Summary
Her præsenterer vi en protokol for menneskelige Dental Pulp stamceller isoleret og formering for at evaluere udtrykket prion protein under neuronal differentiering proces.
Abstract
Bioetiske spørgsmål relateret til manipulation af embryonale stamceller har hindret fremskridt inden for medicinsk forskning. Derfor er det meget vigtigt at få stamceller fra forskellige væv, såsom fedt, navlestreng, knoglemarv og blod. Blandt de mulige kilder er dental pulp særlig interessant, fordi det er let at opnå for bioetiske overvejelser. Menneskelige Dental Pulp stamceller (hDPSCs) er en type af voksne stamceller købedygtig adskille i neuronal-lignende celler og kan fås fra den tredje molar af raske patienter (13-19 aldre). Især blev af dental pulp fjernet med en gravemaskine, skæres i små skiver, behandlet med collagenase IV og kulturperler i en kolbe. For at fremkalde de neuronal differentiering, blev hDPSCs stimuleret med EGF/bFGF for 2 uger. Vi har tidligere demonstreret, at differentiering proces indholdet af cellulære prion Protein (PrPC) i hDPSCs steg. Cytofluorimetric Analysen viste en tidlig udtryk for PrPC at øget efter neuronal differentiering proces. Ablation af PrPC af siRNA PrP forhindret neuronal differentiering induceret af EGF/bFGF. I dette papir illustrere vi, at som vi øget isolation, adskillelse og in vitro- dyrkningsmetoder af hDPSCs med flere nemme procedurer, mere effektiv celle kloner var fremstillet og storstilet udbygning af mesenchymale stamceller (msc) der blev observeret. Vi viser også, hvordan hDPSCs, fremstillet med metoderne beskrevet i protokollen, er en fremragende eksperimentel model til at studere den neuronal differentiering MSCs og efterfølgende cellulære og molekylære processer.
Introduction
Mesenkymale stamceller er isoleret fra flere væv, herunder knoglemarv, navlestrengsblod, menneskelige dental pulp, fedtvæv og blod1,2,3,4,5 , 6. som rapporteret af flere forfattere, hDPSCs Vis plast overholdelse, en typisk fibroblast-lignende morfologi. Disse repræsenterer en meget heterogene befolkning med forskellige kloner og forskelle i proliferativ og differentiering kapacitet7,8. hDPSCs express specifikke markører for mesenkymale stamceller (dvs. CD44, CD90, CD73, CD105, STRØ-1), de er negative for nogle hæmatopoietisk markører (såsom CD14 og CD19) og er i stand til at in vitro-multilineage differentiering9, 10,11.
Flere forfattere har vist, at disse celler er i stand til at differentiere i neuron-lignende celler ved hjælp af forskellige protokoller, der omfatter tilføjelse af NGF, bFGF, EGF i kombination med den specifikke medier og kosttilskud7,12. Også, mange proteiner er involveret under neuronal differentiering proces, og blandt disse, flere papirer fremvise relevant rolle og betydelige udtryk af cellulære prionprotein (PrPC), begge i embryonale og voksne stamceller13, 14. PrPC repræsenterer en pleiotrope molekyle i stand til at udføre forskellige funktioner inde i cellerne som kobber metabolisme, apoptose, og modstand mod oxidativ stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
I vores tidligere papir23undersøgte vi rollen som PrPC i hDPSCs neuronal differentiering proces. Faktisk, hDPSCs express precociously PrPC , og efter neuronal differentiering, det var muligt at observere en yderligere stigning. Andre forfattere hypotese en mulig rolle for PrPC ved neuronal differentiering af stamceller. Faktisk, PrPC drev differentiering af humane embryonale stamceller i neuroner, oligodendrocytes og astrocytter24. Formålet med denne undersøgelse var at understrege metoden for at få stamceller fra dental pulp, dens differentiering proces og rollen af PrPC under neuronal differentiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tredje molarer anvendes i undersøgelsen var skåret ud fra patienter (13-19 år gammel) med ingen forudgående historie af narkotika eller alkoholforbrug, alle ikke-ryger og med passende mundhygiejne. På dagen for forklaring, på Institut for videnskab tandpleje og Maxillofacial "Sapienza" Universitet i Rom, blev der indhentet informeret samtykke fra patienterne eller forældre. Blev indhentet informeret samtykke, baseret på etiske overvejelser og godkendelse af den etiske komité.
1. tand og Dental Pulp udvinding
-
Udarbejdelse af passende medium for bevarelse eller transport.
- Forberede Dulbeccos modificerede Eagle medium lav koncentration af glukose (DMEM-L) med L-glutamin (494.5 mL).
- Der tilsættes 5 mL af penicillin/streptomycin (1%) og 0,5 mL af amphotericin (0,1%).
- Uddrag den tredje molar fra patienten, hurtigt Skyl det med PBS, sat i en 15 mL reagensglas med mellemlang og overføre det til laboratoriet i mindre end 2 h.
- Under biohazard hætte, åbne tanden med en fræser af koronale skæring pass parallelle og tangent gennem taget på papirmasse kammer.
- Forsigtigt fjerne frugtkødet med en lille gravemaskine og placere det i et reagensglas.
- Vaskes tre gange med PBS og centrifugeres ved 2.500 x g i 10 min. ved RT.
2. behandling af Dental Pulp Stem Cell frigivelse
- Fjern supernatanten, resuspenderes i Hanks løsning og placere det i en petriskål. Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C i 5% CO2.
-
Type IV collagenase løsning forberedelse.
- Forberede 0,8 mL af DMEM-L.
- Smelt 1 mg af type IV collagenase i 0,8 mL af DMEM-L og vortex i flere minutter.
- Tilføj DMEM-L op til 1 mL at have en endelig koncentration på 1 mg/mL.
- Opløsningen filtreres med et 0,22 µM filter.
- Fjerne Hanks løsning ved centrifugering ved 2500 x g i 10 min. ved RT og opdele frugtkødet i små skiver omkring 1 mm hver enkelt med en engangs skalpel.
- Placer pulp skiverne i en petriskål og inkuberes med 1 mL af type IV collagenase i 15 min. ved 37 ° C i 5% CO2.
-
Medium kultur forberedelse (500 mL).
- 445 ml DMEM-L med L-glutamin.
- Der tilsættes 50 mL føtalt bovint Serum (FBS) (10%).
- Der tilsættes 5 mL af penicillin/streptomycin (1%).
- Centrifugeres prøve på 2.500 x g i 10 min. ved RT, Fjern supernatanten, resuspend pellet i medium (trin 2,5) og kultur i T25 kolbe specifikke for stamcelleforskning ved 37 ° C i 5% CO2.
3. stamceller kultur og formering
- Hver dag vil tjekke kultur og, efter 3 dage af vækst, observere forskellige kloner af vedhængende celler i kolben.
- Hver 3 dag ændre næringssubstratet.
- Mellem 7 og 12 dage, når de vedhængende celler har reach sammenløb, frigør dem ved behandling af celler med 1 mL trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C eller forsigtigt ved hjælp af en celle skraber.
- Der tilsættes 4 ml (forhold 1:5) af næringssubstratet (trin 2,5) at stoppe trypsin handling.
- Centrifugeres cellesuspension til 6 min på 259 x g, Fjern supernatanten og placere celler i en T25 kolbe til at udbrede.
Bemærk: Hver 3 dage cellerne nå sammenløb. - Overfør celler op til 21 eller 28 dage (ca 6-8 passager) at undgå tilstedeværelsen af ikke-stamceller som celler i kulturen.
- Frigør cellerne med 1 mL trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C eller forsigtigt skrabe. Der centrifugeres cellesuspension til 6 min på 259 x g.
- Fjern supernatanten og teste celler til cytofluorimetric analyse (trin 6).
4. forbigående PrPC Silencing af siRNA
- Kultur hDPSCsin 6-godt plader (2 x 105 celler/mL) med 2 mL af næringssubstratet (trin 2,5) i 24 timer.
-
Dagen efter, forberede siRNA PrP medium (400 µL).
- Til en steril reagensglas, tilføje 384 µL DMEM-L.
- Tilføj 1 µL for hver type af siRNA PrP til DMEM-L at have en endelig koncentration på 5 nM (4 siRNA PrP var anvendes og kontrolleres af leverandøren garanterer et knockdown effektivitet ≥70%).
- Tilføje 12 µL af transfectionreagent til DMEM-L.
- Vortex blandingen og inkuberes i 10 min. ved RT at tillade dannelsen af Transfektion komplekser.
- Tilsæt 400 μL af siRNA PrP medium til hver prøve og Inkuber i 6 timer ved 37 ° C.
- Uden udsmid siRNA PrP medium, tilføje 1,6 mL (forhold på 1 til 5) af næringssubstratet (trin 2.5).
- Forlade cellerne i 72 timer ved 37 ° C.
- Fjern supernatanten og vask 3 gange med 2 mL PBS på RT.
- Der tilsættes 2 mL af neuronal næringssubstrat for 7 og/eller 14 dage (trin 5.1).
- Ændre neuronal næringssubstratet hver 3 dage.
Bemærk: Erstatte siRNA PrP løsning hver gang Erstat neuronal næringssubstratet. - Enden af tid vask 3 gange med 2 mL PBS på RT og test for neuronal overflade antigener ved Western Blot analyse.
5. neuronal induktion processen af hDPSCs
-
Neuronal næringssubstratet forberedelse (500 mL).
- Forberede 444.7 mL af basal media formuleret til neuronale celler.
- Til medium tilsættes 50 mL serum-gratis supplement anvendes til at støtte den langsigtede levedygtighed af embryonale og voksne neuronal til stamceller (10%).
- Tilføje 200 µL af basic Fibroblast vækstfaktor (bFGF) (slutkoncentration 40 ng/mL) og 100 µL af Epidermal vækstfaktor (EGF) til medium (slutkoncentration 20 ng/mL).
- Der tilsættes 5 mL af penicillin/streptomycin (1%) til medium.
- Kultur hDPSCs i 6-godt plader (2 x 105 celler/mL) op til 28 dage fra papirmasse adskillelse og stimulere dem med 2 mL af neuronal næringssubstratet.
- Hver 3 dage supernatanten, vask 3 gange med 2 mL PBS på RT og erstatte 2 mL af neuronal næringssubstratet.
- Efter 7 og/eller 14 dage, frigøre celler med 1 mL trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C eller forsigtigt med en skraber.
- Der tilsættes 4 mL (forhold 1:5) af næringssubstratet (trin 2,5) at stoppe trypsin handling.
- Test for tilstedeværelse af neuronal overflade antigener (trin 6) eller prioner protein udtryk (trin 7) ved analysen af handelsstrømmen flowcytometri.
6. karakterisering af hDPSCs af Flow flowcytometri
- Vælg mesenchymale stromale (MSC)-specifikke eller neuronal overflade antigener.
- Kultur hDPSCs i 6-godt plader (2 x 105 celler/mL) med 2 mL af næringssubstratet (trin 2.5).
- Frigøre hDPSCs på 28 dage fra dental pulp adskillelse eller efter 14 dage af neuronal næringssubstratet (trin 5.1) med 1 mL trypsin-EDTA i 3 minutter ved 37 ° C eller forsigtigt skraber.
- der tilsættes 4 ml (forhold 1:5) af næringssubstratet (trin 2,5) at stoppe trypsin handling og centrifugate på 259 x g for 6 min på RT. vaske en anden 2 gange med 2 mL PBS på RT.
- Fix det ubehandlede eller behandlede hDPSCs med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 10 min. ved 4 ° C.
- Permeabilize hDPSCS med 0,1% (v/v) nonioniske overfladeaktive stof i PBS for yderligere 10 min. ved RT.
- Udføre blokering med 5% nonfat tørmælk i 1 mL PBS for 1 h på RT.
- Vask 3 gange med 1 mL PBS og inkuberes celler med anti-CD105 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-STRØ-1 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-β3-Tubulin (1: 100 / 5 x 105 celler), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 celler) og anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 celler) mAb for 1 h på RT.
- Cellerne vaskes 3 gange med 1 mL PBS og inkuberes med anti-mus PE (1:50 / 5 x 105 celler) eller anti-kanin CY5 (1:50 / 5 x 105 celler) mAb for yderligere 1 h på RT.
- Brug de sekundære antistoffer for gating immunopositive celler (anti-mus PE eller anti-kanin CY5 mAb) og analysere alle prøver med et Flow forskellige og erhverve mindst 20.000 begivenheder.
7. evaluering af PrPC udtryk i hDPSCs ved Flow flowcytometri analyse
- Kultur hDPSCsin 6-godt plader (2 x 105 celler/mL) med 2 mL af næringssubstratet (trin 2.5).
- Frigøre hDPSCs på 21 og 28 dage fra dental pulp adskillelse og efter 7 og/eller 14 dage med neuronal næringssubstratet (trin 5.1) med 1 mL trypsin-EDTA og stoppe handlingen trypsin, som beskrevet i trin 6.4. Fix modellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i PBS i 10 min. ved 4 ° C.
- Permeabilize med 0,1% (v/v) ikke-ionisk surfactantin PBS for 10 min på RT. Fjern supernatanten og plette celler med kanin anti-PrP mAb EP1802Y (1:50 / 5 x 105 celler) mAb for 1 h på RT. Incubate med anti-kanin CY5 (1:50 / 5 x 105 celler) mAb for yderligere 1 h på RT.
- Analysere alle prøver med et Flow forskellige og erhverve mindst 20.000 begivenheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Isolering og fraseparering procedurerne i hDPSCs fra dental pulp, fremstillet af den tredje molar, er komplekse processer, hvor små ændringer kan føre en ruinerende resultat. I dette papir bruger vi protokollen af Arthur mfl. 12 med adskillige forbedringer. Et repræsentativt arrangement med procedurer er vist i figur 1.
hDPSCs repræsenterer en heterogen population af celler med forskellige kloner og forskelle i proliferativ og differentiering kapacitet7,8. Efter papirmasse adskillelse og såning af små fragmenter af papirmasse, observeret vi klynger af celler udvide i periferien. Figur 2 viser en lille klynge af celler på 1 dag (venstre panel), 4 dage (centrale panel) og 7 dage (højre panel) fra dental pulp adskillelse. Generelt, disse klynger af celler vokse til sammenløbet ca mellem 7 og 12 dage.
Disse celler efter neuronal differentiering induceret af EGF/bFGF, reducere deres vækst, og efter to uger var det muligt at konstatere væsentlige ændringer i celle morfologi og neurites udvækst (fig. 3).
I figur 4viser vi, at ubehandlet hDPSCs express Multipotente mesenchymale stromale specifikke overflade antigener såsom CD44, CD90, CD105, CD73 og STRØ-15,9. Ellers, efter passende neuronal induktion stimuli, hDPSCs express specifikke neuronal markører som β3-Tubulin, NFH og GAP43. hDPSCs, ubehandlede eller behandlede med neuronal induktion stimuli, udtryk ikke hæmatopoietisk markører som CD14 og CD19.
I figur 5viser vi, at hDPSCs express precociously PrPC (21 og 28 dage), og efter neuronal differentiering proces induceret af EGF/bFGF for yderligere 7 og 14 dage, PrPC indhold øget (figur 5A). Da flere forfattere rapporterede, at PrPC er involveret i cellulære neuronal differentiering, evalueret vi rolle af endogene PrPC i denne proces. Derfor blev en lille interfererende RNA (siRNA PrP) anvendt til at ablate PrPC og dens funktion. Forbehandling med siRNA i 72 timer før EGF/bFGF stimuli i 14 dage forhindrer udtryk af neuronal markører B3-tubulin og NHF (figur 5B). Dataene viser, at hæmning af PrPC af siRNA påvirket neuronal differentiering processen af hDPSCs, fremkaldt af EGF/bFGF efter 2 uger.
Figur 1 : Ordningen af Dental pulp adskillelse fra den tredje molar. Tanden er blevet åbnet med en fræser af koronale skæring pass parallelle og tangent gennem taget på papirmasse kammer og papirmasse blev forsigtigt fjernes under sterile forhold med en lille gravemaskine og placeres i et reagensglas. Papirmasse, efter hank's løsning behandling, blev skåret i skiver og behandlet med collagenase IV i 15 min og opformeret i en T25 kolbe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : hDPSCs morfologi på forskellige dage fra dental pulp adskillelse af fase kontrast mikroskop. Morfologi af hDPSCs fra dental pulp på forskellige dage (1, 4, 7) fra dental pulp adskillelse. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Neurite udvækst af hDPSCs af fase kontrast mikroskop. Morfologi af hDPSCs fra dental pulp ubehandlet eller behandlet med EGF/bFGF i 14 dage. Skalere barer = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : hDPSCs karakterisering. Flow flowcytometri analyse af CD44, CD90, CD105, CD73, STRØ-1, CD14, CD19, β3-Tubulin, NFH og GAP43 udtryk i hDPSCs ubehandlet eller behandlet med EGF/bFGF i 14 dage. Histogrammer repræsenterer log fluorescens vs celle nummer, låge på celle population af en side scatter/forward scatter (SS/FS) histogram. Hvert panel blev sammenlignet med de tilsvarende sekundære antistoffer som en negativ kontrol. En repræsentativ eksperiment blandt 3 er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Rolle af PrPC under neuronal differentiering af hDSPCs. (A) Cytofluorimetric analyse af PrPC udtryk ubehandlet (21 og 28 dage fra dental pulp adskillelse) og efter yderligere 7 og 14 dage med neuronal induktion media EGF/bFGF. Hvert panel blev sammenlignet med den tilsvarende IgG negativ isotype kontrol. En repræsentativ eksperiment blandt 3 er vist. (B) Western blot analyse af neuronal markører β3-Tubulin og NFH udtryk (28 dage fra dental pulp adskillelse) og efter yderligere 14 dage med neuronal induktion media EGF/bFGF i tilstedeværelse eller fravær af siRNA PrP. Denne figur 5 (A, B) er blevet ændret fra "Rolle i Prion-protein-EGFR multimolecular komplekset under neuronal differentiering af humane dental pulp-afledte stamceller" 23. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dette arbejde fokuseret vi på metoder til isolering og neuronal differentiering af hDPSCs; Desuden evalueres vi rollen som PrPC i denne proces. Der er flere metoder til at isolere og differentiere hDPSCs i neuron-lignende celler, og kritiske trin i processen. hDPSCs er i stand til at differentiere i flere slægter som chondroblasts, adipocytter, osteoblaster og neuroner. I vores papir undersøgte vi mekanismerne af neuronal differentiering og tilstedeværelsen af PrPC. Som omtalt ovenfor, udtrykker disse celler typisk mesenchymale stromale-specifikke overflade antigener såsom CD44, CD90, CD105, CD73 og STRØ-110,25,26.
I protokollen, kan flere kritiske trin forårsage svigt af proceduren for adskillelse. Det første vigtige skridt er repræsenteret ved valg af patienter27. Vores erfaring, vi har fundet den stigende alder af donorer (> 20) gradvist reducerer muligheden for spredning og differentiering af stamceller. I vores forsøg og, brugte vi tredje molarer skåret ud fra patienter i alderen 13-19 år gammel og med ingen forudgående historie af narkotika eller alkoholforbrug, alle ikke-ryger og med passende mundhygiejne.
Det andet kritiske trin er repræsenteret ved valg af enzymet til at adskille cellerne fra pulp væv, som kan udgøre den vigtigste varme trin i stamceller adskillelse procedure. I virkeligheden, vi indså, at en bred anvendelse af collagenase I og II, enzymer, der kan være for aggressiv, kan skade cellerne i pulp væv under adskillelse proces. Derfor besluttede vi at bruge collagenase IV, fordi denne form for collagenase som lavere tryptic aktivitet end collagenase type I og II. Efter præcis procedure er det muligt at få stamceller i 90% af de behandlede tænder.
Efter adskillelse, er den løsning, der indeholder hDPSCs kulturperler i egnede beholdere indtil 6° passage (ca 21-28 dage) at undgå tilstedeværelse ikke-stamceller i kulturen. På 28 dage, blev de testet for forekomst af typiske mesenchymale antigener (som der refereres til ovenfor) og bruges til eksperimenter, kun når de var positive. I virkeligheden, trods fremskridt i hele år på hDPSCs, er der stadig vigtige begrænsninger repræsenteret af den ekstreme heterogenitet af befolkningen.
Som det fremgår af flere forfattere, der er forskellige celletyper befolkning i den dental pulp og til dato, har ukendt hvad er den bedste fænotyper at differentiere i hver mesenchymale afstamning (chondroblasts, adipoblasts, osteoblaster eller neuroner). For at undgå de nuværende begrænsninger af vores og andre procedurer, vil det næste skridt være at vælge cellulære populationer med specifikke fænotyper af specifikke monoklonale antistoffer.
I tidligere arbejde viste vi, at PrPC kommer til udtryk fra hDPSCs. Faktisk er det muligt at observere en svag positivitet på 21 dage, og en stigning af PrPC indhold på 28 dage. Desuden konstaterede vi, at under EGF/bFGF-medieret neuronal induktion, PrPC indhold blev yderligere forøget. Derudover undersøgte vi rollen af endogene PrPC i neuronal induktion processen af hDPSCs. Den forbigående hæmning af PrPC forhindret differentiering processen af hDPSCs induceret af EGF/bFGF23.
Vi finjusteret og forbedrede metoder til isolation, adskillelse og in vitro dyrkning af hDPSCs med enkle og fleksible procedurer. Disse nyskabelser giver mulighed for at opnå mere effektiv celle kloner og en storstilet udvidelse af de mesenkymale stamceller. Vi foreslår også, at hDPSCs er en fremragende eksperimentel model til at studere cellulære og molekylære mekanismer af MSCs neuronal differentiering proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af "Fondazione Varrone" og Rieti Universitet Hub "Sabina Universitas" til Vincenzo Mattei.
Figur 5 (A, B) genoptrykt med tilladelse fra udgiveren Taylor & Francis Ltd fra: rolle af Prion-protein-EGFR multimolecular kompleks under neuronal differentiering af humane dental pulp-afledte stamceller. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. prioner. 2018 Mar 4. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
- Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
- Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
- Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
- Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
- Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
- Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
- Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
- Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
- Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
- Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
- Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
- Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
- Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
- Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
- Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
- Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
- Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
- Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
- Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
- Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
- Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
- Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
- Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).
