Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59282
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,2, 3, 3, 2, 2, 1,2
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

Summary

כאן אנו מציגים עבור בידוד תאי גזע זולה שיניים האנושי והתפשטות פרוטוקול על מנת להעריך את הביטוי חלבון פריאון בתהליך בידול עצביים.

Abstract

Bioethical נושאים הקשורים המניפולציה של תאי גזע עובריים יש הפריע ההתקדמות בתחום המחקר הרפואי. מסיבה זו, חשוב מאוד לקבל בתאי גזע בוגרים רקמות שונות כמו שומן, חבל הטבור, מח עצם ודם. בין מקורות אפשריים, עיסת שיניים הוא מעניין במיוחד כי זה קל להשיג בגין שיקולים bioethical. אכן, שיניים זולה תאי גזע אנושי (hDPSCs) הם סוג של תאי גזע בוגרים מסוגלים להבדיל תאים עצביים כמו, ניתן להשיג את השן הטוחנת השלישית של מטופלים בריאים (גילאי 13-19). בפרט, הציפה שיניים היה להסיר עם החופר, וחותכים לפרוסות, שטופלו collagenase הרביעי ותרבותית בבקבוקון. כדי לעודד את הבידול עצביים, hDPSCs היו מגורה עם EGF/bFGF 2 שבועות. בעבר, הראו כי במהלך תהליך התמיינות התוכן של פריון הסלולר חלבון (PrPC) hDPSCs מוגבר. הניתוח cytofluorimetric הראה ביטוי מוקדם PrPC זה גדל לאחר תהליך התמיינות עצביים. אבלציה של PrPC על ידי siRNA PrP מנעו בידול עצביים שנגזרות EGF/bFGF. בנייר זה, אנו ממחישים כי כפי שאנחנו משופרת של בידוד, ההפרדה ושיטות במבחנה הטיפוח של hDPSCs עם מספר הליכים קל, יעיל יותר תא שיבוטים היו הרחבת שהושג, בקנה מידה גדול גזע mesenchymal (MSCs) נצפתה. אנו גם מראים hDPSCs, שהושג עם שיטות מפורטות בפרוטוקול, מה שלומך. מדגם ניסיוני מצוינת ללמוד את תהליך התמיינות עצביים של MSCs ותהליכים תאית ומולקולרית עוקבות.

Introduction

גזע mesenchymal היה מבודד מספר רקמות, כולל מח עצם, דם טבורי, אנושית זולה שיניים, רקמת שומן, דם1,2,3,4,5 , 6. כפי שדווח על ידי מספר סופרים, hDPSCs להראות הדבקות מפלסטיק, מורפולוגיה פיברובלסט דמוי טיפוסי. אלה מייצגים אוכלוסיה הטרוגנית מאוד עם שיבוטים נפרדות וההבדלים המקדימות, המבדילים קיבולת7,8. hDPSCs אקספרס סמנים ספציפי עבור גזע mesenchymal (קרי CD44, CD90, CD73, CD105, כלי קשת-1), הם שליליים עבור כמה סמנים hematopoietic (כגון CD14 ו- CD19), מסוגלים במבחנה בידול multilineage9, 10,11.

מספר סופרים הראו כי תאים אלה הם מסוגלים להבדיל לתוך נוירון כמו תאים באמצעות פרוטוקולים שונים, כולל התוספת של גורם הגדילה העצבי, bFGF, EGF בשילוב עם ספציפי מדיה ותוספי7,12. בנוסף, חלבונים רבים מעורבים בתהליך בידול עצביים ולהראות, בקרב אלו, בכמה עיתונים תפקידים רלוונטיים ושניהם ביטוי משמעותי של חלבון פריאון הסלולר (PrPC), תאי גזע עובריים והוא בוגר13, 14. PrPC מייצג מולקולה pleiotropic המסוגלים לבצע פונקציות שונות בתוך תאים כמו מטבוליזם נחושת, אפופטוזיס, ואת התנגדות חימצוני מתח15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

שלנו הקודם נייר23, חקרנו את התפקיד של PrPC בתהליך בידול עצביים hDPSCs. למעשה, hDPSCs אקספרס precociously PrPC וזה, אחרי בידול עצביים, היה ניתן לצפות להגדלה נוספת. מחברים אחרים שיערו תפקיד אפשרי של PrPC בתהליכים עצביים התמיינות של תאי גזע. אכן, PrPC מניע את הבידול של תאי גזע עובריים לתוך הנוירונים oligodendrocytes להפוך, האסטרוציטים24. מטרתו של מחקר זה היה כדי להדגיש את המתודולוגיה להשגת בתאי גזע של שיניים זולה, תהליך הבידול שלו ואת התפקיד של PrPC במהלך התמיינות עצביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השן הטוחנת השלישית השתמשו במחקר היו טוחנות מחולים (בן 13-19 שנים) ללא היסטוריה קודמת של סמים או צריכת אלכוהול, עישון כל ועם היגיינת הפה המתאים. ביום של הסבר, מחלקת המדע לרפואת שיניים, Maxillofacial של "ספיאנצה"-אוניברסיטת רומא, הסכמה מדעת הושג המטופלים או ההורים. הסכמה מדעת הושג בהתבסס על שיקולים אתיים ואישור של ועדת האתיקה.

1. השן והפקת זולה שיניים

  1. הכנת בינונית המתאימה עבור שימור או תחבורה.
    1. הכנת ריכוז נמוך בינוני ששינה הנשר של Dulbecco של גלוקוז (DMEM-L) עם L-גלוטמין (494.5 מ"ל).
    2. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) 0.5 מיליליטר שהוא גוסס (0.1%).
  2. לחלץ את השן הטוחנת השלישית של המטופל, לשטוף אותו עם PBS, הכניסו למבחנה 15 מ"ל עם המדיום ובמהירות להעביר אותו למעבדה פחות מ 2 h.
  3. ברדס חומרים מסוכנים, לפתוח את השן בחותך עוברים חיתוך הילתית מקבילים, המשיק דרך הגג לשכת זולה.
  4. בעדינות להסיר הציפה עם מחפר קטנה ומניחים אותו במבחנה.
  5. לשטוף עם PBS שלוש פעמים, צנטריפוגה ב 2,500 x g 10 דקות ב- RT.

2. עיבוד של עיסת שיניים ושחרור תאי גזע

  1. הסר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בפתרון של האנק ולמקם אותו בצלחת פטרי. תקופת דגירה של 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
  2. הקלד הרביעי collagenase פתרון הכנה.
    1. להכין 0.8 מ של DMEM-ל'
    2. ממיסים 1 מ ג של סוג collagenase הרביעי ב- 0.8 מ של DMEM-L ו מערבולת למשך מספר דקות.
    3. הוספת DMEM-L עד 1 מ"ל יש ריכוז סופי 1 מ"ג/מ"ל.
    4. לסנן את הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
  3. להסיר את הפתרון של האנק על ידי צנטריפוגה ב x 2,500 g 10 דקות ב RT, לחלק את הציפה לפרוסות שנהנתם 1 מ"מ כל אחד באזמל חד פעמיות.
  4. מניחים את פרוסות זולה בצלחת פטרי, דגירה עם 1 מ"ל של הסוג הרביעי collagenase למשך 15 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.
  5. הכנה תרבות בינוני (500 mL).
    1. 445 מ של DMEM-L עם L-גלוטמין.
    2. להוסיף 50 מ של סרום שור עוברית (FBS) (10%).
    3. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%).
  6. Centrifuge הדגימה ב x 2,500 g 10 דקות ב RT, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר בטווח הבינוני (שלב 2.5) ותרבות T25 הבקבוק ספציפיות עבור תאי גזע-37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2.

3. תאי גזע התרבות והתפשטות

  1. כל יום לבדוק את התרבות ולבחון, לאחר 3 ימים של צמיחה, שיבוטים שונים של תאים חסיד בתוך הבקבוק.
  2. כל 3 ימים לשנות המדיום תרבות.
  3. בין 7 ל 12 יום, ברגע תאים חסיד שיש להגיע למפגש, לנתק אותם לטיפול תאי עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 ° C או בעדינות באמצעות המגרד של התא.
  4. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של המדיום תרבות (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין.
  5. Centrifuge התליה תא במשך 6 דקות ב x 259 גרם, להסיר את תגובת שיקוע ולמקם את התאים בבקבוקון T25 להפיץ.
    הערה: כל 3 ימים התאים להגיע למפגש.
  6. הפצת התאים עד 21-28 ימים (כ 6-8 קטעים) כדי למנוע הנוכחות של אי-גזע כמו תאים בתרבות.
  7. ניתוק התאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות 37 ° C או גירוד בעדינות. Centrifuge התליה תא במשך 6 דקות ב x 259 גרם.
  8. הוצא את תגובת שיקוע ובדוק את התאים לניתוח cytofluorimetric (שלב 6).

4. Silencing PrPC ארעי על-ידי siRNA

  1. תרבות צלחות 6-טוב hDPSCsin (2 x 105 תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5) במשך 24 שעות ביממה.
  2. יום אחרי, להכין siRNA PrP בינוני (400 µL).
    1. כדי מבחנה סטרילית, להוסיף 384 µL DMEM-ל'
    2. להוסיף 1 µL עבור כל סוג של siRNA PrP DMEM-L יש ריכוז הסופי של 5 nM (siRNA 4 PrP היו בשימוש ונבדקו על-ידי הספק כדי להבטיח של % ≥70 יעילות תמונות ציפורים).
    3. להוסיף 12 µL של transfectionreagent DMEM-ל'
    4. מערבולת התערובת דגירה 10 דקות ב RT כדי לאפשר הקמת מתחמי תרביות תאים.
  3. להוסיף μL 400 siRNA PrP בינוני כל דגימה, תקופת דגירה של 6-אייץ '-37 מעלות צלזיוס.
  4. ללא השמטת siRNA PrP בינונית, להוסיף 1.6 מ ל (יחס של 1 עד 5) של תרבות בינוני (שלב 2.5).
  5. להשאיר את התאים עבור 72 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  6. הסר את תגובת שיקוע ולשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT.
  7. להוסיף 2 מיליליטר עצביים תרבות בינוני 7 ו/או 14 ימים (שלב 5.1).
  8. לשנות את המדיום תרבות עצביים כל 3 ימים.
    הערה: החלף siRNA PrP פתרון כל הזמן להחליף המדיום תרבות עצביים.
  9. בסוף הזמן, לשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT ולבדוק עבור עצביים אנטיגנים משטח על ידי ניתוח המערבי כתם.

5. העצבית תהליך אינדוקציה של hDPSCs

  1. הכנה עצביים תרבות בינוני (500 mL).
    1. להכין 444.7 מ של מדיה הבזליים שניסח תאים עצביים.
    2. למדיום להוסיף 50 מ של סרום ללא תוספת משמש לתמיכה הכדאיות לטווח ארוך של עובריים והוא בוגר גזע תאים עצביים (10%).
    3. להוסיף 200 µL של בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF) (הריכוז הסופי 40 ng/mL) ו- 100 µL של גורם גדילה עוריות (EGF) המדיום (ריכוז סופי 20 ng/mL).
    4. הוסף 5 מ של פניצילין/סטרפטומיצין (1%) למדיום.
  2. תרבות hDPSCs ב 6-ובכן צלחות (2 x 105 תא/mL) עד 28 ימים מן ההפרדה זולה ולעורר אותם עם 2 מ"ל של מדיום תרבות עצביים.
  3. כל 3 ימים למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף 3 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT ולהחליף 2 מ"ל של המדיום תרבות עצביים.
  4. אחרי 7 ו/או 14 ימים, ניתוק התאים עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות ב 37 ° C או בעדינות עם מגרד.
  5. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של תרבות בינוני (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין.
  6. מבחן הנוכחות של אנטיגנים משטח עצביים (שלב 6) או לביטוי חלבון פריאון (שלב 7) על ידי ניתוח cytometry זרימה.

6. אפיון של hDPSCs מאת Flow Cytometry

  1. בחר mesenchymal סטרומה (MSC)-אנטיגנים משטח ספציפי או עצביים.
  2. תרבות של hDPSCs ב 6-ובכן צלחות (2 x 105 תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5).
  3. ניתוק hDPSCs ב- 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה או לאחר 14 ימים של תרבות עצביים בינוני (שלב 5.1) עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA למשך 3 דקות 37 ° C או בעדינות המגרד.
  4. להוסיף 4 מ"ל (יחס 1:5) של תרבות בינוני (שלב 2.5) כדי להפסיק פעולה טריפסין ולשטוף centrifugate-259 x g עבור 6 דקות ב RT. עוד 2 פעמים עם 2 מ של PBS ב RT.
  5. לתקן את hDPSCs אינו מטופל או מטופלים עם paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב 4 º C.
  6. Permeabilize hDPSCS עם 0.1% (v/v) ללא יונית חומרים פעילי שטח ב- PBS נוספים 10 דקות ב- RT.
  7. לבצע חסימת עם 5% שומן חלב יבשים 1 מ"ל של PBS עבור h 1-RT.
  8. לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS, דגירה התאים עם אנטי-CD105 (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-CD44 (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-לתזמורת כלי קשת-1 (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-CD90 (מטריים / 5 x 105 תאים), אנטי-CD73 (מטריים / 5 10x5 תאים), אנטי β3-טובולין (בטחונות / 5 x 105 תאים), אנטי-NFH (בטחונות / 5 x 105 תאים) ו- anti-GAP43 (בטחונות / 5 x 105 תאים) mAb עבור 1 h RT.
  9. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל ל- PBS, דגירה עם אנטי-העכבר PE (1:50 / 5 x 105 תאים) או ארנב אנטי CY5 (1:50 / 5 x 105 תאים) mAb לשעה נוספים ב- RT.
  10. להשתמש נוגדנים משניים עבור gating התאים immunopositive (אנטי-העכבר PE או ארנב אנטי CY5 mAb) לנתח כל הדגימות עם cytometer זרימה, לרכוש לפחות 20,000 אירועים.

7. הערכת ביטוי PrPC hDPSCs על ידי ניתוח Cytometry זרימה

  1. תרבות צלחות 6-טוב hDPSCsin (2 x 105 תא/mL) עם 2 מ של תרבות בינוני (שלב 2.5).
  2. ניתוק hDPSCs ב 21 ו 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה, אחרי 7 ו/או 14 ימים בינונית תרבות עצביים (שלב 5.1) עם 1 מ"ל של טריפסין-EDTA ולהפסיק את הפעולה טריפסין כפי שמתואר בשלב 6.4. לתקן את דגימות עם paraformaldehyde 4% ב- PBS 10 דקות ב 4 º C.
  3. Permeabilize עם 0.1% (v/v) ללא יונית surfactantin PBS 10 דקות ב RT. להסיר את תגובת שיקוע, מכתים את התאים עם הארנב אנטי-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 תאים) mAb עבור h 1 RT. Incubate עם הארנב אנטי CY5 (1:50 / 5 x 105 תאים) mAb עבור h 1 נוספים ב- RT.
  4. לנתח כל הדגימות עם cytometer זרימה ולרכוש אירועים לפחות 20,000.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ההליכים בידוד והפרדה של hDPSCs מ שיניים זולה, המתקבל טוחנת שלישית, הם תהליכים מורכבים בהם שינויים קטנים יכולים להוביל תוצאה הרסניות. בנייר זה, אנו משתמשים בפרוטוקול של ארתור et al. 12 עם מספר שיפורים. ערכה הנציג של נהלים מוצג באיור1.

hDPSCs מייצגת אוכלוסיה הטרוגנית של תאים עם שיבוטים נפרדות וההבדלים המקדימות, המבדילים קיבולת7,8. לאחר ההפרדה זולה, זריעה של רסיסים זעירים של ספרות זולה, הבחנו אשכולות של תאים להרחיב על הפריפריה. איור 2 מציג מקבץ קטן של תאים ב- 1 יום (החלונית הימנית), 4 ימים (הפאנל המרכזי) ו- 7 ימים (נכון לוח) מן ההפרדה שיניים זולה. באופן כללי, אלה אשכולות של תאים לגדול כדי להגיע למפגש כ בין 7 ל 12 יום.

תאים אלה, לאחר בידול עצביים שנגזרות EGF/bFGF, להפחית הצמיחה שלהם, וזה, אחרי שבועיים היה ניתן לצפות שינויים משמעותיים תא neurites ומורפולוגיה תוצר (איור 3).

איור 4, אנו מראים כי hDPSCs אינו מטופל להביע multipotent mesenchymal סטרומה ספציפי משטח אנטיגנים כגון5,של CD44 ', ' CD90 ', ' CD105 ', CD73, כלי קשת-1-9. אחרת, לאחר אינדוקציה עצביים המתאים לגירויים, hDPSCs אקספרס סמנים עצביים מסוימים כגון β3-טובולין, NFH ו- GAP43. hDPSCs, אינדוקציה עצביים אינו מטופל או מטופלים עם גירויים, שאינם מבטאים סמנים hematopoietic כגון CD14 ו- CD19.

איור 5, אנחנו מראים כי hDPSCs אקספרס precociously PrPC (21 ו- 28 יום), לאחר תהליך התמיינות עצביים שנגזרות EGF/bFGF ימים 7 ו-14 נוספים, PrPC תוכן מוגברת (איור 5א). מאז מספר סופרים דיווחו כי PrPC מעורב של התמיינות תאים עצביים, הערכנו את התפקיד של אנדוגני PrPC בתהליך זה. לכן, מפריעות קטן RNA (siRNA PrP) הוחל על ablate PrPC ואת תפקודה. רעלני עם siRNA במשך 72 h EGF/bFGF גירויים למשך 14 ימים לפני מונע את הביטוי של סמנים עצביים B3-טובולין, NHF (איור 5B). הנתונים מראים כי להחרשת PrPC על ידי siRNA מושפע תהליך התמיינות עצביים של hDPSCs, המושרה על ידי EGF/bFGF לאחר שבועיים.

Figure 1
איור 1 : ערכת פרידה שיניים מוך השן הטוחנת השלישית. השן נפתח בחותך על ידי חיתוך הילתית עוברים במקביל, המשיק דרך הגג לשכת זולה, הציפה היה בעדינות להסיר בתנאים סטריליים עם דחפור קטן והניח במבחנה. הציפה, לאחר טיפול פתרון של האנק, לחתוך לפרוסות, שטופלו collagenase הרביעי למשך 15 דקות, מופצות בבקבוקון T25. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : hDPSCs מורפולוגיה-שונים ימים עיסת שיניים ההפרדה על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. המורפולוגיה של hDPSCs מ שיניים זולה ב ימים שונים (1, 4, 7) מן ההפרדה שיניים זולה. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Neurite המוצלח hDPSCs על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. המורפולוגיה של hDPSCs מ שיניים ספרות זולה אינו מטופל או מטופלים עם EGF/bFGF למשך 14 ימים. גודל ברים = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

Figure 4
איור 4 : אפיון hDPSCs. ניתוח cytometry זרימה של CD44, CD90, CD105, CD73, כלי קשת-1, CD14, CD19, β3-טובולין, ביטוי NFH, GAP43 hDPSCs לא מטופל או מטופלים עם EGF/bFGF למשך 14 ימים. היסטוגרמות מייצגים יומן פלורסצנטיות vs . מספר הטלפון הנייד, פיקוח על התא אוכלוסיית היסטוגרמה לצד פיזור/קדימה פיזור (אס/FS) כל לוח נמשל עם נוגדנים משניים המתאימים כפקד שלילי. ניסוי נציג בין 3 מוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : התפקיד של PrPC במהלך התמיינות עצביים של hDSPCs. (א) Cytofluorimetric ניתוח של הביטוי PrPC מטופל (21 ו- 28 ימים עיסת שיניים ההפרדה), ואחרי ימים 7 ו-14 נוספים עם התקשורת העצבית אינדוקציה EGF/bFGF. כל לוח נמשל עם הפקד המתאים IgG שלילי isotype. ניסוי נציג בין 3 מוצג. (B) ניתוח תספיג של סמנים עצביים β3-טובולין וביטוי NFH (28 ימים עיסת שיניים ההפרדה) ואחרי יום נוספים עם אינדוקציה עצביים המדיה EGF/bFGF נוכחות או היעדרות של siRNA PrP. איור זה 5 (A, B) שונה מ- "תפקיד של פריון חלבון-EGFR קומפלקס multimolecular במהלך התמיינות עצביים של שיניים זולה-derived תאי גזע אנושי" 23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעבודה זאת, התמקדנו מתודולוגיה בידוד ובידול עצביים של hDPSCs; יתר על כן, הערכנו את התפקיד של PrPC בתהליך זה. ישנן מספר שיטות כדי לבודד, להבדיל hDPSCs תאים דמויי נוירון, שלבים קריטיים בתהליך. hDPSCs מסוגלים להבדיל ב מספר שושלות כגון chondroblasts, adipocytes, תאי העצם נוירונים. בעיתון שלנו, חקרנו את המנגנונים של בידול עצביים ואת נוכחותם של PrPC. כפי שצוין לעיל, תאים אלה מבטאים את טיפוסי mesenchymal סטרומה ספציפיים משטח אנטיגנים כגון CD44 ', ' CD90 ', ' CD105 ', CD73, כלי קשת-110,25,26.

בפרוטוקול, מספר שלבים קריטיים עלולה לגרום לכשל של ההליך ההפרדה. השלב הקריטי הראשון מיוצג על ידי הבחירה של חולים27. מניסיוננו, מצאנו בגיל הזה גדל והולך של תורמים (> 20) מפחיתה בהדרגה את היכולת של התפשטות התמיינות של תאי גזע. בניסויים שלנו, השתמשנו השלישי שיניים טוחנות מ חולים בגילאי 13-19 שנים, ללא היסטוריה קודמת של סמים או צריכת אלכוהול, עישון כל ועם היגיינת הפה המתאים.

השלב הקריטי השני מיוצג על ידי הבחירה של האנזים להפריד את תאי רקמת זולה, אשר יכול לייצג השלב חם הראשי של נוהל הפרדת תאי גזע. למעשה, הבנו כי שימוש רחב collagenase I ו- II, אנזימים יכולים להיות אגרסיביים מדי, עלול לגרום נזק תאי נוכח הרקמה זולה במהלך תהליך ההפרדה. מסיבה זו, החלטנו להשתמש collagenase הרביעי כי סוג זה של collagenase כפעילות tryptic נמוכה יותר מאשר collagenase מסוג I ו- II. בעקבות בדיוק הנוהל, זה ניתן לקבל בתאי גזע ב 90% של השיניים שטופלו.

לאחר ההפרדה, הפתרון המכיל hDPSCs הוא תרבותי במבחנות המתאים עד המעבר 6° (שנהנתם 21-28 יום) כדי למנוע הנוכחות של אי-תאי גזע בתרבות. ב 28 ימים, הם היו נבדקו לנוכחות של אנטיגנים mesenchymal טיפוסי (כמו הפניה לעיל), המשמש ניסויים רק כאשר הם היו חיוביות. למעשה, למרות ההתקדמות לאורך שנים על hDPSCs, ישנם עדיין חשוב מגבלות המיוצג על-ידי הטרוגניות קיצונית של האוכלוסייה.

כפי שמוצג על ידי מספר סופרים, ישנם סוגי האוכלוסייה התאים הציפה שיניים וזה, עד כה, ידוע מהו הפנוטיפים הטוב מסוגלים להבדיל לתוך כל השושלת mesenchymal (chondroblasts, adipoblasts, תאי העצם או נוירונים). כדי למנוע את המגבלות הנוכחי של הנהלים שלנו ואחרים, השלב הבא יהיה לבחור אוכלוסיות הסלולר עם פנוטיפים ספציפי באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ספציפיים.

בעבודה הקודמת, הראינו כי PrPC מתבטא מן hDPSCs. למעשה, זה ניתן לצפות חיוביות חלש של 21 ימים, עלייה של תוכן PrPC -28 ימים. יתר על כן, הבחנו כי במהלך EGF/bFGF-מתווכת ' אינדוקציה עצביים, תוכן PrPC היה גדל עוד יותר. יתר על כן, חקרנו את התפקיד של אנדוגני PrPC בתהליך אינדוקציה עצביים של hDPSCs. ארעי להחרשת PrPC מנעו את תהליך התמיינות hDPSCs שנגזרות EGF/bFGF23.

אנו יסודי, שיפור שיטות בידוד, הפרדה, טיפוח במבחנה של hDPSCs עם נהלים פשוטים ופסיביות. חידושים אלה מאפשרים קבלת שיבוטים תא יעיל יותר והרחבת גזע mesenchymal בקנה מידה גדול. כמו כן, אנו ממליצים כי hDPSCs הם מדגם ניסיוני מצוין לחקור מנגנונים תאית ומולקולרית של MSCs תהליך התמיינות עצביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי "דל'אנג'לו Varrone" ומרכז אוניברסיטה שעונה "סבינה Universitas" כדי וינצ'נצו מאטיי.

איור 5 (A, B) התפרסם בכתב מאת רשות של המפרסם טיילור & פרנסיס בע מ מ: תפקיד של פריון חלבון-EGFR מתחם multimolecular במהלך התמיינות עצביים של שיניים זולה-derived תאי גזע אנושי. Martellucci, ס., Manganelli ו', ג סנטקרוצ'ה, יצור פ, ל' פיקולי, Sorice מ, מאטיי ו' פריון. 2018 Mar 4. טיילור & פרנסיס בע מ

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B solution Sigma-Aldrich A2942 It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin Cell Signaling Technology  #4466 One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105  BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44 Millipore CBL154-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73  Cell Signaling Technology  13160 CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90 Millipore CBL415-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43  Cell Signaling Technology  #8945 Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE  Abcam ab7003 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH  Cell Signaling Technology  #2836 Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y  Abcam ab52604 Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5  Abcam ab6564 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1 Millipore MAB4315-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS Gibco by life technologies A14867-01 B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer  BD Biosciences AC6531180187 Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software  BD Biosciences Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF PeproThec, DBA 100-18B basic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30R Termo fisher Scientific 11210908 it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541 Termo fisher Scientific 317527-185 it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV  Life Technologies 17104019 Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel  Swann-Morton 501 It is use to cut tissues
DMEM-L Euroclone ECM0060L Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF PeproThec, DBA AF-100-15 Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine Serum Gibco by life technologies 10270-106 FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter Sarstedt 831,823,101 it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP Qiagen GS5621 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x Gibco by life technologies 240200083 The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent  Qiagen 301705 HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A  Gibco by life technologies 10888022 Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin  Euroclone ECB3001D  It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS) Euroclone ECB4004LX10  PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F Sarstedt 833,920,300 It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap Sarstedt 833,910,302 Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100  Sigma-Aldrich 9002-93-1 Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA  Euroclone ECB3052D  Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube Sarstedt 62,554,502 Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact Steril ST-003009000 Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope Zeiss 3849000962 ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
  2. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
  3. Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
  4. Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
  5. Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
  6. Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
  7. Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
  8. Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
  9. Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
  10. Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
  11. Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
  12. Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
  13. Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
  14. Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
  15. Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
  16. Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
  17. Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
  18. Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
  19. Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
  20. Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
  21. Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
  22. Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
  23. Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
  24. Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
  25. Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
  26. Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
  27. Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 145 שיניים זולה בתאי גזע בוגרים בתאי גזע mesenchymal תהליך התמיינות חלבון פריאון prions.
בידוד, הפצת וביטוי חלבונים פריון במהלך עצביים התמיינות של תאי גזע אנושי זולה שיניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martellucci, S., Santacroce, C.,… More

Martellucci, S., Santacroce, C., Manganelli, V., Santilli, F., Piccoli, L., Cassetta, M., Misasi, R., Sorice, M., Mattei, V. Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e59282, doi:10.3791/59282 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter