación y diferenciación de células madre. En nuestros experimentos, hemos utilizado terceros molares suprimidos de pacientes de 13 a 19 años de edad y sin historia previa de consumo de alcohol o drogas, todas para no fumadores y con adecuada higiene oral.
El segundo paso crítico está representado por la elección de la enzima para separar las células del tejido pulpar, que podría representar el principal paso caliente de procedimiento de la separación de las células madre. De hecho, nos dimos cuenta de que un amplio uso de colagenasa I y II, enzimas que pueden ser demasiado agresivo, puede dañar las células presentes en el tejido de la pulpa durante el proceso de separación. Por esta razón, decidimos utilizar la colagenasa IV porque este tipo de colagenasa como menor actividad tríptica que colagenasa tipo I y II. Siguiendo exactamente el procedimiento, es posible obtener células madre en el 90% de los dientes tratados.
Después de la separación, la solución que contiene hDPSCs se cultiva en frascos apropiados hasta el paso 6° (aproximadamente 21-28 días) para evitar la presencia de no-células madre en la cultura. A los 28 días, fueron probados para la presencia de antígenos mesenquimales típicos (como referido anteriormente) y utilizados para los experimentos sólo cuando eran positivas. De hecho, a pesar de los progresos realizados a lo largo de años en hDPSCs, hay todavía importantes limitaciones representaron por la extrema heterogeneidad de la población.
Como se muestra por varios autores, hay diferentes población tipos de células en la pulpa dental y, hasta la fecha, ha desconocido lo que es los mejores fenotipos capaces de diferenciar en cada estirpe mesenquimal (condroblastos, adipoblastos, osteoblastos o neuronas). Para evitar las limitaciones de nuestros y otros procedimientos, el paso siguiente será seleccionar las poblaciones celulares con fenotipos específicos utilizando anticuerpos monoclonales específicos.
En trabajos anteriores, hemos mostrado que la PrPC se expresa de hDPSCs. De hecho, es posible observar una positividad débil en 21 días y un aumento del contenido de PrPC a los 28 días. Además, se observó que durante la inducción neuronal EGF/bFGF-mediada, contenido de PrPC fue incrementado. Además, investigamos el papel de PrP endógenaC en proceso de inducción neuronal de hDPSCs. El silenciamiento transitorio de PrPC previene el proceso de diferenciación de hDPSCs inducida por EGF/bFGF23.
Perfeccionado y había mejorado los métodos de aislamiento, separación y cultivo in vitro de hDPSCs con procedimientos sencillos y versátiles. Estas innovaciones permiten obtener clones de células más eficientes y la expansión a gran escala de las células madre mesenquimales. También, sugerimos que los hDPSCs son un excelente modelo experimental para el estudio de mecanismos celulares y moleculares del proceso de diferenciación neuronal de MSCs.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la "Fondazione Varrón" y Rieti Universidad "Sabina Universitas" a Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) reimpreso con el permiso de la editorial Taylor & Francis Ltd de: complejos multimoleculares de papel de prión proteína EGFR durante la diferenciación neuronal de dentales pulpa derivada de células madre humanas. Martellucci, S., V. de Manganelli, Santacroce C. F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei prión. 2018 4 de Mar. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
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