Summary

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

Published: April 18, 2019
doi:

Summary

Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.

Abstract

La piel es el órgano más grande del cuerpo y tiene muchas funciones. La piel actúa como barrera física y protector del cuerpo y regula las funciones corporales. Biomimética es la imitación de los modelos, sistemas y elementos de la naturaleza con el fin de resolver problemas humanos complejos1. Biomimética de la piel es una herramienta útil para la medicina regenerativa in vivo y in vitro investigación. Las células madre humanas pluripotentes inducidas (iPSCs) tienen la característica de la proliferación ilimitada y la capacidad de diferenciación de tres capas germinales. IPSCs humanos se generan de varias células primarias, como las células sanguíneas, queratinocitos, fibroblastos y más. Entre ellos, células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) han emergido como una fuente alternativa de la célula desde la perspectiva de la medicina regenerativa allogeneic. CBMCs son útiles en medicina regenerativa porque leucocito humano antígeno (HLA) escribir es esencial para la célula del sistema bancario. Nos proporcionan un método para la diferenciación de CBMC-iPSCs en queratinocitos y los fibroblastos y para la generación de un organoide de piel 3D. Fibroblastos y queratinocitos derivados de iPSC CBMC tienen características similares a una línea celular primaria. Los organoides de la piel 3D se generan superponiendo una capa epidérmica en una capa dérmica. Mediante el trasplante de este organoide 3D de la piel, se genera un modelo de ratones humanizados. Este estudio demuestra que un organoide de piel derivado de iPSC humana 3D puede ser una herramienta novedosa, la alternativa para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.

Introduction

La piel cubre la superficie exterior del cuerpo y protege órganos internos. La piel tiene varias funciones, incluyendo la protección contra patógenos, absorber y almacenar agua, regular la temperatura del cuerpo y excretar el cuerpo de residuos2. Injertos de piel se pueden clasificar dependiendo de la fuente de la piel; injertos con piel de otro donante se denominan aloinjertos e injertos utilizando la piel del propio paciente son autoinjertos. Aunque un autoinjerto es el tratamiento preferido debido a su riesgo de rechazo baja, biopsias de la piel son difíciles de realizar en pacientes con lesiones severas o un número insuficiente de células de la piel. En pacientes con quemaduras graves, tres veces el número de células de la piel es necesario para cubrir áreas grandes. La disponibilidad limitada de las células de la piel del cuerpo del paciente los resultados en situaciones donde es necesario allogenous trasplante. Un aloinjerto se utiliza temporalmente hasta que el trasplante autólogo puede realizarse ya que generalmente es rechazado por el sistema de inmune después de aproximadamente 1 semana3. Para superar el rechazo por el sistema inmune del paciente, injertos deben venir de una fuente con la misma identidad inmunológica del paciente4.

IPSCs humanas son una fuente emergente de células para la terapia de la célula de vástago5. IPSCs humanas se generan en las células somáticas, utilizando factores de reprogramación como OCT4, SOX2, Klf4 y c-Myc6. Utilizando iPSCs humana supera los problemas éticos e inmunológicos de las células madre embrionarias (ESCs)7,8. Humanos iPSCs con pluripotencia y puede diferenciarse en tres capas germinales9. La presencia de HLA, un factor crítico en medicina regenerativa, determina la respuesta inmune y la posibilidad de rechazo10. El uso de derivados del paciente iPSCs resuelve los problemas de rechazo de la limitación y el sistema inmune celular-fuente. CBMCs también han surgido como una fuente alternativa de la célula para medicina regenerativa11. Obligatorio HLA mecanografía, que ocurre durante la banca CBMC, se puede utilizar fácilmente para la investigación y trasplante. Además, homocigótica tipo HLA iPSCs puede aplicar ampliamente a varios pacientes12. Un banco de CBMC-iPSC es un novedoso y eficaz estrategia para terapia celular y medicina regenerativa alógeno12,13,14. En este estudio, utilizamos CBMC-iPSCs, diferenciado en queratinocitos y fibroblastos y generar capas 3D estratificado de la piel. Los resultados de este estudio sugieren que un organoide 3D CBMC-iPSC-derivados de la piel es una novedosa herramienta para la investigación dermatológica in vitro e in vivo.

Protocol

Todos los procedimientos que involucran animales fueron realizados conforme a la ley de bienestar de animales de laboratorio, la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y las directrices y políticas para la experimentación de roedor proporcionan por el cuidado institucional de Animal y Uso (IACUC) Comité de la escuela de medicina de la Universidad Católica de Corea. El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad Católica de Corea (CUMC-2018-0191-01). La…

Representative Results

Piel se compone, en su mayor parte, de la epidermis y la dermis. Queratinocitos son el tipo principal de célula de la epidermis, y los fibroblastos son el tipo principal de célula de la dermis. En figura 1se muestra el esquema de la diferenciación del keratinocyte. CBMC-iPCSc se mantuvieron en un plato cubierto de vitronectina (figura 1B). En este estudio, hemos diferenciado CBMC-iPSCs en queratinocitos y fibroblastos con for…

Discussion

IPSCs humanas se han sugerido como una nueva alternativa para la medicina regenerativa personalizada17. Derivados del paciente personalizados iPSCs reflejan características de los pacientes que pueden utilizarse para el modelado de enfermedades, detección de drogas y trasplante autólogo18,19. El uso de iPSCs derivados del paciente también puede superar problemas con respecto a células primarias, la falta de un número adecuado de cél…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Corea salud tecnología R & D proyectos, Ministerio de sanidad, bienestar y familia, República de Corea (H16C2177, H18C1178).

Materials

Adenine Sigma A2786 Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium) STEMCELL 05893 EB formation
Anti-Fibronectin antibody abcam ab23750 Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody abcam ab7800 Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody abcam ab85679 Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody abcam ab124762 Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody Santa cruz sc-7558 Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC Johnson & Johnson Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel) BD 354277 Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture AILEEE SK617 Skin graft
CaCl2 Sigma C5670 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I BD 354236 3D skin organoid
Collagen type IV Santa-cruz sc-29010 Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium Gibco 10744-019 Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose Gibco 11995065 Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium Gibco 11330-032 Component of differentiation medium
Essential 8 medium Gibco A1517001 iPSC medium
FBS, Qualified Corning 35-015-CV Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement  Gibco 35050061 Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin Invtrogen 12585-014 Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor Professional PC-02.10 Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium Gibco 17005-042 Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960 Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid Gibco 1140050 Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm HIROSE HC 2265-1 Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J The Jackson Laboratory 001303 Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm Hyundai Micro H10090 Plastic ware
Recombinant Human BMP-4 R&D 314-BP Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein R&D 236-EG Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid Sigma R2625 Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx TPP 93100 Plastic ware
Transferrin Sigma T3705 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts  Corning CLS3492 Plastic ware for 3D skin organoid 
Vitronectin Life technologies A14700 iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride peprotech 1293823 iPSC culture

References

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Cite This Article
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).

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