Vi foreslår en protokoll som viser hvordan å skille indusert pluripotent Stamcelle-avledet keratinocytter og fibroblaster og generere en 3D huden organoid, bruke disse keratinocytter og fibroblaster. Denne protokollen inneholder et ekstra trinn for å generere en humanized mus modell. Teknikken presenteres her vil forbedre dermatologic forskning.
Huden er kroppens største organ og har mange funksjoner. Huden fungerer som en fysisk barriere og beskytter av kroppen og regulerer kroppsfunksjoner. Biomimetics er imitasjon av modeller, systemer og elementene for å løse komplekse menneskelige problemer1. Huden biomimetics er et nyttig verktøy for i vitro sykdom forskning og i vivo regenerativ medisin. Menneskelige indusert pluripotent stamceller (iPSCs) har karakteristisk for ubegrenset spredning og differensiering evnen til å tre bakterie lag. Menneskelige iPSCs genereres fra ulike primære celler, for eksempel blodceller, keratinocytter, fibroblaster og mer. Blant dem, ledningen blod mononukleære celler (CBMCs) har dukket opp som en alternativ celle fra perspektivet til allogene regenerativ medisin. CBMCs er nyttige i regenerativ medisin fordi menneskelige leukocytter antigen (HLA) skriver er avgjørende for cellen banksystemet. Vi tilbyr en metode for differensiering av CBMC-iPSCs keratinocytter og fibroblaster og generering av en 3D hud organoid. CBMC-iPSC-avledet keratinocytter og fibroblaster har egenskaper som ligner på en primær cellen linje. 3D huden organoids genereres ved overliggende dypeste laget på et dermal lag. Ved transplanting denne 3D huden organoid, genereres en humanized mus modell. Denne studien viser at en 3D iPSC-avledet huden organoid kan være en roman, alternative verktøy for dermatologic forskning i vitro og in vivo.
Huden dekker ytterste overflaten av kroppen og beskytter indre organer. Huden har forskjellige funksjoner, inkludert beskyttelse mot patogener, absorberende og lagring vann, regulerer kroppstemperaturen, og skiller ut kroppen avfall2. Huden grafts kan klassifiseres avhenger på huden kilde; graftene med skall fra en annen donor kalles allografts grafts ved hjelp av pasientens egen hud er autografts. Selv om en autograft er foretrukket behandling på grunn av sin lave avvisning risiko, er hud biopsies vanskelig å utføre på pasienter med alvorlig lesjonene eller et lite antall hudceller. Hos pasienter med alvorlige forbrenninger er tre ganger antall hudceller nødvendig for å dekke store områder. Den begrensede tilgjengeligheten av hudceller fra pasientens kropp resulterer i situasjoner der allogenous transplantasjon er nødvendig. En allograft brukes midlertidig til autolog transplantasjon kan utføres siden den er vanligvis avvist av verten immunsystem etter ca 1 uke3. Å seire over avslag av pasientens immunsystem, må graftene komme fra en kilde med samme immun identitet som pasient4.
Menneskelig iPSCs er en nye celler for stilk cellen terapi5. Menneskelige iPSCs genereres fra somatiske celler, med reprogramming faktorer som OCT4, SOX2, Klf4 og c-Myc6. Bruker human iPSCs seirer etiske og immunologiske saker av embryonale stamceller (ESCs)7,8. Menneskelige iPSCs har pluripotency og kan skille ut tre bakterie lag9. Tilstedeværelsen av HLA, en kritisk faktor i regenerativ medisin, bestemmer immunforsvaret og muligheten for avvisning10. Bruk av pasient-avledede iPSCs løser problemene med cellen kildekode begrensning og immunsystemet avvisning. CBMCs har også dukket opp som en alternativ cellen for regenerativ medisin11. Obligatorisk HLA skriver, som oppstår under CBMC bank, kan enkelt brukes for forskning og transplantasjon. Videre, homozygous HLA-type iPSCs kan vidt gjelder ulike pasienter12. En CBMC-iPSC bank er en roman og effektiv strategi for cellen terapi og allogenic regenerativ medisin12,13,14. I denne studien vi bruker CBMC-iPSCs, i keratinocytter og fibroblaster, og generere lagdelt 3D huden lag. Resultater fra denne studien tyder på at en CBMC-iPSC-avledet 3D huden organoid er en roman verktøy for i vitro og in vivo dermatologic forskning.
Menneskelige iPSCs har blitt foreslått som et nytt alternativ for personlig regenerativ medisin17. Pasient-avledede personlig iPSCs gjenspeiler pasientens egenskaper som kan brukes for sykdom modellering og narkotikarelaterte screening autolog transplantasjon18,19. Bruk av pasient-avledede iPSCs kan også overvinne problemer vedrørende primære celler, mangel på tilstrekkelig celle tall og immunreaksjoner5,<…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Korea Healthcare teknologi R & D prosjektet, departementet for helse-, sosial- og familiedepartementet, Sør-Korea (H16C2177, H18C1178).
Adenine | Sigma | A2786 | Component of differentiation medium for fibroblast |
AggreWell Medium (EB formation medium) | STEMCELL | 05893 | EB formation |
Anti-Fibronectin antibody | abcam | ab23750 | Fibroblast marker |
Anti-KRT14 antibody | abcam | ab7800 | Keratinocyte marker |
Anti-Loricrin antibody | abcam | ab85679 | Stratum corneum marker |
Anti-p63 antibody | abcam | ab124762 | Keratinocyte marker |
Anti-Vimentin antibody | Santa cruz | sc-7558 | Fibroblast marker |
BAND AID FLEXIBLE FABRIC | Johnson & Johnson | – | Bandage |
Basement membrane matrix (Matrigel) | BD | 354277 | Component of differentiation medium for fibroblast |
BLACK SILK suture | AILEEE | SK617 | Skin graft |
CaCl2 | Sigma | C5670 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
Collagen type I | BD | 354236 | 3D skin organoid |
Collagen type IV | Santa-cruz | sc-29010 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
Defined keratinocyte-Serum Free Medium | Gibco | 10744-019 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
DMEM, high glucose | Gibco | 11995065 | Component of differentiation medium |
DMEM/F12 Medium | Gibco | 11330-032 | Component of differentiation medium |
Essential 8 medium | Gibco | A1517001 | iPSC medium |
FBS, Qualified | Corning | 35-015-CV | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
Glutamax Supplement | Gibco | 35050061 | Component of differentiation medium for fibroblast |
Insulin | Invtrogen | 12585-014 | Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte |
Iris standard curved scissor | Professional | PC-02.10 | Surgical instrument |
Keratinocyte Serum Free Medium | Gibco | 17005-042 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate | Sigma | A8960 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
MEM Non-Essential Amino Acid | Gibco | 1140050 | Component of differentiation medium for fibroblast |
Meriam Forceps Thumb 16 cm | HIROSE | HC 2265-1 | Surgical instrument |
NOD.CB17-Prkdc SCID/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice strain for skin graft |
Petri dish 90 mm | Hyundai Micro | H10090 | Plastic ware |
Recombinant Human BMP-4 | R&D | 314-BP | Component of differentiation medium for keratinocyte |
Recombinant human EGF protein | R&D | 236-EG | Component of differentiation medium for keratinocyte |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Component of differentiation medium for keratinocyte |
T/C Petridish 100 mm, 240/bx | TPP | 93100 | Plastic ware |
Transferrin | Sigma | T3705 | Component of epithelial medium for 3D skin organoid |
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts | Corning | CLS3492 | Plastic ware for 3D skin organoid |
Vitronectin | Life technologies | A14700 | iPSC culture |
Y-27632 Dihydrochloride | peprotech | 1293823 | iPSC culture |