Summary

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

Published: April 18, 2019
doi:

Summary

Vi proponiamo un protocollo che Mostra come differenziare i cheratinociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte e fibroblasti e generare un organoid pelle 3D, utilizzando questi cheratinociti e fibroblasti. Questo protocollo contiene un ulteriore passaggio di generazione di un modello di topi umanizzati. La tecnica presentata qui miglioreranno ricerca dermatologica.

Abstract

La pelle è il più grande organo del corpo e ha molte funzioni. La pelle agisce come una barriera fisica e protettore del corpo e regola le funzioni corporee. Biomimetica è l’imitazione dei modelli, sistemi e gli elementi della natura allo scopo di risolvere complessi problemi umani1. Pelle biomimetica è uno strumento utile per la ricerca di malattia in vitro e in vivo della medicina rigenerativa. Cellule staminali umane pluripotenti indotte (iPSCs) hanno la caratteristica di proliferazione illimitata e la capacità di differenziazione di tre strati di germe. IPSCs umane vengono generati da varie cellule primarie, quali le cellule del sangue, cheratinociti e fibroblasti. Fra loro, cellule mononucleari del sangue ombelicale (CBMC) sono emersi come una fonte alternativa cellulare dal punto di vista della medicina rigenerativa allogenica. CBMC sono utili nella medicina rigenerativa perché umano del leucocita (HLA) l’antigene digitando è essenziale alla cella sistema bancario. Mettiamo a disposizione un metodo per la differenziazione del CBMC-iPSCs in cheratinociti e fibroblasti e per la generazione di un 3D pelle organoid. Fibroblasti e cheratinociti CBMC-iPSC-derivati hanno caratteristiche simili ad una linea cellulare primaria. Il organoids pelle 3D vengono generati mediante la sovrapposizione di uno strato epidermico su uno strato dermico. Trapiantando questo organoid pelle 3D, viene generato un modello di topi umanizzati. Questo studio indica che un organoid 3D pelle umana iPSC-derivato può essere uno strumento di romanzo, alternativo per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.

Introduction

Pelle copre la superficie più esterna del corpo e protegge gli organi interni. La pelle ha diverse funzioni, tra cui la protezione contro gli agenti patogeni, assorbire e immagazzinare l’acqua, regolazione della temperatura corporea ed espellendo corpo rifiuti2. Gli innesti di pelle possono essere classificati a seconda dell’origine della pelle; gli innesti usando la pelle da un altro donatore sono denominati allotrapianti, e gli innesti usando la pelle del paziente sono gli autoinnesti. Anche se un autoinnesto è il trattamento preferito a causa del suo rischio basso rifiuto, le biopsie della pelle sono difficili da eseguire su pazienti con lesioni gravi o di un numero insufficiente di cellule della pelle. In pazienti con gravi ustioni, tre volte il numero delle cellule della pelle è necessario per coprire vaste aree. La disponibilità limitata delle cellule della pelle dal corpo di un paziente si traduce in situazioni dove è necessario il trapianto di allogenous. Un documento non autografo è temporaneamente utilizzato fino a trapianto autologo può essere eseguito poiché è rifiutata solitamente dal sistema immunitario dell’ospite dopo circa 1 settimana3. Per superare il rifiuto dal sistema immunitario del paziente, gli innesti devono provenire da una fonte con la stessa identità immune del paziente4.

IPSCs umane sono un emergenti fonte di cellule staminali terapia5. IPSCs umane vengono generati dalle cellule somatiche, utilizzando fattori di riprogrammazione come OCT4, SOX2, Klf4 e c-Myc6. Utilizzando iPSCs umane supera le questioni etiche e immunologiche delle cellule staminali embrionali (ESCs)7,8. IPSCs umane hanno pluripotenza e possono differenziarsi in tre strati germinativi9. La presenza di HLA, un fattore critico nella medicina rigenerativa, determina la risposta immunitaria e la possibilità di rifiuto10. L’uso di derivati paziente iPSCs risolve i problemi di rigetto di limitazione e sistema immunitario cellulare-fonte. CBMC sono emerse anche come fonte alternativa cellulare per la medicina rigenerativa11. Obbligatorio HLA tipizzazione, che si verifica durante operazioni bancarie CBMC, facilmente utilizzabile per la ricerca e trapianto. Più ulteriormente, omozigoti iPSCs HLA-tipo può ampiamente applichi a vari pazienti12. Una banca CBMC-iPSC è un romanzo e una strategia efficace per la terapia cellulare e trapianto allogenico medicina rigenerativa12,13,14. In questo studio, usiamo CBMC-iPSCs, differenziate in cheratinociti e fibroblasti e generare strati della pelle 3D stratificato. Risultati da questo studio indicano che un organoid CBMC-iPSC-derivati della pelle di 3D è un nuovo strumento per la ricerca dermatologica in vitro e in vivo.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state eseguite in conformità con il laboratorio animali Welfare Act, la guida per la cura e l’uso di animali da laboratorio, e le linee guida e criteri per la sperimentazione di roditore forniti dalla cura istituzionale degli animali e Utilizzare il Comitato (IACUC) della scuola di medicina dell’Università cattolica della Corea del sud. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della Università Cattolica di Corea (CUMC-2018-0191-0…

Representative Results

Pelle è composta, per la maggior parte, dell’epidermide e del derma. Cheratinociti sono il tipo principale delle cellule dell’epidermide, e fibroblasti sono il tipo principale delle cellule del derma. Lo schema di differenziazione del keratinocyte è riportato in Figura 1A. CBMC-iPCSc sono state mantenute in un piatto di vitronectin-rivestito (Figura 1B). In questo studio, abbiamo differenziato CBMC-iPSCs in cheratinociti e fib…

Discussion

IPSCs umane sono stati suggeriti come una nuova alternativa per la medicina rigenerativa personalizzata17. Paziente-derivato personalizzato iPSCs riflettono le caratteristiche dei pazienti che possono essere utilizzate per la modellazione di malattia, lo screening di stupefacenti e di trapianto autologo18,19. L’uso di derivati paziente iPSCs può anche superare problemi per quanto riguarda le cellule primarie, una mancanza di numeri di cel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Quest’opera è stata sostenuta da una sovvenzione la Corea Healthcare Technology R & D Project, Ministero della sanità, Welfare e famiglia, Repubblica di Corea (H16C2177, H18C1178).

Materials

Adenine Sigma A2786 Component of differentiation medium for fibroblast
AggreWell Medium (EB formation medium) STEMCELL 05893 EB formation
Anti-Fibronectin antibody abcam ab23750 Fibroblast marker
Anti-KRT14 antibody abcam ab7800 Keratinocyte marker
Anti-Loricrin antibody abcam ab85679 Stratum corneum marker
Anti-p63 antibody abcam ab124762 Keratinocyte marker
Anti-Vimentin antibody Santa cruz sc-7558 Fibroblast marker
BAND AID FLEXIBLE FABRIC Johnson & Johnson Bandage
Basement membrane matrix (Matrigel) BD 354277 Component of differentiation medium for fibroblast
BLACK SILK suture AILEEE SK617 Skin graft
CaCl2 Sigma C5670 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Collagen type I BD 354236 3D skin organoid
Collagen type IV Santa-cruz sc-29010 Component of differentiation medium for keratinocyte
Defined keratinocyte-Serum Free Medium Gibco 10744-019 Component of differentiation medium for keratinocyte
DMEM, high glucose Gibco 11995065 Component of differentiation medium
DMEM/F12 Medium Gibco 11330-032 Component of differentiation medium
Essential 8 medium Gibco A1517001 iPSC medium
FBS, Qualified Corning 35-015-CV Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Glutamax Supplement  Gibco 35050061 Component of differentiation medium for fibroblast
Insulin Invtrogen 12585-014 Component of differentiation medium for fibroblast and keratinocyte
Iris standard curved scissor Professional PC-02.10 Surgical instrument
Keratinocyte Serum Free Medium Gibco 17005-042 Component of differentiation medium for keratinocyte
L-ascorbic acid 2-phosphata sesquimagnesium salt hydrate Sigma A8960 Component of differentiation medium for keratinocyte
MEM Non-Essential Amino Acid Gibco 1140050 Component of differentiation medium for fibroblast
Meriam Forceps Thumb 16 cm HIROSE HC 2265-1 Surgical instrument
NOD.CB17-Prkdc SCID/J The Jackson Laboratory 001303 Mice strain for skin graft
Petri dish 90 mm Hyundai Micro H10090 Plastic ware
Recombinant Human BMP-4 R&D 314-BP Component of differentiation medium for keratinocyte
Recombinant human EGF protein R&D 236-EG Component of differentiation medium for keratinocyte
Retinoic acid Sigma R2625 Component of differentiation medium for keratinocyte
T/C Petridish 100 mm, 240/bx TPP 93100 Plastic ware
Transferrin Sigma T3705 Component of epithelial medium for 3D skin organoid
Transwell-COL collagen-coated membrane inserts  Corning CLS3492 Plastic ware for 3D skin organoid 
Vitronectin Life technologies A14700 iPSC culture
Y-27632 Dihydrochloride peprotech 1293823 iPSC culture

References

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Cite This Article
Kim, Y., Ju, J. H. Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (146), e59297, doi:10.3791/59297 (2019).

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