Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

דיסקציה של הרשתית הגולמי דרוזופילה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/59299
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Wesleyan University

Summary

מאמר זה מציג שיטה כירורגית ניקוד דרוזופילה הרשתיות הגולמי יחד עם פרוטוקולים עיבוד רקמה אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA-חילוץ.

Abstract

הרשתית הגולמי דרוזופילה מספק מערכת דגם מעולה לחקר תהליכים morphogenetic במהלך הפיתוח. בנייר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין רוברט של הרשתית הגולמי עדין דרוזופילה . הגישה כירורגי שלנו מנצל כלים microdissection זמינים פתח הגלמים ולחלץ בדיוק מתחמי עין-מוח. אלה יכולים להיות קבוע, נתון אימונוהיסטוכימיה, הרשתיות ואז רכוב על גבי שקופיות מיקרוסקופ, עם תמונה, אם המטרה היא לזהות מבנים הסלולר או subcellular. לחלופין, הרשתיות מבולבל יכול להיות מבודד רקמת המוח, lysed במאגרי המתאים, מנוצל להפקת חלבון ג'ל אלקטרופורזה או mRNA (להעריך ביטוי חלבון או הגן, בהתאמה). אימון משמעותי וסבלנות עשויים להידרש כדי לשלוט פרוטוקול microdissection תיאר, אך שולט, הפרוטוקול מאפשר בידוד מהיר יחסית של הרשתית בעיקר ניזוק.

Introduction

הרשתית דרוזופילה מורכב כ-750 ommatidia מוקף תאים פיגמנטים מסודרים חלת דבש סריג1,2,3,4. כל ommatidium כוללת שמונה קולט אור נוירונים, תאי חרוט מפריש עדשה 4 שני תאי הפיגמנט העיקרי. סביב כל ommatidium הם תאים מייצרי פיגמנט סריג וקבוצות זיפים חושית. בשל הטבע שלאחר mitotic שלה סטריאוטיפית סידור משושה, הרשתית הגולמי דרוזופילה מספק מערכת דגם מעולה לחקר תהליכים morphogenetic כולל תא אדהזיה5,6, 7,8,9,10 ואפופטוזיס11,12,13,14,15.

מספר פרוטוקולים שפורסמו לנצל לחץ האוויר לחלץ עין-מוח מתחמי דרוזופילה הגלמים16,17,18. הפרוטוקול המתואר כאן במקום זה מנצל כלים microdissection בקפידה ולבודד בדיוק מתחמי מוח-עין עם המטרה של השגת רקמת רשתית ניזוק. דבר זה חיוני אם הרשתיות הן כדי להיות מנוצל עבור מורפולוגי, חלבון, או ביטוי גנים מנתח מאז נזק הרשתיות עלול לגרום מתח סלולארית או המוות, אשר יכול לשנות את הביטוי הסלולר של פנוטיפ או הגן. בנוסף, לאחר תרגול, יכול מבודדת 6 עד 10 עין-מוח מתחמי ב 10-15 דקות, דבר המקל על המטרה של צמצום השתנות גיל, שלב התפתחותי של רקמת העין גזור.

הקיבעון, immunostaining ופרוטוקול כולה-הר המתוארים להלן מתאים ההכנה של העיניים דרוזופילה מיקרוסקופ פלואורסצנטי. יכול להיות מודגרות הרשתיות עם נוגדנים מיקוד חלבונים עניין. כך למשל, נוגדנים למרכיבים צומת adherens יכול להיות מנוצל להמחיש circumferences הפסגה של תאים כך מאפיינים כולל סוג התא, הצורה ואת סידור יכולה להיות המוערך19. לפני קיבוע, העיניים יכול במקום להיות ביקע מהמוח לצורך חילוץ חלבון לניתוח המערבי, או RNA לשימוש ב- PCR לרביעיית או RNA-רצף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. רקמות הכנה

  1. הגדרת דרוזופילה חוצה (כמתואר קודם לכן20) או זנים דרוזופילה ספציפיים כדי לקבל הגלמים של גנוטיפ הרצוי תרבות. כדי להבטיח כי מספר גדול של הגלמים מגיחים coincidently, להקים תרבויות אלה לעוף כפולים מדיה עשירות מזון או מזון סטנדרטיים מדיה בנדיבות בתוספת שמרים-הדבק.
  2. לשמור על תרבויות דרוזופילה ב 25 º C. צלבים ניצול מערכת UAS-GAL4, GMR-GAL4 הוא מנהל התקן אידיאלי הביע בתאים העין זחל דיסק אחורי את פארו morphogenetic וברחבי פיתוח הגולמי21,22,23, 24. משמשת UAS-lacZ X GMR-GAL4 לחצות פקד אידיאלי לחצות כמו זה משגע ביטוי של החלבון β-galactosidase שאינם אנדוגני ואדישה.
  3. השתמש קצה-6" במבוק סד שהיה רטוב עם מים מזוקקים בעדינות להרים את הגלמים קדם לבן (איור 1B) מהצד של תרבות בריא בקבוקונים (איור 1 א') ולמקם לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL (איור 1C).
  4. מניחים את הצינורות לתוך קופסת פלסטיק פיפטה עצה יחד עם חתיכה קטנה של רקמת ספוגה מים מזוקקים כדי לשמור על לחות מספיק כדי להגן על הגלמים מהתייבשות (איור 1D) תא הלחץ. דגירה הגלמים 25 ° c עד לנתיחה.
  5. להשתמש דחף בעדינות את הגלמים מהצינור microcentrifuge ו על שחורה לנתח תבשיל יבש-6" במבוק סד. שכב טריים נייר-דבק דו צדדי על המנה ויבתר מן הגלמים.
  6. בזהירות באמצעות זוג מלקחיים, המקום הצד הגבי הגלמים למעלה (קרי, operculums פונה כלפי מעלה, איור 1B) על גבי הקלטת (איור 2 א). ודא כי הגלמים לדבוק היטב הקלטת.
    הערה: לחות על המקרה הגולמי לעכב הדבקה מאובטח לקלטת, ובמקרה הזה, לאפשר הגלמים מילה נהדרת לפני הנחת על הקלטת דו-צדדית.

2. ניתוח של מתחמי עין-מוח

  1. להשתמש מלקחיים כדי להסיר את operculum של כל גולם (איור 2C).
  2. השתמש microdissection מספריים לחתוך או לפתוח את התיק הגולמי של כל גולם. דש פתח את האירוע הגולמי כדי לחשוף את הראש, החזה, הבטן הקדמי, המאבטחים את הקצוות של המקרה הגולמי בקלטת דו-צידית (איור 2C).
    הערה: אין צורך לחשוף לחלוטין הגלמים.
  3. לנקב את הבטן של כל גולם עם מלקחיים חדה, לתפוס את החיה, ולהסיר אותו מהתיק שלה הגולמי (איור 2C).
  4. מקום הגלמים על המנה לנתיחה שחור, הרחק הקלטת, ולכסות כ-400 µL של קרח פוספט-באגירה-פתרון (PBS, pH 7.4).
  5. לתפוס כל גולם על ידי הבטן עם מלקחיים, ועם microdissection מספריים, נעשה חתך נקי חתך דרך בית החזה כולו, חיתוך הגולם במחצית (איור דו-ממדי).
  6. להסיר את השריד האחורי של כל פגר PBS ולהניח בצד אחד על המנה ויבתר (לא למחוק, ראה שלב 3.2.1).
  7. באמצעות שני זוגות של מלקחיים בסדר, פתח את החזה ואת ראש כל גולם כדי לחשוף את המתחם עין-מוח (2E איור). כדי לעשות זאת, תופסים הקצוות לחתוך של האפיתל החזה והורס בהדרגה כדי לפתוח בית החזה ולאחר מכן ראש כמוסה, חשיפת העין-מוח מורכבים והוא הסמוכים רקמת השומן.
  8. בלי לתפוס את הרקמה, להשתמש מלקחיים מדריך המתחם עין-מוח מן השרידים של הקפסולה ראש או סקופ המתחם עין-מוח של הקפסולה ראש קרועה.
    הערה: המתחם עין-מוח הוא בצורת המשקולת תפר חוט רקמה אופווייט, שקוף יותר מאשר השומן בצבע קרם שמסביב (איור 2B, E).
  9. עם מלקחיים, הסר בזהירות את רוב השומן המשויך את מתחמי עין-מוח בלי לגעת רקמת העין.

3. עיבוד של רקמות Immunofluorescence

  1. לנתח הגלמים לפחות 6-10 כפי שתואר (מדרגות 2.1-2.9).
    הערה: שלושה או ארבעה משכפל עצמאית של כל ניתוח נוטים תשואה מספיק נתונים כדי לבדוק השערה.
  2. כביסה, קיבוע
    1. חותכים את קצה P20 או עצה פיפטה P100 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את הטיפ-פתיחת ~ 1 מ"מ ברדיוס ולסוך מאת pipetting שילוב של PBS ושומן למעלה ולמטה. השומן הזה ניתן להשיג שרידי הפגר שהוסר בשלב 2.6.
    2. להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 ל- PBS בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח. להשתמש את הטיפ משומנים, P20 או P100 על עקירה אוויר micropipette להעביר.
      הערה: עין-מוח מתחמי לדבוק טיפים ומקיאה במהלך pipetting, להיות ניזוק או אבד.
    3. להסיר את השומן הנותרים המשויכים רקמת העין על-ידי pipetting של PBS למעלה ולמטה כדי מערבולת בעדינות את מתחמי עין-מוח. זה, כל הצעדים הבאים כביסה, לא ישירות פיפטה עין-מוח מתחמי למעלה ולמטה כמו זו עתידה לפגוע רקמת העין שביר.
    4. להעביר את מתחמי עין-מוח באמצעי אחסון מינימלי (< 20 µL) ל- PBS לתוך µL לפחות 250 של מקבע. מערבבים על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 35 דקות, על קרח.
      הערה: הטיפ משומנים אותו מוכן בשלב 3.1.1 ניתן להעברה זו.
    5. עם הטיפ פיפטה אותו, להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 המכיל טוב ל- PBS. לערבב על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה, תקופת דגירה של 5-10 דקות על קרח, לרחוץ. חזור על השלב כביסה לפחות פעמיים.
      הערה: מתחמי עין-מוח יכול להישמר למשך מספר שעות בכביסה PBS הסופי, על הקרח, או 4 ° C, לפני שתמשיך לשלב 3.3.1.
  3. נוגדן מכתים
    1. כדי לחסום את הרקמה לפני חשיפה לפתרונות נוגדן, להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 של PBT. השתמש את הטיפ משומנים P20 או P100 על עקירה אוויר micropipette להעברה. תקופת דגירה של 10 עד 60 דקות, על קרח.
    2. הכן את הפתרון נוגדן ראשוני על ידי דילול נוגדנים המתאימים ב- PBT. מכיוון עין-מוח מתחמי מודגרת ב 10 aliquots µL של נוגדן פתרון, האחסון מוכן יהיה שכפול של 10.
    3. Aliquot 10 µL של נוגדן פתרון לבאר נקי של מגש 72-טוב microwell (ראה דיון).
    4. חותכים את קצה טיפ פיפטה P10 עם סכין גילוח נקי כדי להגדיל את הטיפ-פתח ~0.5 מ"מ ברדיוס ולסוך מאת pipetting PBT למעלה ולמטה.
    5. העברה לא יותר מ-5 מתחמי עין-מוח, נפח של < µL 3 ל- PBS, לתוך כל µL 10 טוב של נוגדן פתרון באמצעות micropipette עקירה אוויר של P10 והטיפ משומנים.
    6. Homogenize הפתרון נוגדנים על ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. לא pipette את מתחמי עין-מוח למעלה ולמטה כמו זו עתידה לפגוע הרקמה.
    7. כדי למזער את אידוי של הפתרון נוגדן, מניחים חתיכה קטנה של רקמת ספוגה מים מזוקקים במגש microwell, לאטום את המגש (למשל, עם המכסה מסופקים). דגירה בין לילה ב 4 º C.
    8. להעביר את מתחמי עין-מוח ממגש microwell µL ~ 400 של PBT בקערת זכוכית נקוו 9, לרחוץ. השתמש P10 אוויר הזחה micropipette ולהכין משיכור למר PBT טיפ (כפי שמתואר בשלב 3.3.4). מערבבים על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 5-10 דקות על קרח.
    9. חזור על השלב כביסה לפחות פעמיים. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א משיכור למר PBT טיפ כדי להעביר את מתחמי עין-מוח בין שטיפת פתרונות.
    10. הכן את הפתרון נוגדנים משניים על ידי דילול המתאים מתויג fluorophore משני נוגדנים ב- PBT כנדרש. µL 100 של נוגדנים משניים פתרון מספיקה לכל קבוצה של 6-10 הגלמים. Aliquot הפתרון נוגדנים משניים לתוך תבשיל חיתוך זכוכית נקוו-9.
    11. להעביר את מתחמי עין-מוח בתוך תמיסת נוגדנים משניים. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א משיכור למר PBT טיפ להעברה.
    12. דגירה את מתחמי עין-מוח בפתרון נוגדנים משניים עבור 1-2 h בטמפרטורת החדר, או h 3-5-4 מעלות צלזיוס. למניעת הלבנת של fluorophores על ידי אור, לכסות את ההכנה עם נייר כסף.
      הערה: אופטימלית משך הדגירה בפתרון נוגדנים משניים עשויים להשתנות לפי הנוגדנים והמשניים בשימוש.
    13. להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 של PBT בקערת זכוכית 9-ובכן, לרחוץ. מערבבים על-ידי pipetting הפתרון למעלה ולמטה. תקופת דגירה של 5-10 דקות על קרח. שלב זה כביסה יש לחזור לפחות פעמיים.
  4. קיבוע משני
    1. עבור יציבות משנית, להעביר את מתחמי עין-מוח µL לפחות 200 של מקבע, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר או 35 דקות ב 4 º C.
      הערה: קיבוע משני נעמד לו רקמת העין, אשר מסייע הרכבה (שלב 3.5).
    2. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א עצה PBT-יכולתי להעביר עין-מוח מתחמי לתוך ~ 400 µL של PBT בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח, לרחוץ למשך 5 דקות.
    3. חזור על השלב כביסה לפחות פעם אחת.
    4. שימוש P20 או P100 אוויר הזחה micropipette ואת משיכור למר PBT עצה כדי להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 400 ל- PBS בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח, לשטוף במשך 1-2 דקות לשמור את הרקמה בתנועה על ידי pipetting PBS, אבל לא את הרקמה , למעלה ולמטה כדי למנוע עין-מוח מתחמי מ מתפשרת והקפדה על המנה זכוכית במהלך שטיפה PBS.
  5. הרכבה
    1. להעביר את מתחמי עין-מוח µL ~ 200 הגוברת מדיה. להשתמש micropipette עקירה אוויר P20 או P100 א משיכור למר PBT טיפ כדי להעביר את מתחמי עין-מוח. לאפשר את הרקמה כדי equilibrate ב הרכבה מדיה עבור h 1-2.
    2. המקום טיפה µL 5-8 של הרכבה טריים מדיה לשקופית נקי במיקרוסקופ.
    3. חותכים טיפ P10 עם סכין גילוח נקי להגדיל את הטיפ-פתח ~0.5 מ"מ ברדיוס ולהשתמש זה, micropipette הזחה P10 אוויר כדי להעביר את מתחמי עין-מוח ב- 5-8 µL של הרכבה מדיה לתוך הירידה של הרכבה מדיה בשקופית.
    4. השתמש שתי מחטים טונגסטן להפריד את העיניים אופטיים אונות. להצמיד תסביך עין-מוח לשקופית עם מחט טונגסטן חסון, פורסים כל עין מן האונה אופטיים המשויכת שלה עם מחט בסדר טונגסטן (2F איור).
    5. השתמש את המחט טונגסטן בסדר לתמרן בכל עין אל פני השטח של השקופית מיקרוסקופ עם משטח הבסיס של כל עין סמוכים לשקופית. בעדינות להוריד את הכיסוי-תגית נקי על הרקמה ולאבטח עם לק.
      הערה: סידור העיניים בשקופית כך הם קרובים אחד לשני או בקו יקל מיקרוסקופ עוקבות.
    6. תמונה באדמומיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלורסנט.
      הערה: שקופיות צריך להיות מאוחסן ב 4 ° C אם לא עם תמונה מיד.

4. הכנה של רקמת העין עבור סופג המערבי:

  1. לנתח 10-16 גלמי (מדרגות 2.1-2.9) עם השינויים הבאים: א) לאסוף, לנתח את הגלמים בשתי קבוצות, 10-15 דקות אחד מהשני ומנתחים ב) ב- PBS בתוספת מעכבי פרוטאז, פוספטאז (PBS + pi).
  2. להעביר את מתחמי עין-מוח באמצעות P20 או P100 אוויר micropipette הזחה, יכולתי עצה (להכין כמו שלב 3.2.1) לתוך ~ 400 µL של PBS + pi בקערת זכוכית 9-. ובכן, על קרח, לשטוף בקצרה.
    הערה: המידע משומנים הזה יכול לשמש עבור והשלבים 4.3 ו- 4.4.
  3. חזור על השלב יש לשטוף פעמיים.
  4. העברת כל מתחמי עין-מוח לתוך ~ 400 µL של PBS קר קרח + pi יידרשו על גבי צלחת ויבתר שחור נקי.
  5. להסיר כל עין של האונות הראייה באמצעות מחט טונגסטן חסון (לייצב את המתחם עין-מוח) ומספריים גילוח בסדר או microdissection כדי לחתוך מהוללים כל עין מן האונה אופטיים.
    הערה: עיניים "סטיקי" בשלב זה, עלול לדבוק המנה ויבתר בקלילות. לזה יש יתרון זה יכול לעזור להקל על הסרת העיניים של האונות אופטיים (ראה דיון).
  6. "לטאטא" כל העיניים לערימה' ' ב- PBS + פאי על המנה ויבתר, באמצעות סכין אחד של זוג מלקחיים נאה.
  7. חותכים טיפ P10 עם סכין גילוח נקי כדי להרחיב את הפתח העצה ~0.5 מ"מ ברדיוס ולסוך העצה-הפנים על ידי pipetting המערבי רקמות פירוק מאגר (WTLB) למעלה ולמטה.
  8. להעביר את מתחמי עין-מוח ב 5 µL של PBS + pi לתוך צינור microcentrifuge µL 500. השתמש זו עצה משומנים micropipette עקירה אוויר P10 להשלים את ההעברה.
  9. במקום הצינור microcentrifuge על הקרח. להוסיף נפח 1 (5 µL) WTLB כדי המדגם, ו 10 µL 2 x ופרוטאין מרוכז דוגמת המאגר (או 2.5 µL 5 x ופרוטאין מרוכז דוגמת המאגר). מערבבים על-ידי הקשה.
  10. מערבולת microcentrifuge צינור בקצרה, ספין למטה מדגם באמצעות צנטריפוגה המצומצמת של שולחן העבודה.
  11. לאחסן את הדגימה ב-20 ° C עד הניתוח. לנתח באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.

5. הכנה של רקמת העין לחילוץ רנ א:

  1. ללבוש כפפות, benchtop נקי, מיקרוסקופ, כלי ניתוח ושחור לנתח מנה ראשונה עם אתנול 70% ולאחר מכן RNase טיהור ריאגנט. אפשר להתייבש.
  2. לנתח 30-40 הגלמים כפי שתואר (מדרגות 2.1-2.9) עם השינויים הבאים:) אוספים ומנתחים הגלמים 6 עד 8 בקבוצות, 15-20 דקות בנפרד; b) לנתח ללא נוקלאז PBS ו c) לבודד כל אצווה של העיניים בנפרד אבל לצבור כל רקמת רשתית לתוך הצינור microcentrifuge אותו (שלב 5.5).
    הערה: יש שני אנשים לנתח בו-זמנית. נאיץ את הבידוד יעיל של רקמת עין טובה.
  3. עבור כל אצווה, לבודד את העין-מוח מתחמי (מדרגות 2.1-2.9) ואת העברת לתוך ~ 400 µL של נוקלאז ללא PBS בקערת זכוכית 9-ובכן לשטוף בקצרה, על קרח, באמצעות micropipette עקירה אוויר P20 או P100 משומנים עצה (להכין כפי שמתואר בשלב 3.1.2).
    הערה: המידע משומנים הזה יכול לשמש עבור שלבים שלאחר מכן 5.4, 5.5 ו- 5.8.
  4. חזור על השלב יש לשטוף פעמיים.
  5. העבר את מתחמי עין-מוח לתוך טיפה µL 400 טריים של PBS חינם נוקלאז קפואים על שחור נקי לנתח את המנה.
  6. להסיר כל עין של האונות הראייה באמצעות מחט טונגסטן חסון (לייצב בראש העין מורכבת) ומספריים גילוח בסדר או microdissection כדי לחתוך מהוללים כל עין מן האונה אופטיים.
    הערה: עיניים "סטיקי" בשלב זה, עלול לדבוק המנה ויבתר בקלילות. לזה יש יתרון זה יכול לעזור להקל על הסרת העיניים של האונות אופטיים (ראה דיון).
  7. "לטאטא" כל העיניים לערימה' ' ב ללא נוקלאז מגניב על המנה ויבתר, באמצעות סכין אחד של זוג מלקחיים נאה.
  8. להעביר את העיניים ללא RNase microcentrifuge צינור סטרילי, הקפאה של חנקן נוזלי.
  9. חזור על ניתוח (שלבים 5.3-5.8) שכל אצווה של הגלמים. העברת כל אצווה של עיניים לתוך הצינור microcentrifuge אותו נשמרה בחנקן נוזלי (שלב 5.5) לצבור כל העיניים בצינור אחד.
  10. לאחסן את הדגימות ב-80 מעלות צלזיוס עד החילוץ-RNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

העין הגולמי היא רקמות נגיש בקלות המשמש כמודל מצוין לחקור תהליכים פיתוחיים מורפוגנזה כונן זה. כאן, יש פרקנו הרשתיות להשתמש immunofluorescence כדי לזהות את צמתי adherens הפסגה (איור 3 א, ג) או את קספאז Dcp-1 (איור 3D) הופעלה במהלך אפופטוזיס (איור 3)25. גישות אלה לאפשר אחד להתבונן בבירור תאים במהלך תהליכי morphogenetic מפתח כולל גיוס, מורפוגנזה התאים הראשי (מתוך 18 h APF), העיבור של סריג תאים סביב כל אחד ommatidium (18-24 h APF), הקמת נישה שלישוני (21-24 h APF), שינוי גודל התא, צורה (מתוך 18 h ש 40 APF), ואת אפופטוזיס (מ-18 ל ~ 33 h APF). העיתוי של אירועים morphogenetic אלה תלוית טמפרטורה, ולכן תשתנה בצניעות בתגובה הבדלים משניים בטמפרטורות חממה בהגדרות מעבדה שונות. עם זאת, על-ידי בסביבות 40 h APF ההסדר הסופי של תאים בדרך כלל מושגת (איור 3B, C), זה עידן אידיאלי אשר בו יש להעריך את ההשלכות של מוטציה גנטית או שונו ביטוי גנים. לדוגמה, הביטוי הבא חוץ רחמי של Diap1, מעכב הליבה של אפופטוזיס קספאז הפעלה (איור 3C)26, הגישה שלנו מאפשר לנו לכמת את הגדלת מספר התאים סריג בהשוואה פקד GMR הסוגר > lacZ רשתית. אחד יכול בקלות גם להעריך אפופטוזיס יותר ישירות על-ידי ניצול נוגדן anti-Dcp-1 או גישות אחרות כדי לזהות תאים גוסס (איור תלת-ממד).

עין lysate יכולה להיחקר באמצעות ניתוח המערבי כדי לקבוע את נוכחות ו/או ביטוי היחסי של חלבונים עניין. כאן, אנו מציגים את הגילוי של דה-קדהרין, מרכיב מרכזי צמתי adherens, בפראי סוג קנטון S הרשתיות גזור-h 21 ל-40 APF עיניים (איור 4A). כימות תספיג את הדגימה (נכון, איור 4A) גילה כי הביטוי היחסי של דה-קדהרין, לא להיות שונות מהותית בנקודות אלה שני הזמן-, כאשר הלהקה בעוצמה מנורמל לפי הביטוי של GAPDH (גרעין אנזים מטבולי). ניתוחים כאלה בדרך כלל יבוצע triplicate ולא רק פעם אחת, כמוצג כאן.

זה חיוני כדי לבודד mRNA טוהר גבוהה מן הרשתית הגולמי דרוזופילה אם מטרתך היא לנתח ביטוי גנים באמצעות יישומים מתקדמים רצף (למשל, הדור הבא, ה-RNA-seq). מצאנו כי לנתח עיניים יותר מ 60 לכל גנוטיפ או תנאי הניסוי הוא אופטימלי אם המטרה של אחד היא לבודד > 1 מ ג של RNA באיכות גבוהה (איור 4B). כאן, אנו מראים דוגמה ספקטרום ספיגת של דוגמה RNA מבודד 57 קנטון S פראי סוג עיניים, ביתר-40 h APF (איור 4B, החלונית העליונה). ספיגת שיא ב-260 nm מקביל אורך הגל ספיגת של RNA. אנו מציגים גם טבלה המשקף תשואה RNA ו A260/A280 A260/A230 יחסי טוהר של שש דגימות ה-RNA, התקבצו 21 h או 40 h APF. נתונים אלו משקפים את ההבדלים הדקים ב- RNA תשואות כאשר לחילוץ RNA.

Figure 1
איור 1 : מבחר והתרבות של הגלמים עבור ניתוח. (א) משוטט לחלל הזחל השלישי (L3) הזחלים, גלמי לאתר לאורך הצד של תרבויות דרוזופילה בריא. הגלמים מראש (B) ניתן לזהות באמצעות צבע לבן שקוף שלהם כפי פיגמנט טרם שיווצר במקרה הגולמי מגן. ציר קדמי-את ישבנה ואת הגבי הגחוני / של הגולם מוצגים בכחול. סד במבוק לח משמש כדי לסלק ולבחור הגלמים קדם מהקירות המבחנה. גלמי (C) ממוקמים בתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL כי לוחיות ההסבר כראוי (גנוטיפ, אוסף, השעה והתאריך של אוסף) (D) תרבותי בתוך תא humidified התכנסו from קופסת פיפטה ריק-טיפ. לחות מתוחזק על ידי הנחת פיסת רקמה לחה בתוך הקופסה.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : שנקלטה הגולמי. (א) הגלמים הם דבקו דבק דו צדדי שחור לנתח את המנה. קואורדינטות הקדמי, האחורי, הגבי מסומנים בכחול. (B) כדי לבודד את העין-מוח מתחמי (יחיד אחד מוצג כאן), (ג) הגולם מוסרת תחילה ממקרה הגולמי שלה. צעדים חשובים בתהליך זה מוצגים. קווים אדומים מציינים היכן לקרוע ולפתוח את התיק הגולמי לאחר operculum מוסר. הגלמים יוסרו ואז המקרה הגולמי קרוע עם מלקחיים. גולם (D) חשופה נחתך תחילה לאורך החזה עם מספריים microdissection (מיקום מסומן בקו תחתון אדום מקווקו), ראש האפיתל ואז בזהירות קרוע (חצים אדומים), כפי שמוצג (E) כדי לחשוף את המתחם אטום עין-מוח. (F) בעקבות הדגירה עם נוגדנים המתאימים, הרשתיות הן פרוסים מן העין-מוח תסביכים. צעדים חשובים בתהליך זה מוצגים. העין-המוח מיוצב עם מחט טונגסטן חסון (משמאל) והוציאו באדמומיות עם מחט בסדר טונגסטן (מימין). עבור חלבון וניתוחים RNA, מבולבל באדמומיות ניתן נקיה לחתוך מן האונות הראייה באמצעות תער בסדר או מספריים microdissection, במקום מחט טונגסטן בסדר.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Immunofluorescence של העין הגולמי. (א) נוגדנים דה-קדהרין תווית adherens הפסגה צמתים של תאים של העין הגולמי. כל התמונות בחלונית A כינס האזור המרכזי של הרשתית בעזרת מיקרוסקופיה קונפוקלית, ששינה מינימלית עם תוכנה לעיבוד תמונה, ואת מוצגים באותו הסולם (סולם בר = 5 מיקרומטר). הערה סידורם מחדש של תאים 18 h APF 27 ש APF וצמיחה. (B) קריקטורה של התצוגה הפסגה של יחיד בדוגמת באופן מלא ommatidium-40 h APF (משמאל), על ommatidium של חתך הרוחב. סוגי תאים ומסומנות בצבעים כמפורט במפתח. Photoreceptors קבור מתחת לפני השטח של neuroepithlium pseudostratified ומוקף חרוט ותאים פיגמנט. שלוש קבוצות זיפים מקיפים את כל ommatidium. (ג) אזורים קטנים של הרשתית בקרה אשר lacZ בא לידי ביטוי (משמאל) או Diap1 (מימין) כדי לעכב אפופטוזיס של תאי פיגמנט משניות ושלישוניות. תיוג של צמתי adherens עם אנטי-דה-קדהרין המאפשרת הניתוח של מספר הטלפון הנייד, סידור הצורה. תמונות נלכדו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רגיל. (ד) על הרשתית כולו מתפשט עם נוגדנים כדי להפעיל Dcp-1, קספאז מופעל במהלך אפופטוזיס, אשר שזיפים תאים רבים מן העין. התמונה צולמה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. קו מנוקד לבן מתאר העין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : ניתוח ביטוי חלבון לבין הגן של העין הגולמי. (א) תספיג חלבון (משמאל) של העיניים 28 גזור-21 h APF או 40 h APF, שנבדק עם נוגדנים כדי דה-cad, וכפי פקד הטעינה, GAPDH. ניתוחים של עוצמות הלהקה חלבון (מימין) מגלה ריכוזים דומים של דה-cad הנוכחי בקבוצות אלה של הרשתית, ביחס GAPDH. (B) ספקטרום ספיגת יחיד של דוגמה RNA שחולצו מן הרשתית קנטון S גזור-40 h APF (למעלה). הערה שיא ספיגת-260 ננומטר. שולחן המתעדים את יחס כמות וטוהר של RNA שחולצו מן הרשתית הגולמי קנטון S מבודד-h 21 ל-40 APF (למטה). נתונים אלה נובעים שלושה סטים מדגם עצמאית. הגלמים עבור כל ערכת דגימת היו מורמות מודגרות באותם התנאים, גזור באותו יום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה של ניתוח העין הגולמי דרוזופילה המתוארים כאן מאפשר הבידוד של 6 עד 10 מתחמי עין-מוח בתוך 10 עד 15 דקות. עם זאת, תרגול וסבלנות חיוניים על מנת לשלוט בטכניקה לנתיחה, לשפר את האיכות ואת המהירות של ניתוח. הפעם ניתוח קצר מבטיח בכל עין כ אותו התפתחותית הבמה, הפחתת השתנות בביטוי פנוטיפ או הגן של הרשתית בערכת נתונים. בעוד פרוטוקולים אלטרנטיבית עשויים לדרוש פחות התמחות להתמחות, פרוטוקול שלנו נועד באופן שיטתי לבודד רקמת רשתית עדינה תוך מזעור הסיכון של קריעה או הטיה, כי נזק לעין יכול לגרום מתח מסלול הפעלה או אפילו מוות של תאים. אנו מייעצים למתחילים האדון הראשון ניתוח הגלמים תרבותי 40 ש APF לפני ניסיון לנתח עיניים הצעיר. אנו ממליצים על הגדרת שכפול חוצה עבור כל הניסויים (שלב 1.1) אשר יבטיחו כי יש תמיד מספיק הגלמים זמין עבור אוסף (שלב 1.3). הרשתיות יכול ניסויים, במגוון timepoints במהלך הפיתוח הגולמי, בהתאם האירועים morphogenetic ברורים שבהם אתה מעוניין החוקר. אלה עשויים לכלול את הגיוס ואת מורפוגנזה של תאים הראשי (מתוך 18 h APF), העיבור של סריג תאים (18-24 h APF), הקמה של הגומחה שלישוני (21-24 h APF), שינויים תא בגודל וצורה (מתוך 18 h ש 40 APF), אפופטוזיס (מ-18 ל ~ 33 h APF) (איור 3 א).

אם במהלך פתיחה ראשונית של המקרה הגולמי (שלב 2.2, איור 2C), בית החזה של גולם נוקב, צריך החוקר עדיין תוכל להמשיך הקרע. עם זאת, אם הראש בתחילה נוקב, חילוץ עין-מוח תקינים מתחמי ייתכן שתתקשה. בעת הסרת גולם ממקרה הגולמי שלה (שלב 2.3, איור 2C, לוח נכון), המקרה הגולמי בטן יכול לפעמים מכך מהקלטת דו-צדדית ולהישאר גולש על הבטן של הגולם. . זה לא סביר מעצורים, למרות הגולם עשויים לצוף כאשר מוקף PBS עד הבטן, מצורף תיק הגולמי ושראשיהם הגולם (שלב 2.6). כדי לשמור על השלמות של רקמת רשתית, זה הכרחי כי הוא קבוע או קפוא מהר ככל האפשר לאחר הניקוב הראשונית של הגלמים. בנוסף, שימוש בפתרונות כקרח ושמירה על הרקמה על קרח (או ב 4 ° C) בכל מקום אפשרי ברחבי הפרוטוקול תשמר את רקמת ותקינות הסלולר, המוביל אל immunofluorescence יותר, חלבון-ניתוח או RNA-אנליזה. עבור היישומים האחרונים, חשוב להסיר את המוח כל ומזהמות רקמת שומן עיניים כמו רקמות אלו ניתוחים (שלב 2.9 ו 4.3 או 5.4).

המתחם הגולמי עין-מוח יכול לדבוק טיפים פיפטה ומקיאה, זכוכית, חיתוך כלים כאשר מבולבל או במהלך PBS שוטף/שטיפות, שמוביל נזק לרקמות. כדי למנוע זאת, אנו ממליצים על שימון קפדני של טיפים פיפטה, לא לשטוף כלים 9-ובכן זכוכית עם אתנול (סבון גם להימנע). במקום זאת, פשוט לנקות כלי הזכוכית עם מזוקקים H2O, לשמן, במידת הצורך, עם שטיפה PBT לפני השימוש. מלקחיים לנתיחה, מספריים, מחטים צריך גם בעיקר לנקות עם מזוקקים H2O, למעט בעת הכנת אלה רנ א-הפקת והניתוחים (שלב 5.1). עם זאת, אדהזיה אור בין הרשתית שקופיות מיקרוסקופ זכוכית יכול לסייע unfurling עיניים, והצב אותן בשקופיות בעת הפרדת העיניים מן הראייה אונות במהלך הרכבה (שלב 3.5.4 ו 3.5.5). באופן דומה, היצמדות אור עיניים שחור לנתח מנות יכול לשמש כדי לשטח וניתוחים מתיחה מאוד קלילה רקמת אשר מקלה על ניתוק נקי של חיבורים אופטיים העין האונה כאשר לבודד את הרשתיות חלבון או RNA (שלב 4.5 ו- 5.6). מצאנו כי microdissection מספריים או סכין גילוח משובחים הינם כלי מצוין ומהר קליב העיניים מבולבל מן הראייה אונות.

במהלך צביעת נוגדן ראשוני, ולא המקננת עין-מוח מתחמי במגשים 72-טוב מיקרו-טוב (שלב 3.3.5), צלחת זכוכית 9-ובכן במקום זאת ניתן להשתמש. כדי למנוע אידוי של הפתרון נוגדן למשך הלילה, הקפד קאפ הבארות צלחת זכוכית עם מכסה או שקופיות. עם זאת, גישה זו ידרוש 40-50 µL של נוגדן ראשוני פתרון עבור אצווה של 6-10 עין-מוח מתחמי מודגרות היטב אחד של מאכל זכוכית 9-ובכן, יותר מאשר 20 µL של פתרון נוגדן ראשוני מופץ בין 2 בארות של מגש מיקרו 72-טוב-טוב.

קיבוע המשני של מתחמי עין-מוח (שלב 3.4) לפני הרכבה עיניים על שקופיות מיקרוסקופ (שלב 3.5) שולית מתקשים הרקמה וכך קל יותר קליב העיניים מן הראייה אונות העיניים הן הסבירות לקפל או לדבוק לנתיחה מחטים. לאחר דגירה 1-2 h במדיום הרכבה (שלב 3.5.1), מתחמי עין-מוח להפוך כמעצמה ומכאן קל לראות בזמן גובר. בנוסף, לאחר 1-2 h הרכבה בינוני, רוב נוגדנים משניים יהיו כראוי מוגנים מפני צילום-הלבנת במהלך דימות פלורסנט. המקננת הרשתיות לילה בהרכבה מדיה לפני הרכבה לא מומלץ כי זה הופך את הרשתיות רך, שלילת האפקט stiffening של קיבעון משנית.

עבור ניתוחים המערבי, lysate לפחות 20 עיניים נדרש באופן אמין לזהות חלבונים באמצעות נוגדנים robustly מזהה דרוזופילה חלבונים (למשל, איור 4A). עם זאת, מספר גדול יותר של העיניים עשוי להידרש אם יש ביטוי נמוך של החלבון היעד עניין. אם פירוק של רקמת עבור סופג המערבי העוקבים הוא לא שלם (שלב 4.7), עוצמת הקול של WTLB הוסיף את הדגימה ניתן להגדיל שולית ונפח מדגם מרוכז מאגר בהתאם (שלב 4.9). לחילוץ RNA, חיתוך מהיר של מספר משמעותי של עיניים עשוי להידרש אם המטרה היא לבודד את כמות גדולה של RNA באיכות גבוהה (שלב 5.2, ראה איור 4B). חיסרון פוטנציאל זה ניתן להתגבר, אם שני מדענים אשר מומחה דרוזופילה הגולמי-עין לנתיחה לשתף פעולה כדי לנתח אלה מספרים גדולים של הרשתית לטוס בו זמנית. עם זאת, הסכום הכולל של RNA נדרש יהיה תלוי בדרישות של המוסד או מתקן ביצוע ניתוח RNA, הסוג של ניתוח RNA או רצף, ואת ערכת חילוץ RNA המשמש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים זאק תוף וסוקרים שלנו עבור הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי R15GM114729.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adobe Photoshop Adobe Image processing software
Bamboo splints, 6"  Ted Pella Inc 116
Beta mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Beta-glycerol phosphate Sigma-Aldrich 50020
Black dissecting dish Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder Fine Science Tools 10053
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets Roche 4693132001
Confocal microscope (Zeiss LSM 501) Carl Zeiss or similar microscope
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 40718
Double-sided tape 3M 665
Drosophila food media, nutrient-rich  7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila food media, standard Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe.  (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758
Fixative solution 4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) Leica Microsystems or similar microscope
Forceps  Fine Science Tools 91150-20 Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde Thermo Scientific 28908
Glass 9-well dishes  Corning 7220-85 Also known as 9-well dishes 
Glass coverslips (22 x 22 mm) Fisher Scientific 12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) Fisher Scientific 12-550-413
Glass petri dish Corning 3160-100BO
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Image Studio software version 5.2.5 LI-COR Biosciences Image processing software for quantitation of Western blots.
Laemmli sample buffer Bio-Rad 161-0737 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions.
Lane marker reducing sample buffer  ThermoFisher Scientific 39000 5X concentrated protein sample buffer.
Microcentrigure tubes  Axygen MCT-175-C
Microdissection scissors  Fine Science Tools 15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells) Nunc 438733
Mounting media 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate Sigma-Aldrich P3130
Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Sigma-Aldrich P5368 Prepare according to manufacturer's instructions
PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4.  
PBT 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder Fine Science Tools 26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH Imgenex IMG-3073 For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 Cell signaling 9578S For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad Developmental Studies Hybridoma Bank DCAD2 For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 DCAD1  Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit  Promega Z6110
Rnase decontamination reagent (RNase Away) Molecular BioProducts 7002
Scalpel blades Fine Science Tools 10050 Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated  donkey anti-rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 712-545-153 For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-165-144 For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) Cell Signaling Technology 7077 For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 305-035-003 For Western blotting. Used at 1:3000
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium Fluoride Sigma-Aldrich 215309
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 50860
Spectrophotometer (NanoDrop) ThermoFisher Scientific 2000c 
Stereo dissecting microscope (M60 or M80) Leica Microsystems or similar microscope
Sylgard (black) Dow Corning SYLG170
Sylgard (transparent) Dow Corning SYLG184 Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes KIMTECH 34120
TritonX Sigma-Aldrich T8787
Trizma hydrochloride pH7.5 Sigma-Aldrich T5941
Tungsten needle, fine Fine Science Tools 10130-10 Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy Fine Science Tools 10130-20 Insert into pin holder
WTLB (western tissue lysis buffer) 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution.
Yeast paste (local supermarket) Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
  2. Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
  3. Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
  4. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
  5. Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
  6. Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
  7. Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
  8. Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
  9. Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
  10. Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
  11. Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
  12. Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
  13. Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
  14. Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
  15. Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
  16. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
  17. Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
  18. Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
  19. Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
  20. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  22. Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
  23. Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
  24. Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
  25. Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
  26. Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 145 דרוזופילה גולם עין רשתית דיסקציה אימונוהיסטוכימיה לחומה המערבית החילוץ-RNA מיקרוסקופ
דיסקציה של הרשתית הגולמי <em>דרוזופילה</em> אימונוהיסטוכימיה, ניתוח המערבי של RNA בידוד
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeAngelis, M. W., Johnson, R. I.… More

DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. Exp. (145), e59299, doi:10.3791/59299 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter