Summary

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

Published: April 18, 2019
doi:

Summary

Wir schlagen eine Protokoll, die zeigt, wie man differenzieren induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Keratinozyten und Fibroblasten und generieren eine organoide 3D Haut mit diesen Keratinozyten und Fibroblasten. Dieses Protokoll enthält einen zusätzlichen Schritt einem humanisierten Mäuse-Modell zu erzeugen. Die hier vorgestellten Technik verbessert die dermatologische Forschung.

Abstract

Die Haut ist das größte Organ und hat viele Funktionen. Die Haut wirkt wie eine physikalische Barriere und Beschützer des Körpers und reguliert Körperfunktionen. Bionik ist die Nachahmung der Modelle, Systeme und Elemente der Natur zur Lösung komplexer Probleme1. Haut-Bionik ist ein nützliches Werkzeug für die Erforschung von Krankheiten in-vitro- und in-vivo regenerative Medizin. Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) haben das Merkmal der unbegrenzten Verbreitung und die Fähigkeit der Differenzierung, drei Mikrobeschichten. Menschlichen iPSCs entstehen aus verschiedenen Primärzellen, wie Blutzellen, Keratinozyten und Fibroblasten. Unter ihnen sind Kabel mononukleären Blutzellen (CBMCs) als alternative Zelle Quelle aus der Perspektive der allogenen regenerative Medizin entstanden. CBMCs eignen sich in der regenerativen Medizin, weil human Leukocyte Antigen (HLA) Eingabe in die Zelle, die banking-System notwendig ist. Wir bieten eine Methode für die Differenzierung von CBMC iPSCs in Keratinozyten und Fibroblasten und zur Erzeugung von einem 3D Haut organoide. CBMC-iPSC-derived Keratinozyten und Fibroblasten haben ähnliche Merkmale auf, eine primäre Zelllinie. Die 3D Haut Organellen entstehen durch die Überlagerung einer epidermalen Schicht auf eine Hautschicht. Durch die Transplantation von diesem 3D Haut organoide, wird einen vermenschlichten Mäuse-Modell erstellt. Diese Studie zeigt, dass ein 3D iPSC-abgeleitete Menschenhaut organoide möglicherweise eine neuartige, alternative Tool für dermatologische Forschung in vitro und in vivo.

Introduction

Haut bedeckt die äußerste Oberfläche des Körpers und schützt innere Organe. Die Haut hat verschiedene Funktionen, einschließlich Schutz gegen Krankheitserreger, Aufnahme und Speicherung von Wasser, Regulierung der Körpertemperatur, und Körper Ausscheiden Abfälle2. Hauttransplantationen können je nach Haut Quelle eingestuft werden; Transplantate mit der Haut von einem anderen Spender sind Allografts bezeichnet, und mit der Haut des Patienten Transplantate sind Autotransplantate. Obwohl eine Autotransplantation die bevorzugte Behandlung wegen seiner niedrigen Ablehnung ist, sind Hautbiopsien schwer auf Patienten mit schweren Verletzungen oder eine unzureichende Anzahl von Hautzellen durchführen. Bei Patienten mit schweren Verbrennungen sind drei Mal die Zahl der Hautzellen notwendig, um große Flächen abdecken. Die begrenzte Verfügbarkeit von Hautzellen vom Körper des Patienten führt zu Situationen, wo allo-Transplantation erforderlich ist. Ein Allograft dient vorübergehend bis autologe Transplantation durchgeführt werden kann, da es in der Regel vom Immunsystem des Wirts nach ca. 1 Woche3abgelehnt wird. Ablehnung durch das Immunsystem zu überwinden, müssen die Transplantate aus einer Quelle mit der gleichen immun Identität als Patient4kommen.

Menschlichen iPSCs sind eine neue Quelle von Zellen für Stammzell-Therapie5. Menschlichen iPSCs entstehen aus Körperzellen, Neuprogrammierung Faktoren wie OCT4, SOX2, Klf4 und c-Myc-6. Mit menschlichen iPSCs überwindet die ethischen und immunologischen Fragen von embryonalen Stammzellen (WSR)7,8. Menschlichen iPSCs haben Pluripotenz und kann in drei Mikrobeschichten9unterscheiden. Das Vorhandensein von HLA, ein entscheidender Faktor in der regenerativen Medizin, bestimmt die Immunantwort und die Möglichkeit der Ablehnung10. Die Verwendung von Patienten abgeleitet iPSCs löst die Probleme der Zelle-Source Einschränkung und Immunsystem Ablehnung. CBMCs sind auch als alternative Zelle Quelle für regenerative Medizin11entstanden. Obligatorische HLA Typisierung, die während CBMC Banking auftritt, kann leicht für Forschung und Transplantation verwendet werden. Weitere, homozygot HLA-Typ iPSCs können weitgehend auf verschiedenen Patienten12anwenden. Eine CBMC iPSC-Bank ist eine neuartige und effiziente Strategie für Zelltherapie und allogenen regenerative Medizin12,13,14. In dieser Studie wir verwenden CBMC-iPSCs in Keratinozyten und Fibroblasten, differenzieren und geschichteten 3D Hautschichten zu generieren. Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass eine CBMC iPSC abgeleitete 3D Haut organoide ein neuartiges Werkzeug für in-vitro- und in-vivo dermatologische Forschung ist.

Protocol

Alle Verfahren, die Tiere wurden in Übereinstimmung mit dem Labor Tiere Welfare Act, der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, durchgeführt und die Richtlinien und Richtlinien für Nager Experimente zur Verfügung gestellt von der institutionellen Animal Care und Ausschuss (IACUC) von der medizinischen Fakultät der katholischen Universität von Korea zu verwenden. Das Studienprotokoll wurde von Institutional Review Board of The Catholic University of Korea (CUMC-2018-0191-01) genehmigt. Die IACUC u…

Representative Results

Haut besteht zum größten Teil aus der Epidermis und der Dermis. Keratinozyten sind die wichtigsten Zellen der Epidermis und Fibroblasten sind die wichtigsten Zelltyp der Dermis. Das Schema der Keratinozyten Differenzierung ist in Abbildung 1Agezeigt. CBMC-iPCSc wurden beibehalten, in einer Schale Vitronectin beschichtet (Abbildung 1B). In dieser Studie differenziert wir CBMC iPSCs in Keratinozyten und Fibroblasten mit EB Bildu…

Discussion

Menschlichen iPSCs haben als eine neue Alternative für personalisierte regenerative Medizin17vorgeschlagen worden. Personalisierte iPSCs Patienten abgeleitet reflektieren Patienten-Charakteristika, die für die Krankheit Modellierung, Drogen-Screening und autologe Transplantation18,19verwendet werden können. Die Verwendung von Patienten abgeleitet iPSCs kann auch Probleme in Bezug auf primäre Zellen, ein Mangel an ausreichenden Zellzahl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus Korea Healthcare Technology R & D Projekt, Ministerium für Gesundheit, Wohlfahrt und Familienangelegenheiten, Republik Korea (H16C2177, H18C1178) unterstützt.

Materials

Adenine Sigma A2786 Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium) STEMCELL 05893 EB formation
Anti-Fibronectin antibody abcam ab23750 Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody abcam ab7800 Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody abcam ab85679 Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody abcam ab124762 Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody Santa cruz sc-7558 Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC Johnson & Johnson Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel) BD 354277 Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture AILEEE SK617 Skin graft
CaCl2 Sigma C5670 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I BD 354236 3D skin organoid
Collagen type IV Santa-cruz sc-29010 Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium Gibco 10744-019 Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose Gibco 11995065 Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium Gibco 11330-032 Component of differentiation medium
Essential 8 medium Gibco A1517001 iPSC medium
FBS, Qualified Corning 35-015-CV Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement  Gibco 35050061 Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin Invtrogen 12585-014 Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor Professional PC-02.10 Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium Gibco 17005-042 Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960 Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid Gibco 1140050 Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm HIROSE HC 2265-1 Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J The Jackson Laboratory 001303 Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm Hyundai Micro H10090 Plastic ware
Recombinant Human BMP-4 R&D 314-BP Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein R&D 236-EG Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid Sigma R2625 Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx TPP 93100 Plastic ware
Transferrin Sigma T3705 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts  Corning CLS3492 Plastic ware for 3D skin organoid 
Vitronectin Life technologies A14700 iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride peprotech 1293823 iPSC culture

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Cite This Article
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).

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