En este manuscrito, hemos establecido un método de alto rendimiento para cuantificar la actividad de la fosfatasa alcalina en la cultura de biofilm de S. aureus de placa de 96 pocillos cultivo de tejido
Fosfatasa alcalina (ALP) es una enzima común expresada en las células procariotas y eucariotas. Cataliza la hidrólisis de Monoésteres de fosfato de muchas moléculas en pH básico y juega un papel indispensable en el metabolismo del fosfato. En los seres humanos, ALP eucariota es una de las señales enzimáticas más frecuente en el diagnóstico de varias enfermedades, tales como colestasis y raquitismo. En S. aureus, ALP se detecta exclusivamente en la membrana de la célula; también se expresa como forma secretora. Sin embargo, poco se sabe sobre su función en la formación de biopelículas.
El objetivo de este manuscrito es desarrollar un análisis rápido y fiable para medir la actividad ALP en biofilm de S. aureus que no requiere aislamiento de proteínas. Utilizando p-nitrofenil fosfato (pNFF) como sustrato, se evaluó la actividad ALP en biofilm de S. aureus en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Actividad se basa en la formación del producto de la reacción soluble midiendo absorbancia nm 405. La naturaleza de alto rendimiento del método de placa de 96 bien cultura de tejido proporciona un método sensible y reproducible para ensayos de actividad de la ALP. La misma experimental establecido puede ampliarse también para medir otros marcadores moleculares extracelulares relacionadas con la formación de biopelículas.
Fosfatasa alcalina (ALP) ubicuo se expresa en tanto de células procariotas y eucariotas1. Puede catalizar la hidrólisis de monofosfato de diferentes moléculas como nucleótidos, proteínas, alcaloides, ésteres de fosfato y anhídridos del ácido fosfórico. En los seres humanos, ALP eucariota está presente en muchos tejidos incluyendo el hígado, hueso, intestino y placenta2. Juega un papel importante en la fosforilación de proteínas, crecimiento de la célula, apoptosis, la célula de vástago procesos así como mineralización esquelética normal. ALP eucariota es también un indicador clave del suero para la presencia de enfermedades en huesos, hígado y otros tejidos/órganos cuando elevada3,4.
ALP procariota se ha detectado en una variedad de células bacterianas, incluyendo5de e. coli, S. aureus6,7 y algunas bacterias de rumen común en los suelos8. Actividad de fosfatasa alcalina bacteriana ha sido utilizado como un biosensor en la detección de pesticidas, metales pesados9 y10de contaminación bacteriana. La expresión constitutiva de ALP se ha utilizado para identificar estafilococos11 y diferenciar Serratia de Enterobacter12. Se sugirió que la producción constitutiva de ALP está correlacionado con patogenicidad en estafilococos13. Aunque ALP ha sido estudiado en diferentes configuraciones3,4, sin embargo, poco se divulga para su actividad y función en las culturas de los biofilms.
El biofilm se ha documentado para tener una diferente funcionamiento vida bacteriana en comparación con su contraparte de célula bacteriana libre-que viven14. En S. aureus, la formación de biofilm se ha identificado en una variedad de condiciones clínicas y representa la resistencia a los antibióticos y la inflamación crónica15,16. Muchas moléculas habían sido divulgadas en una matriz de la biopelícula como polisacáridos, proteínas, ácidos nucleicos y lípidos, pero el mecanismo de formación de biofilm no es completamente entendido14. Para entender el papel de ALP en la formación de biopelículas, cultivadas de biopelículas de S. aureus en placas de cultivo de tejidos bien 96 y mide la actividad de fosfatasa alcalina usando para-nitrophenylphosphate (pNFF).
La molécula pNFF está lista para usar sustrato para fosfatasa alcalina y ha sido ampliamente utilizado para medir la actividad ALP6,17,18. Este ensayo colorimétrico se basa en la conversión para-nitrofenil fosfato (pNFF) de para-nitrofenol resultando en un producto coloreado a 405 nm. En comparación con otros análisis de fosfatasa alcalina convencional, tales como gel de agarosa electroforesis19, precipitación de (WGA) de la aglutinina de germen de trigo, y WGA-HPLC20, este análisis es altamente específico, sensible, fácil de reproducir y más importante, permite la alta rendimiento de procesamiento.
En nuestro análisis, hemos utilizado pNFF como el sustrato de la fosfatasa alcalina. Se trata de una solución de trabajo diseñada para ELISA y dilución no es necesario. Después de la hidrólisis por ALP, un producto amarillo se desarrolla y puede ser medido a 405 nm. Al final de la reacción enzimática, brevemente se centrifugó la placa bien 96 y transfirió el sobrenadante a un plato bien 96 fresco para medir absorbancia con el lector. Se encontró que este paso de centrifugado extra es crítica, puesto que aumen…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Guillermo Rainey Harper College y la Universidad de Illinois en Chicago para la facilidad de llevar a cabo estos experimentos. También agradecemos a McGraw Hill Foundation por su generoso apoyo.
Agar | VWR | 9002-18-0 | |
Eppendorf Centrifuge | Thomas Scientific | 5810 | |
Gluose | VWR | 50-99-7 | |
NaOH pellets | VWR | SS0550-500GR | |
Para-nitrophenylphosphate (pNPP) | Sigma | P7998-100ML | Typical concentrations of pNPP liquid substrates, often used in enzyme-linked immunesorbent assays (ELISA), range between 10 to 50 mM. Similar to most ready-to-use pNPP liquid substrates like the one used here, the exact pNPP concentration is not disclosed due to its proprietary nature. |
10X PBS, pH7.4. 173 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 |
Sigma | P3288-1VL | |
Plate Reader | Biotek | ELx808 | |
S. aureus | ATCC | ATCC25923 | |
Tryptic Soy Agar 15g / L TSB | VWR | 9002-18-0 | |
Tryptic Soy Broth: g/L Pancreatic Digest of Casein………… 15.0 Papaic Digest of Soyben Meal………5.00 Sodium chloride………………………… 3.00 Dextrose…………………………………. 2.50 Dipotassium phosphate………………2.50 |
VWR | 90006-098 | |
96 well tissue culture plates | BD | 6902D09 | U shaped bottom |