Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para isolamento de células-tronco polpa Dental humana e propagação a fim de avaliar a expressão da proteína príon durante o processo de diferenciação neuronal.
Abstract
Problemas bioéticos relacionados à manipulação de células-tronco embrionárias tem dificultado avanços no campo da pesquisa médica. Por esta razão, é muito importante obter células-tronco adultas de diferentes tecidos como adiposo, cordão umbilical, medula óssea e sangue. Entre as fontes possíveis, a polpa dental é particularmente interessante, porque é fácil de obter em relação às considerações bioéticas. Com efeito, Dental Pulp células estaminais humanas (hDPSCs) são um tipo de células-tronco adultas possam diferenciar em células neuronais e pode ser obtido o terceiro molar de pacientes saudáveis (idade 13-19). Em particular, a polpa dental foi removida com uma escavadeira, corte em fatias pequenas, tratada com colagenase IV e cultivada em um balão. Para induzir a diferenciação neuronal, hDPSCs foram estimulados com EGF/bFGF por 2 semanas. Anteriormente, temos demonstrado que durante o processo de diferenciação do conteúdo de celular prion proteínas (PrPC) no hDPSCs aumentaram. A análise cytofluorimetric mostrou uma expressão inicial de PrPC que aumentou após o processo de diferenciação neuronal. Ablação do PrPC por siRNA PrP impediu a diferenciação neuronal induzida pelo bFGF/EGF. Neste trabalho, ilustramos que como temos realçado o isolamento, separação e em vitro métodos de cultivo de hDPSCs com vários procedimentos fácil, mais eficientes clones de células foram obtido e em grande escala de expansão das células tronco mesenquimais (MSCs) observou-se. Também mostramos como os hDPSCs, obtidos com métodos detalhados no protocolo, são um excelente modelo experimental para estudar o processo de diferenciação neuronal de MSCs e subsequentes processos celulares e moleculares.
Introduction
Células-tronco mesenquimais foram isoladas de vários tecidos, incluindo a medula óssea, sangue de cordão umbilical, polpa dentária humana, tecido adiposo e sangue1,2,3,4,5 , 6. como relatado por vários autores, hDPSCs mostrar aderência de plástico, uma morfologia típica de fibroblasto tipo. Estes representam uma população altamente heterogênea com clones distintos e diferenças na capacidade proliferativa e diferenciação7,8. hDPSCs express marcadores específicos para células-tronco mesenquimais (ou seja, CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), são negativos para alguns marcadores hematopoiéticas (tais como o CD14 e CD19) e são capazes de diferenciação in vitro de multilineage9, 10,11.
Vários autores têm mostrado que essas células são capazes de se diferenciar em células neurônio usando protocolos diferentes, que incluem a adição de NGF, bFGF, EGF em combinação com o específico mídia e suplementos7,12. Além disso, muitas proteínas estão envolvidas durante o processo de diferenciação neuronal e, entre estes, vários trabalhos mostram um papel relevante e significativa expressão da proteína príon celular PrP (C), ambos em células-tronco adultas e embrionárias13, 14. PrPC representa uma molécula pleiotrópicos capaz de executar diferentes funções no interior das células como metabolismo de cobre, apoptose, e resistência à oxidativo estresse15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Nosso papel anterior23, investigamos o papel do PrPC no processo de diferenciação neuronal hDPSCs. Na verdade, hDPSCs express precocemente PrPC e, após a diferenciação neuronal, foi possível observar um aumento adicional. Outros autores a hipótese de um possível papel de PrPC em processos de diferenciação neuronal de células-tronco. Com efeito, PrPC dirige a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos24. O objetivo deste estudo foi enfatizar a metodologia para a obtenção de células-tronco da polpa dentária, seu processo de diferenciação e o papel do PrPC durante a diferenciação neuronal.
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Protocol
Terceiros molares utilizados no estudo foram extirpados de pacientes (13-19 anos de idade) com nenhuma história prévia de consumo de álcool ou de drogas, todos os não-fumantes e com adequada higiene oral. No dia da explicação, no departamento de ciência Odontologia e -maxilo-facial da Universidade de "Sapienza" de Roma, consentimento informado foi obtido os pacientes ou os pais. Consentimento informado foi obtido com base em considerações éticas e aprovação do Comitê de ética.
1. dente e extração de polpa dentária
-
Preparação de meio adequado para a conservação ou transporte.
- Prepare-se média baixa concentração modificado águia de Dulbecco de glicose (DMEM-L) com L-glutamina (494,5 mL).
- Adicionar 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) e 0,5 mL de anfotericina (0,1%).
- Extrair o terceiro molar do paciente, rapidamente enxágue com PBS, colocar em um tubo de ensaio de 15 mL com o meio e transferi-lo para o laboratório em menos de 2 h.
- Sob uma capa de risco biológico, abra o dente com um cortador de passagem de corte coronal paralela e tangente através do telhado da câmara de celulose.
- Delicadamente, retire a polpa com uma escavadeira pequena e coloque-o em um tubo de ensaio.
- Lavagem com PBS três vezes e centrifugar a 2.500 x g durante 10 minutos a RT
2. processamento da polpa Dental e liberação de células-tronco
- Remover o sobrenadante, resuspenda o pellet em solução de Hank e colocá-lo em uma placa de Petri. Incube durante 2 h a 37 ° C em 5% de CO2.
-
Tipo de preparação de solução IV colagenase.
- Preparar 0,8 mL de DMEM-L.
- Derreta 1 mg de colagenase de tipo IV em 0,8 mL de DMEM-L e vortex durante vários minutos.
- Adicionar DMEM-L a 1 mL para ter uma concentração final de 1 mg/mL.
- Filtre a solução com um filtro de 0,22 µM.
- Remover a solução de Hank por centrifugação a 2.500 x g durante 10 minutos a RT e divida a polpa em fatias pequenas de aproximadamente 1 mm cada uma com um bisturi descartável.
- Coloque as fatias de polpa em um prato de petri e incubar com 1 mL de colagenase tipo IV por 15 min a 37 ° C em 5% CO2.
-
Preparação de meio de cultura (500 mL).
- A 445 mL de DMEM-L, com L-glutamina.
- Adicione 50 mL de soro Fetal bovino (FBS) (10%).
- Adicione 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%).
- Centrifugar a amostra a 2.500 x g durante 10 minutos a RT, remover o sobrenadante, resuspenda o pellet a médio (etapa 2.5) e cultura T25 balão específico para células-tronco a 37 ° C em 5% CO2.
3. propagação e cultura de células-tronco
- Todos os dias Verifique a cultura e, após 3 dias de crescimento, observar diferentes clones de células aderentes dentro do frasco.
- Cada 3 dias mudar o meio de cultura.
- Entre 7 e 12 dias, uma vez que as células aderentes têm alcance confluência, desanexá-los por tratar as células com 1 mL de EDTA-tripsina por 3 min a 37 ° C ou delicadamente com uma espátula de célula.
- Adicione 4 ml (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina.
- Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 6 min a 259 x g, remover o sobrenadante e colocar as células em um frasco T25 para propagar.
Nota: Cada 3 dias, as células alcançar confluência. - Propaga as células até 21 ou 28 dias (aproximadamente 6-8 passagens) para evitar a presença do non-tronco, como as células em cultura.
- Separe as células com 1 mL de tripsina-EDTA para 3 min a 37 ° C ou raspando suavemente. Centrifugar a suspensão de eritrócitos para 6 min a 259 x g.
- Remover o sobrenadante e testar as células para análise cytofluorimetric (etapa 6).
4. transiente PrPC silenciar por siRNA
- Cultura as placas de 6-poços de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5) por 24 h.
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No dia seguinte, prepare o suporte de PrP de siRNA (400 µ l).
- Para um tubo de ensaio estéril, adicionar µ l 384 DMEM-L.
- Adicionar 1 µ l para cada tipo de siRNA PrP para DMEM-L para ter uma concentração final de 5 nM (4 siRNA PrP foram usados e verificadas pelo fornecedor para garantir um "knockdown" eficiência ≥70%).
- Adicionar 12 µ l de transfectionreagent para DMEM-L.
- A mistura de vórtice e incubar durante 10 minutos a RT para permitir a formação de complexos do transfection.
- Adicionar 400 μL de siRNA PrP médio para cada amostra e incubar durante 6 h a 37 ° C.
- Sem descartar siRNA PrP médio, adicione 1,6 mL (proporção de 1 a 5) do meio de cultura (etapa 2.5).
- Deixar as células por 72 h a 37 ° C.
- Remover o sobrenadante e lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT
- Adicione 2 mL de meio de cultura neuronal por 7 ou 14 dias (etapa 5.1).
- Altere o meio de cultura neuronal em 3 dias.
Nota: Substitua o siRNA PrP solução substituir cada tempo o meio de cultura neuronal. - No final do tempo, lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT e testar para antígenos de superfície neuronais por análise de Western Blot.
5. neuronal processo de indução de hDPSCs
-
Preparação de meio de cultura neuronal (500 mL).
- Prepare 444,7 mL de mídia basal formulada para células neuronais.
- No meio de adicionar 50 mL de suplemento isento de soro usado para apoiar a viabilidade a longo prazo de adultas e embrionárias estaminais células neuronais (10%).
- Adicione 200 µ l de básico fator de crescimento fibroblástico (bFGF) (concentração final 40 ng/mL) e 100 µ l de fator de crescimento epidérmico (EGF) para o meio (concentração final 20 ng/mL).
- Adicionar 5 mL de penicilina/estreptomicina (1%) para o meio.
- HDPSCs de cultura em placas boas 6 (2 x 105 células/mL) até 28 dias de separação da polpa e estimulá-los com 2 mL de meio de cultura neuronal.
- Cada 3 dias, desprezar o sobrenadante, lavar 3 vezes com 2 mL de PBS em RT e substituir 2 mL do meio de cultura neuronal.
- Depois de 7 ou 14 dias, retire as células com 1 mL de EDTA-tripsina por 3 min a 37 ° C ou delicadamente com uma espátula.
- Adicione 4 mL (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina.
- Testar para a presença de antígenos de superfície neuronais (etapa 6) ou a expressão de proteína príon (passo 7), análise de citometria de fluxo.
6. caracterização de hDPSCs por citometria de fluxo
- Selecione estroma mesenquimal (MSC)-antígenos de superfície específicas ou neuronais.
- Cultura do hDPSCs em placas de 6-poços (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5).
- Desanexe hDPSCs aos 28 dias de separação da polpa dental ou após 14 dias do meio de cultura neuronal (etapa 5.1) com 1 mL de EDTA-tripsina para 3 min a 37 ° C ou suavemente raspador.
- Adicione 4 ml (proporção 1:5) do meio de cultura (etapa 2.5) para parar a ação da tripsina e centrifugate em 259 x g durante 6 min à RT lavar outra 2 vezes com 2 mL de PBS no RT
- Corrigir o hDPSCs não tratada ou tratada com paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a 4 ° C.
- Permeabilize hDPSCS com surfactante não-iônico 0,1% (v/v) em PBS para adicional 10 min a RT
- Executar o bloqueio com leite em pó desnatado 5% em 1 mL de PBS por 1h no RT
- Lavar 3 vezes com 1 mL de PBS e incube as celulas com anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 células), anti-β3-tubulina (1: 100 / 5 x 105 células), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 células) e anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 células) mAb por 1h no RT
- Lavar as células 3 vezes com 1 mL de PBS e incubar com PE anti-rato (01:50 / 5 x 105 células) ou anticoelho CY5 mAb (01:50 / 5 x 105 células) por 1h adicional no RT
- Usar os anticorpos secundários para retenção de células immunopositive (anti-rato PE ou anticoelho CY5 mAb) e analisar todas as amostras com um citômetro de fluxo e adquirir pelo menos 20.000 eventos.
7. avaliação da expressão de PrPC em hDPSCs pela análise de citometria de fluxo
- Cultura as placas de 6-poços de hDPSCsin (2 x 105 células/mL) com 2 mL de meio de cultura (etapa 2.5).
- Desanexar hDPSCs nos dias 21 e 28 de separação da polpa dental e depois de 7 ou 14 dias com meio de cultura neuronal (etapa 5.1) com 1 mL de EDTA-tripsina e parar a ação da tripsina, conforme descrito na etapa 6.4. Corrigir os espécimes com paraformaldeído 4% em PBS durante 10 minutos a 4 ° C.
- Permeabilize com surfactantin 0,1% (v/v) não-iónicos PBS por 10 min em RT. Remove o sobrenadante e as células com mAb anti-PrP de coelho EP1802Y (01:50 / 5 x 105 células) de mancha mAb por 1h no RT. Incubar com anticoelho CY5 (01:50 / 5 x 105 células) mAb para h 1 adicional no RT
- Analisar todas as amostras com um citômetro de fluxo e adquirir pelo menos 20.000 eventos.
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Representative Results
Os procedimentos de isolamento e separação de hDPSCs da polpa dental, obtida a partir do terceiro molar, são processos complexos, em que pequenas mudanças podem levar a um resultado desastroso. Neste trabalho, utilizamos o protocolo de Arthur et al.. 12 com várias melhorias. Um esquema representativo dos procedimentos é mostrado na Figura 1.
hDPSCs representa uma população heterogênea de células com clones distintos e diferenças na capacidade proliferativa e diferenciação7,8. Após a separação da polpa e a propagação de pequenos fragmentos de polpa, observou-se aglomerados de células em expansão na periferia. A Figura 2 mostra um pequeno aglomerado de células em 1 dia (painel esquerdo), 4 dias (painel central) e 7 dias (painel direito) de separação da polpa dental. Geralmente, esses aglomerados de células crescem para alcançar a confluência aproximadamente entre 7 e 12 dias.
Estas células, após diferenciação neuronal induzida por EGF/bFGF, reduzem o seu crescimento e, depois de duas semanas, foi possível observar mudanças significativas na consequência de morfologia e neuritos de célula (Figura 3).
Na Figura 4, mostramos que não tratadas hDPSCs express multipotentes mesenquimais estromais superfície antígenos específicos tais como CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-15,9. Caso contrário, após estímulos adequados de indução neuronal, hDPSCs express marcadores neuronais específicos como β3-tubulina, NFH e GAP43. hDPSCs, estímulos não tratada ou tratada com indução neuronal, não expressam marcadores hematopoiéticas como CD14 e CD19.
Na Figura 5, mostramos que hDPSCs express precocemente PrPC (21 e 28 dias) e, após o processo de diferenciação neuronal induzido pelo bFGF/EGF adicional 7 e 14 dias, o PrPC conteúdo aumentada (Figura 5A). Uma vez que diversos autores relataram que o PrPC está envolvido na diferenciação celular neuronal, avaliamos o papel do PrP endógenaC neste processo. Portanto, um RNA de interferência pequeno (siRNA PrP) foi aplicado para ablate PrPC e sua função. Tratamento prévio com siRNA para 72 h antes de EGF/bFGF estímulos para 14 dias impede a expressão dos marcadores neuronais B3-tubulina e NHF (Figura 5B). Os dados mostram que silenciar de PrPC por siRNA afetado o processo de diferenciação neuronal de hDPSCs, induzida pelo bFGF/EGF após 2 semanas.
Figura 1 : Regime de separação de polpa Dental do terceiro molar. O dente foi aberto com um cortador de passe de corte coronal paralelas e tangentes através do telhado da câmara de celulose e a polpa foi delicadamente removida sob condições estéreis com uma escavadeira pequena e colocada em um tubo de ensaio. A polpa, após tratamento da solução do hank, foi cortada em fatias e tratada com colagenase IV por 15 min e propagada em um frasco T25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : hDPSCs de morfologia em dias diferentes de separação da polpa dental por microscópio de contraste de fase. Morfologia de hDPSCs da polpa dental em dias diferentes (1, 4, 7) de separação da polpa dental. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Axônio consequência de hDPSCs por microscópio de contraste de fase. Morfologia de hDPSCs de dental polpa não tratada ou tratada com EGF/bFGF durante 14 dias. Barras de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : caracterização hDPSCs. Análise de citometria de fluxo do CD44, CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-tubulina, expressão NFH e GAP43 em hDPSCs não tratada ou tratada com EGF/bFGF durante 14 dias. Histogramas representam fluorescência vs célula número de log, condomínio fechado na populacao de celula de um histograma de dispersão (SS/FS) de dispersão/frente de lado. Cada painel foi comparado com os correspondentes anticorpos secundários como controlo negativo. Uma experiência representativa entre 3 é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Papel do PrPC durante a diferenciação neuronal de hDSPCs. (A) Cytofluorimetric de análise de expressão de PrPC não tratada (21 e 28 dias de separação da polpa dentária) e depois de dias adicionais de 7 e 14 com mídia de indução neuronal EGF/bFGF. Cada painel foi comparado com o controle negativo do isotipo IgG correspondente. Uma experiência representativa entre 3 é mostrada. (B) análise ocidental do borrão de marcadores neuronais β3-tubulina e expressão NFH (28 dias de separação da polpa dentária) e depois adicionais 14 dias com mídia de indução neuronal EGF/bFGF na presença ou ausência de siRNA PrP. Esta figura 5 (A, B) foi modificada de "Papel do complexo multimolecular de príon proteína EGFR durante a diferenciação neuronal de dentais derivado de celulose células estaminais humanas" 23. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste trabalho, concentrámo-na metodologia para isolamento e diferenciação neuronal de hDPSCs; Além disso, avaliamos o papel do PrPC neste processo. Existem vários métodos para isolar e diferenciar hDPSCs em células neurônio e passos críticos durante o processo. hDPSCs são capazes de se diferenciar em várias linhagens como condroblastos, osteoblastos, adipócitos e neurônios. Nosso papel, investigamos os mecanismos de diferenciação neuronal e a presença de PrPC. Como discutido acima, estas células expressam típicos mesenquimais estromais específico superfície antígenos como CD44, CD90, CD105, CD73 e STRO-110,25,26.
No protocolo, vários passos críticos podem causar a falha do processo de separação. O primeiro passo crítico é representado pela escolha dos pacientes27. Em nossa experiência, encontramos naquela idade crescente dos doadores (> 20) gradualmente reduz a capacidade de proliferação e diferenciação de células-tronco. Em nossos experimentos, usamos terceiros molares extirpados de pacientes com idades entre 13-19 anos de idade e com nenhuma história prévia de consumo de álcool ou de drogas, todos os não-fumantes e com adequada higiene oral.
O segundo passo fundamental é representado pela escolha da enzima para separar as células do tecido da polpa, que pode representar o principal passo quente do processo de separação de células-tronco. Na verdade, percebemos que um largo uso de colagenase I e II, enzimas que podem ser muito agressivos, pode danificar as células presentes no tecido da polpa durante o processo de separação. Por esta razão, decidimos usar colagenase IV porque este tipo de colagenase como atividade tryptic menor do que a colagenase tipo I e II. Seguindo exatamente o procedimento, é possível obter células-tronco em 90% dos dentes tratados.
Após a separação, a solução contendo hDPSCs é cultivada em frascos apropriados até a passagem do 6° (cerca de 21 a 28 dias) para evitar a presença de não-células-tronco na cultura. Em 28 dias, foram testados para a presença de antígenos mesenquimais típicos (como referenciado acima) e usados para experiências somente quando eles foram positivos. Na verdade, apesar dos progressos realizados ao longo de anos em hDPSCs, há ainda importantes limitações representadas pela extrema heterogeneidade da população.
Como demonstrado por vários autores, existem tipos de população de diferentes células na polpa dental e, até à data, tem desconhecido, o que é os melhores fenótipos capazes de se diferenciar em cada linhagem mesenquimal (condroblastos, adipoblasts, osteoblastos ou neurônios). Para evitar as limitações atuais dos nossos e outros procedimentos, o próximo passo será selecionar populações celulares com fenótipos específicos usando anticorpos monoclonais específicos.
Em trabalho anterior, mostramos que o PrPC é expressa de hDPSCs. Na verdade, é possível observar uma positividade fraca em 21 dias e um aumento do teor de PrPC em 28 dias. Além disso, observou-se que durante a indução neuronal EGF/bFGF-mediada, conteúdo de PrPC foi aumentado. Além disso, investigamos o papel do PrP endógenaC no processo de indução neuronal de hDPSCs. O silenciar transiente de PrPC impediu o processo de diferenciação de hDPSCs induzida por EGF/bFGF23.
Podemos aperfeiçoá-lo e melhorar os métodos de isolamento, separação e cultivo in vitro de hDPSCs com procedimentos simples e versátil. Essas inovações permitem a obtenção de clones de célula mais eficientes e a expansão em grande escala das células tronco mesenquimais. Além disso, sugerimos que os hDPSCs são um excelente modelo experimental para estudar os mecanismos celulares e moleculares do processo de diferenciação neuronal MSCs.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela "Fondazione Varrone" e Universidade de Rieti Hub "Sabina Universitas" de Vincenzo Mattei.
Figura 5 (A, B) reimpresso com permissão da editora Taylor & Francis Ltd de: complexo multimolecular de papel de príon proteína EGFR durante a diferenciação neuronal de dentais derivado de celulose células estaminais humanas. Martellucci, S., V. de Manganelli, Santacroce C. F. Santilli, L. Piccoli, M. Sorice, V. Mattei prião. 4 de março de 2018. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
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