Summary
Detta dokument presenterar en kirurgisk metod för dissekera Drosophila Pupp näthinnor tillsammans med protokollen för bearbetning av vävnad för immunohistokemi, västra analys och RNA-extraktion.
Abstract
Drosophila Pupp näthinnan ger en utmärkt modellsystem för att studera morphogenetic processer under utveckling. I detta papper presentera vi ett pålitligt protokoll för dissektion av delikat Drosophila Pupp näthinnan. Våra kirurgisk metod använder lätt-tillgängligt lokalt verktyg för att öppna puppor och just extrahera öga-hjärna komplex. Dessa kan fastställas, utsätts för immunohistokemi och näthinnor sedan monterade på objektglas och avbildas om målet är att upptäcka cellular eller subcellulära strukturer. Alternativt, ofixerade näthinnor kan isoleras från hjärnvävnaden, lyserat i lämpliga buffertar och utnyttjas för protein gel elektrofores eller mRNA utvinning (att bedöma protein eller gen uttryck, respektive). Betydande övning och tålamod kan behöva behärska lokalt protokollet beskrivs, men när behärskar, protokollet kan relativt snabbt isolering av främst oskadade näthinnor.
Introduction
Drosophila näthinnan består av cirka 750 ommatidia omgiven av pigmentceller ordnade i en bikakestruktur galler1,2,3,4. Varje ommatidium innehåller åtta ljusmätare nervceller, fyra objektiv utsöndrar kon celler och två primära pigmentceller. Kring varje ommatidium är pigment-celler galler och sensoriska borst grupper. På grund av dess efter mitotiska natur och stereotypa sexkantiga arrangemang ger Drosophila Pupp näthinnan en utmärkt modell för att studera morphogenetic processer inklusive cell adhesion5,6, 7,8,9,10 och apoptos11,12,13,14,15.
Flera publicerade protokoll utnyttja lufttrycket att extrahera öga-hjärna komplex från Drosophila puppor16,17,18. Protokollet beskrivs istället använder här lokalt verktyg att noggrant och isolera exakt öga-hjärna komplex med målet att erhålla oskadade retinala vävnaden. Detta är avgörande om näthinnor är för att utnyttjas för morfologiska, protein eller genuttrycket analyseras eftersom skador på näthinnor kan resultera i cellulär stress eller döden, som kunde ändra det cellulära fenotyp eller gen uttrycket. Dessutom, efter träningen, kan 6 till 10 öga-hjärna komplex isoleras i 10 till 15 min, underlätta målet att minimera variabiliteten i ålder och utvecklingsfas dissekerade ögat vävnad.
Den fixering, immunfärgning och hela-mount-protokollet som beskrivs nedan är lämplig för utarbetandet av Drosophila ögon för fluorescerande mikroskopi. Näthinnor kan inkuberas med antikroppar riktade proteiner av intresse. Antikroppar mot adherens junction komponenter kan exempelvis utnyttjas för att visualisera de apikala omkretsar celler så att egenskaper inklusive celltyp, form och arrangemang kan vara bedömda19. Före fixering, kan ögon istället vara klyvs från hjärnan i syfte att utvinna protein för västra analys eller RNA för användning i qRT-PCR eller RNA-sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. vävnad förberedelse
- Ställ in Drosophila korsar (som beskrivs tidigare20) eller kultur specifika Drosophila stammar för att erhålla puppor av önskad genotyp. Att se till att ett stort antal puppor framträder tillfällighet, fastställa dessa flyga kulturer i två exemplar på näringsrika mat media eller standard mat media generöst kompletteras med jäst-pasta.
- Upprätthålla Drosophila kulturer vid 25 ° C. För kors utnyttja UAS-GAL4 systemet, är GMR-GAL4 en idealisk drivrutin uttryckt i larval ögat skiva celler bakre till morphogenetic fåran och hela Pupp utveckling21,22,23, 24. den arga UAS-Lindholm X GMR-GAL4 tjänar som en perfekt kontroll över som driver uttryck av proteinet icke-endogen och inert β-galaktosidas.
- Använd spetsen på en bambu skena 6 ”som har varit blöt med destillerat vatten för att försiktigt lyfta vit före puppor (figur 1B) från sidan av hälsosam kultur injektionsflaskor (figur 1A) och placera i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör (figur 1 c).
- Placera rören i en plast pipett tip låda tillsammans med en liten bit vävnad indränkt i destillerat vatten för att upprätthålla kammaren vid tillräcklig fuktighet att skydda puppor från uttorkning (figur 1 d). Inkubera i puppor vid 25 ° C tills dissektion.
- Använd en torr 6 ”bambu skena att försiktigt pressa puppor ut ur mikrocentrifug rör och på en svart dissekera maträtt. Låg en färsk bit dubbelhäftande tejp på dissekera skålen från puppor.
- Använder ett par pincett, placera försiktigt puppor ryggsidan upp (dvs. operculums uppåt, figur 1B) på bandet (figur 2A). Se till att puppor följer väl tejpen.
Obs: Fukt på Pupp fallet kommer att hämma säker vidhäftning till bandet, i vilket fall, tillåta de puppor lufttorka innan du placerar på den dubbelhäftande tejpen.
2. dissektion av öga-hjärna komplex
- Använd tången för att avlägsna operculum av varje puppa (figur 2 c).
- Använd lokalt sax till skiva eller uppskuren Pupp fallet av varje puppa. FLAP öppna Pupp fallet att avslöja den huvud, bröstkorg och främre abdominal-segmentet, säkra kanterna på Pupp fallet att den dubbelhäftande tejpen (figur 2 c).
Obs: Det är inte nödvändigt att helt avslöja puppor. - Hål i buken av varje puppa med vass pincett, att förstå djuret, och ta bort den från sitt Pupp fall (figur 2 c).
- Placera puppor på svart dissektion skålen, från bandet, och täck med ca 400 µL iskall fosfat-buffrat-lösning (PBS, pH 7,4).
- Förstå varje puppa av buken med pincett, och med lokalt sax, göra en ren tvärsnittsdata skär genom hela bröstkorgen, skära puppan i hälften (figur 2D).
- Ta bort bakre kvarlevan av varje slaktkropp från PBS och lägga åt sidan på dissekera skålen (inte kassera, se steg 3.2.1).
- Använda två par fina pincett, öppna bröstkorgen och chef för varje puppa att avslöja öga-hjärna komplexet (figur 2E). För att göra detta, ta tag cut-kanterna av thorax epitel och gradvis riva öppna bröstkorgen och sedan bege kapsel, utsätta öga-hjärna komplexa och omgivande fettvävnad.
- Utan greppa vävnaden, använda pincett styra öga-hjärna anläggningen från resterna av huvudet kapseln eller skopa öga-hjärna anläggningen från sönderriven-öppna huvudet kapseln.
Obs: Öga-hjärna komplexet är hantel-formade, benvitt och mer genomskinlig än det omgivande gräddvit feta (figur 2B, E). - Med pincett, och ta försiktigt bort de flesta fett associerade med öga-hjärna komplexen utan att röra ögat vävnad.
3. bearbetningen av vävnad för immunofluorescens
- Dissekera minst 6-10 puppor som beskrivs (steg 2.1-2.9).
Obs: Tre till fyra oberoende replikat för varje dissektion tenderar att ge tillräckliga data för att testa en hypotes. -
Tvätt och fixering
- Skära i spetsen av en P20 eller P100 pipettspetsen med en ren rakblad att öka tip-öppningen till ~ 1 mm i radie och Smörj av pipettering en blandning av PBS och fett upp och ner. Detta fett kan erhållas från kadavret resterna tog bort i steg 2,6.
- Över de öga-hjärn-komplex till ~ 400 µL av PBS i en 9-väl glas skålen, på is. Använda den smorda spetsen och en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett för att överföra.
Obs: Öga-hjärna komplex kommer att följa unlubricated tips under pipettering och skadas eller förloras. - Ta bort återstående fettet samband med ögat vävnad genom pipettering PBS upp och ner för att snurra försiktigt de öga-hjärn-komplex. I detta och alla efterföljande tvättning Pipettera steg, direkt inte öga-hjärna komplex upp och ner eftersom det kommer att skada den bräckliga ögonvävnaden.
- Överföra de öga-hjärn-komplex i en minimal volym (< 20 µL) PBS in minst 250 µL av fixativ. Blanda genom pipettering lösningen upp och ner. Inkubera i 35 min, på is.
Obs: Samma smorda tips bereddes i steg 3.1.1 kan användas för denna överföring. - Med samma pipettspetsen, överföra de öga-hjärn-komplex i en väl innehållande ~ 400 µL av PBS. Blanda genom pipettering lösningen upp och ner och inkubera i 5-10 min på isen, att tvätta. Upprepa tvätt minst två gånger.
Obs: Öga-hjärna komplex kan bibehållas i flera timmar i den slutliga PBS tvätten, på isen eller på 4 ° C, innan du fortsätter till steg 3.3.1.
-
Antikropp färgning
- För att blockera vävnaden före exponering för antikropp lösningar, överföra öga-hjärna komplexen till ~ 400 µL av PBT. Använda den smorda spetsen och en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett för överföringen. Inkubera i 10 till 60 min, på is.
- Bered den primär antikropp genom att späda ut lämpliga antikroppar i PBT. Eftersom öga-hjärna komplex inkuberas i 10 µL portioner av antikropp lösning, blir volymen beredd testmetod för 10.
- Alikvotens 10 µL antikropp lösning i en blandningskopp en 72-väl mikrobrunn bricka (se diskussion).
- Skär spetsen av en P10 pipettspetsen med en ren rakblad att öka tip-öppnandet ~0.5 mm i radie och Smörj av pipettering PBT upp och ner.
- Överföra mer än 5 öga-hjärna-komplex, i en volym av < 3 µL av PBS, i varje 10 µL väl antikropp-lösning med en P10 luft deplacement mikropipett och smorda spetsen.
- Homogenisera antikropp lösningen genom pipettering lösningen upp och ner. Pipettera inte öga-hjärna komplexen upp och ner eftersom det kommer att skada vävnaden.
- För att minimera avdunstning av antikropp lösningen, placera en liten bit vävnad indränkt i destillerat vatten i mikrobrunn facket och försegla facket (t.ex. med locket som tillhandahålls). Inkubera över natten vid 4 ° C.
- Över de öga-hjärn-komplex från mikrobrunn facket till ~ 400 µL av PBT i en 9-vällde glas maträtt, att tvätta. Använd en P10 luft deplacement mikropipett och PBT-smörjas tip (Förbered enligt steg 3.3.4). Blanda genom pipettering lösningen upp och ner. Inkubera i 5-10 min på is.
- Upprepa tvätt minst två gånger. Använd en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och PBT-smörjas tips för att överföra de öga-hjärn-komplex mellan tvätta lösningar.
- Bered den sekundära antikroppar genom att späda ut lämpliga fluorophore-taggade sekundära antikroppar i PBT som krävs. 100 µL av sekundär antikropp lösning räcker per omgång 6-10 puppor. Alikvot sekundär antikropp lösningen till en 9-vällde glasskål dissektion.
- Över de öga-hjärn-komplex till sekundär antikropp lösning. Använd en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och PBT-smörjas tips för överföring.
- Inkubera öga-hjärna komplexen i sekundär antikropp lösning för 1-2 h i rumstemperatur, eller 3-5 h vid 4 ° C. För att förhindra blekning av fluorophores av ljus, täcka preparationen med folie.
Obs: Optimal löptid inkubation i sekundär antikropp lösning kan variera enligt de primära och sekundära antikroppar används. - Över de öga-hjärn-komplex till ~ 400 µL av PBT i en 9-väl glas maträtt, att tvätta. Blanda genom pipettering lösningen upp och ner. Inkubera i 5-10 min på is. Denna tvätt steg bör upprepas minst två gånger.
-
Sekundära fixering
- För en sekundär fixering, överföra öga-hjärna komplexen till minst 200 µL av fixativ och inkubera i 20 min i rumstemperatur eller 35 min vid 4 ° C.
Obs: Sekundära fixering stelnar ögat vävnaden, vilket underlättar montering (steg 3.5). - Använd en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och PBT-smörjas tips för att överföra öga-hjärna komplex i ~ 400 µL av PBT i en 9-väl glas skålen, på isen, att tvätta för 5 min.
- Upprepa tvätta minst en gång.
- Använd en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och PBT-smörjas tip överföra öga-hjärna komplexen i ~ 400 µL av PBS i en 9-väl glas skålen, på isen, att skölja för 1-2 min. hålla vävnaden i rörelse genom pipettering PBS, men inte vävnaden , upp och ner för att förhindra att öga-hjärna komplex från avgörandet och följa glas skålen under PBS-skölj.
- För en sekundär fixering, överföra öga-hjärna komplexen till minst 200 µL av fixativ och inkubera i 20 min i rumstemperatur eller 35 min vid 4 ° C.
-
Montering
- Över de öga-hjärn-komplex till ~ 200 µL montering media. Använd en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och PBT-smörjas tips för att överföra de öga-hjärn-komplex. Att vävnaden temperera i montering media för 1-2 h.
- Placera en droppe 5-8 µL färska montering media på ett rent objektglas.
- Skär en P10 spets med en ren rakblad att öka tip-öppnandet ~0.5 mm i radie och använda detta och en P10 luft deplacement mikropipett för att överföra öga-hjärna komplexen i 5-8 µL montering media i släpp av montering media i bilden.
- Använd två volfram nålar för att separera ögonen från optic lober. Fästa ett öga-hjärna-komplex till bilden med en robust volfram nål och skiva varje öga bort från dess associerade optic LOB med en fin volfram nål (figur 2F).
- Använd fina volfram nålen för att manövrera varje öga på ytan av objektglas med basala ytan på varje öga i anslutning till bilden. Försiktigt sänka en ren täckglas över vävnaden och säkra med nagellack.
Obs: Arrangera ögonen på bilden så att de är nära varandra eller i en rad kommer att underlätta efterföljande mikroskopi. - Bild av näthinnor med fluorescerande eller confocal microscopy.
Obs: Bilderna ska lagras vid 4 ° C om det inte avbildas omedelbart.
4. beredning av ögat vävnad för Western Blotting:
- Dissekera 10-16 puppor (steg 2.1-2.9) med följande ändringar: (a) samla och dissekera puppor i två omgångar, 10-15 min apart och b) dissekera i PBS kompletteras med proteas och fosfatas-hämmare (PBS + pi).
- Överföra de öga-hjärn-komplex som använder en P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och smorda tip (tillagad som steg 3.2.1) till ~ 400 µL av PBS + pi i en 9-väl glas skålen, på is, för att skölja kort.
Obs: Denna smorda tips kan användas för efterföljande stegen 4.3 och 4.4. - Upprepa steget skölj två gånger.
- Över alla öga-hjärna komplex till ~ 400 µL av is kallt PBS + pi xylenet på en ren svart dissekera maträtt.
- Ta bort varje öga från optic loberna med en robust volfram nål (för att stadig öga-hjärna komplexet) och en fin rakblad eller lokalt saxar till klockrent klipp varje öga från den optiska loben.
Obs: Ögon är ”klibbiga” i detta skede och kan lätt följa dissekera skålen. Detta är fördelaktigt eftersom det kan bidra till att underlätta avlägsnande av ögonen från optic loberna (se diskussion). - 'Sopa' alla ögon i en 'hög' i PBS + pi på dissekera skålen, med hjälp av ett blad av en fin par pincett.
- Skär en P10 spets med en ren rakblad att vidga tip-öppnandet ~0.5 mm i radie och Smörj tip-interiören av pipettering Western vävnad Lysis buffert (WTLB) upp och ner.
- Överföra öga-hjärna komplexen i 5 µL av PBS + pi i ett 500 µL mikrocentrifug rör. Använd denna smorda spets och en P10 luft deplacement mikropipett för att slutföra överföringen.
- Placera mikrocentrifug röret på is. Tillsätt 1 volym (5 µL) WTLB till provet, och 10 µL 2 x koncentrerat protein prov buffert (eller 2,5 µL 5 x koncentrerat protein prov buffert). Blanda genom att trycka på.
- Vortex i mikrocentrifug rör kort och snurra ner prov med hjälp av en stationär mini centrifug.
- Förvara provet vid-20 ° C fram till analys. Analysera med hjälp av standardprotokoll.
5. beredning av ögat vävnad för RNA-extraktion:
- Bär handskar, ren bänkmonterade, Mikroskop, dissektion verktyg och svart dissekera maträtt först med 70% etanol och sedan RNase sanering reagens. Låt torka.
- Dissekera 30-40 puppor som beskrivs (steg 2.1-2.9) med följande ändringar: en) samla och dissekera 6 till 8 puppor i omgångar, 15-20 min isär; (b) dissekera nuclease-fri PBS och c) isolera varje tillverkningssats av ögonen separat men samlas alla retinala vävnaden till samma mikrocentrifug rör (steg 5,5).
Obs: Att ha två personer dissekera samtidigt kommer att påskynda effektiv isolering av bra ögonvävnaden. - För varje parti, isolera öga-hjärna komplex (steg 2.1-2.9) och överföring till ~ 400 µL nuclease-fri PBS i en 9-väl glas maträtt att skölja kort, på isen, med ett P20 eller P100 luft deplacement mikropipett och smorda tip (beredd enligt steg 3.1.2).
Obs: Denna smorda tips kan användas för efterföljande stegen 5.4, 5.5 och 5,8. - Upprepa steget skölj två gånger.
- Över de öga-hjärn-komplex till en färsk 400 µL droppe iskall nuclease-fri PBS på en ren svart dissekera maträtt.
- Ta bort varje öga från optic loberna med en robust volfram nål (för att stadig ögat hjärnan komplexa) och en fin rakblad eller lokalt saxar till klockrent klipp varje öga från den optiska loben.
Obs: Ögon är ”klibbiga” i detta skede och kan lätt följa dissekera skålen. Detta är fördelaktigt eftersom det kan bidra till att underlätta avlägsnande av ögonen från optic loberna (se diskussion). - 'Sopa' alla ögon i en 'hög' i den nuclease-fri PBS på dissekera skålen, med hjälp av ett blad av en fin par pincett.
- Överföra ögonen till ett sterilt RNase-fri mikrocentrifug rör och flash-frysa i flytande kväve.
- Upprepa dissektion (steg 5.3-5.8) på varje tillverkningssats av puppor. Över varje omgång ögon till samma mikrocentrifug rör som har bibehållits i flytande kväve (steg 5,5) att samla alla ögon i en tub.
- Lagra proverna vid-80 ° C tills RNA-extraktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pupp ögat är en lättillgänglig vävnad som fungerar som en utmärkt modell att undersöka utvecklingsprocesser att driva morfogenes. Här har vi dissekerade näthinnor och används immunofluorescens för att upptäcka de apikala adherens föreningspunkterna (figur 3A, C) eller de Dcp-1 kaspas (figur 3D) som aktiveras under apoptos (figur 3)25. Dessa tillvägagångssätt tillåter en att tydligt iaktta celler under morphogenetic nyckelprocesser inklusive rekrytering och morfogenes av primära celler (från 18 h APF), interkalation av galler celler runt varje ommatidium (18-24 h APF), inrättandet av den tertiär nisch (21-24 h APF), förändringar i Cellstorlek och form (mellan 18 40 h APF) och apoptos (från 18 till ~ 33 h APF). Tidpunkten för händelserna morphogenetic är temperaturberoende och varierar därför blygsamt svar på mindre skillnader i inkubatorn temperaturer i olika laboratoriemiljö. Dock av runt 40 h APF, det slutliga arrangemanget av celler är vanligtvis uppnås (figur 3B, C) och detta är en perfekt ålder att bedöma konsekvenserna av genetisk mutation eller ändrat genuttryck. Exempelvis gör följande ektopisk uttryck av Diap1, en core hämmare av apoptos kaspas aktivering (figur 3 c)26, vårt tillvägagångssätt att man kan kvantifiera den påföljande ökningen av antalet galler celler jämfört med en kontroll GMR > Lindholm näthinnan. Man kan också enkelt bedöma apoptos mer direkt genom att utnyttja den anti-Dcp-1 antikroppen eller andra metoder att upptäcka döende celler (figur 3D).
Ögat lysate kan förhöras använder västra analys för att bestämma den närvaro och/eller relativa uttrycket av proteiner av intresse. Här visar vi upptäckt av DE-cadherin, kärnan i adherens föreningspunkter, i vildtyp Canton S näthinnor dissekerade vid 21 och 40 h APF ögon (figur 4A). Kvantifiering av detta prov Western blot (höger, figur 4A) visade att det relativa uttrycket för DE-Cadherin, skiljer inte sig väsentligt på dessa två tidpunkter, när bandet intensitet är normaliserat enligt uttryck för GAPDH (en kärna metabola enzym). Sådana analyser skulle brukar utföras i tre exemplar i stället för bara en gång, som visas här.
Det är viktigt att isolera högrena mRNA från Drosophila Pupp näthinnor om ens mål är att analysera genuttryck som använder avancerade sekvensering program (t.ex. Nästa-Gen, RNA-seq). Vi har funnit att dissekera mer än 60 ögon per genotyp eller experimentella villkor är optimal om ens mål är att isolera > 1 mg av hög kvalitet RNA (figur 4B). Här visar vi ett exempel på en absorbans spektra av en RNA-prov som isolerats från 57 vildtyp Canton S ögon, dissekeras på 40 h APF (figur 4B, övre panelen). Topp absorbansen vid 260 nm motsvarar absorbansen våglängden av RNA. Vi presenterar också en tabell som återspeglar den RNA avkastning och A260/A280 och A260/A230 renhet nyckeltal av sex RNA-prover, samlades på antingen 21 h eller 40 h APF. Dessa data speglar subtila skillnader i RNA ge när extrahera RNA.
Figur 1 : Urval och kultur av puppor för dissektion. (A) vandrande tredje larval instar (L3) larver och puppor leta upp längs sidorna av friska Drosophila kulturer. (B) pre puppor kan identifieras av deras genomskinlig vit färg som pigment har ännu att genereras i skyddande Pupp fall. Anterior-posterior och dorsal-ventrala axel puppa visas i blått. Bettskena fuktig bambu används för att få bort och plocka före puppor från injektionsflaskan väggarna. (C) puppor är placerade inuti 1,5 mL mikrocentrifugrör som är märkta på rätt sätt (genotyp, datumet för insamlingen, och tid för samling) och (D) odlade insidan en befuktade kammare monteras från en tom pipett-tip-box. Luftfuktighet upprätthålls genom att placera en bit fuktig vävnad inne i lådan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Dissekera Pupp ögat. (A) puppor följs dubbelhäftande tejp på en svart dissekera maträtt. Främre, bakre och dorsala koordinater anges i blått. (B) för att isolera öga-hjärna komplex (en enda en visas här), (C), puppan avlägsnas först från fodralet Pupp. Viktiga steg i denna process visas. Röda linjer visar var att riva och öppna Pupp fallet efter operculum avlägsnas. Puppor tas då bort från trasiga Pupp fallet med pincett. (D) en exponerade pupa skärs först längs bröstkorgen med lokalt sax (position anges med streckad röd linje) och huvudet epitelet sedan noggrant sönderrivet öppen (Röda pilar), som visas i (E) för att avslöja komplexet ogenomskinlig öga-hjärna. (F) efter inkubation med lämpliga antikroppar, näthinnor skivas från öga-hjärna komplex. Viktiga steg i denna process visas. Ögat-hjärnan är stabiliserad med en robust volfram-nål (vänster) och näthinnor bort med en fin volfram nål (höger). För protein och RNA analyser, ofixerade näthinnor kan skäras renlig från optic lober med en fin rakblad eller lokalt sax, snarare än en fin volfram nål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Immunofluorescens Pupp ögats. (A) antikroppar mot DE-cadherin etikett apikala adherens föreningspunkter av celler av Pupp ögat. Alla bilder i panel A samlades i de centrala delarna av en näthinna som använder konfokalmikroskopi, minimalt modifierad med en programvara bildbehandling, och presenteras på samma skala (skalstapeln = 5 µm). Observera tillväxt och omflyttning av celler från 18 h APF till 27 h APF. (B) tecknad av apikala beskådar av en enda fullt mönstrad ommatidium på 40 h APF (vänster) och en ommatidium i tvärsnitt. Celltyper är färgkodade som anges i nyckeln. Fotoreceptorer är begravd under ytan av den pseudostratified neuroepithlium och omgiven av konen och pigmentceller. Tre borst grupper omger varje ommatidium. (C) små regioner i en kontroll näthinnan i vilken Lindholm uttrycktes (vänster) eller Diap1 (höger) som hämmar apoptos av sekundära och tertiära pigmentceller. Märkning av adherens föreningspunkter med anti-DE-cadherin möjliggör analys av antalet celler, arrangemang och form. Bilder fångades med standard fluorescerande mikroskopi. (D) en hela näthinnan inkuberas med antikroppar mot aktiverat Dcp-1, en kaspas aktiveras under apoptos, som katrinplommon många celler från ögat. Bilden togs med konfokalmikroskopi. Vita streckade linjen beskrivs ögat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Protein och gen uttryck analyser av Pupp ögat. (A) Western blot (vänster) av 28 ögon dissekeras på 21 h APF eller 40 h APF, utforskad med antikroppar till de cad och, som lastning kontroll, GAPDH. Analyser av protein band stödnivåer (höger) avslöjar jämförbara koncentrationer av de cad närvarande i dessa grupper av näthinnor, i förhållande till GAPDH. (B) enda absorbansen spektrum av en RNA-prov som utvinns från Canton S näthinnor dissekerade på 40 h APF (överst). Obs absorbansen peak på 260 nm. Tabell dokumentera beloppet och renhet nyckeltalen RNA extraherade från Canton S Pupp näthinnor isolerad på 21 och 40 h APF (nederst). Uppgifterna härrör från tre oberoende provningssatser. Puppor för varje prov var uppvuxen och inkuberas under samma förhållanden och dissekerade samma dag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila Pupp ögat dissektion beskrivs här tillåter för isolering av 6 till 10 öga-hjärna komplex inom 10-15 min. Men är tålamod och praxis avgörande för att behärska tekniken dissektion och förbättra kvalitet och hastighet dissektioner. Denna korta dissektion tid säkerställer att varje öga är ungefär samma utvecklingsstadiet, minska variationen i fenotyp eller gen uttrycket av näthinnor i en datauppsättning. Samtidigt som alternativa protokoll kan kräva mindre praxis att bemästra, är vår protokollet utformat för att metodiskt isolera delikat näthinnevävnad samtidigt minimerar risken att riva eller klippning, eftersom skador på ögat kan framkalla stress väg aktivering eller ens celldöd. Vi rekommenderar nybörjare att första master dissektion av puppor odlade till 40 h APF innan du försöker dissekera yngre ögon. Vi rekommenderar att ställa in replikera korsar för alla experiment (steg 1.1) som kommer att säkerställa att det finns alltid tillräckligt puppor för samling (steg 1.3). Näthinnor kan vara dissekerade vid olika tidpunkter under Pupp utveckling, beroende på de separata morphogenetic händelserna av intresse för forskaren. Dessa kan innefatta rekrytering och morfogenes av primära celler (från 18 h APF), interkalation av galler celler (18-24 h APF), inrättandet av den tertiary nischen (21-24 h APF), förändringar i Cellstorlek och form (mellan 18 40 h APF) och apoptos (från 18 till ~ 33 h APF) (Figur 3A).
Om under första öppnandet av Pupp fallet (steg 2.2, figur 2 c), punkteras bröstkorgen av en puppa, bör forskaren fortfarande kunna gå vidare med dissektion. Dock om huvudet initialt punkteras, kan extrahera oskadat öga-hjärna komplex vara svårt. När du tar bort en puppa från fodralet Pupp (steg 2,3, figur 2 c, högra panelen), kan buk Pupp fallet ibland lossnar från den dubbelhäftande tejpen och förbli förpackade om puppans buken. Detta är osannolikt ett hinder, även om puppan kan flyta när omgiven av PBS tills buken och fäst Pupp fall undertrckande från puppan (steg 2,6). För att bevara integriteten för retinala vävnaden, är det absolut nödvändigt att det är fast eller frysas så snabbt som möjligt efter första punkteringen av puppor. Dessutom med iskall solutions och underhålla vävnaden på is (eller vid 4 ° C) varhelst möjligt i hela protokollet kommer att bevara vävnad och cellulär integritet, vilket leder till bättre immunofluorescens, protein-analys eller RNA-analys. För de sistnämnda program, är det viktigt att ta bort alla hjärnan och fettvävnad från ögon som dessa vävnader kommer att kontaminera analyser (steg 2,9 och 4.3 eller 5.4).
Pupp öga-hjärna komplexet kan följa unlubricated pipettspetsar, glas och dissektion verktyg när orättade eller under PBS tvättar/sköljningar, vilket leder till vävnadsskada. För att förhindra detta, rekommenderar vi noggranna smörjning av pipettspetsar och inte diska 9-väl glas med etanol (diskmedel bör också undvikas). I stället helt enkelt Rengör glas rätter med destillerat H2O och Smörj, om det behövs, med en PBT sköljning före användning. Dissektion pincetter, saxar och nålar också rengörs främst med destillerat H2O, utom när du förbereder dessa för RNA-extraktion dissektioner (steg 5.1). Dock kan lätt vidhäftning mellan näthinnor och glas objektglas hjälpa unfurling ögon och placera dem på bilder när separera ögon från optic lober under montering (steg 3.5.4 och 3.5.5). Likaså, ljus vidhäftning av ögon till svart dissekera rätter kan användas att platta och mycket lätt stretch vävnaden vilket underlättar ren severing av ögat-optic LOB anslutningar när isolera näthinnor för protein eller RNA analyseras (steg 4,5 och 5,6). Vi har funnit att lokalt sax eller en fin rakblad är utmärkta verktyg för att snabbt och rent klyva ofixerade ögon från optic lober.
Under primär antikropp färgning, snarare än ruvning öga-hjärna komplex i 72-väl mikro-väl fack (steg 3.3.5), kan en 9-väl glasskål istället användas. För att förhindra avdunstning av antikropp lösning över natten, gärna mössa glas skålen brunnarna med täckglas eller bild. Detta tillvägagångssätt kräver dock kommer 40-50 µL av primär antikropp lösning för en batch med 6-10 öga-hjärna komplex inkuberas i en väl 9-väl glas maträtt, i stället för 20 µL av primär antikropp lösning fördelade mellan 2 brunnar i en 72-väl mikro-bra bricka.
Sekundära fixering av öga-hjärna komplex (steg 3,4) före montering ögon på objektglas (steg 3.5) kommer marginellt stelna vävnaden så att det är lättare att klyva ögonen från optic lober och ögonen är mindre benägna att vika eller följa dissektion nålar. Efter en 1-2 h inkubation i monteringsmedium (steg 3.5.1) blir öga-hjärna komplexen svagt ogenomskinlig och därmed lättare att se medan montering. Dessutom efter 1-2 h i monteringsmedium, kommer de flesta sekundära antikroppar lämpligt sätt skyddas från foto-blekning under fluorescerande imaging. Ruvning näthinnor övernattning i montering media innan montering inte rekommenderas eftersom detta gör näthinnor mjuk, förneka stelna effekten av sekundära fixering.
För västra analyser krävs den lysate minst 20 ögon att tillförlitligt detektera proteiner med hjälp av antikroppar som kraftfullt igen Drosophila proteiner (t.ex. figur 4A). Ett större antal ögon kan dock krävas om det finns lågt uttryck av Målproteinet sevärdheter. Om Lys av vävnad för efterföljande Western blotting är ofullständig (steg 4.7), volymen av WTLB tillsätts provet kan ökas marginellt och volymen av koncentrerad prov bufferten justeras därefter (steg 4,9). För RNA-extraktion, snabb dissektion av ett betydande antal ögon kan krävas om målet är att isolera en stor mängd högkvalitativa RNA (steg 5.2, se figur 4B). Denna potentiella nackdel kan övervinnas om två forskare som har bemästrat Drosophila Pupp-eye dissektion samarbetar för att dissekera dessa stort antal flyga näthinnor samtidigt. Men, den totala mängden RNA som krävs beror på kraven i den institution eller anläggning utför RNA analys, vilken typ av RNA-analys eller sekvensering, och RNA extraktion kit som används.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Zack trumma och våra granskare för hjälpsamma kommentarer på manuskriptet. Detta arbete stöds av R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
