Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부
Summary
이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.
Abstract
초파리 번데기 망막 개발 하는 동안 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공합니다. 이 종이에 선물이 섬세 한 초파리 번데기 망막의 해 부에 대 한 신뢰할 수 있는 프로토콜. 외과 접근 pupae를 열고 정확 하 게 추출 눈 두뇌 단지를 쉽게 사용할 수 서 도구를 활용 합니다. 이러한 수 고정, 들어서는 immunohistochemistry, 망막에 다음 현미경 슬라이드에 장착 되며 목표 세포 또는 subcellular 구조를 감지 하는 경우를 몇 군데. 또는, 떼어낸된 망막 뇌 조직에서 분리, 적절 한 버퍼에 lysed 고 단백질 젤 전기 이동 법 또는 mRNA 추출 (각각 단백질 또는 유전자 식 평가)에 대 한 활용. 상당한 연습과 인내심, 기정 프로토콜을 마스터 해야 할 수 있습니다 하지만 일단 마스터, 프로토콜 수 주로 손상된 망막의 상대적으로 빠른 절연 있습니다.
Introduction
초파리 망막 색소 세포 벌집 격자1,2,,34배열에 의해 포위 하는 약 750 ommatidia 구성 됩니다. 각 ommatidium 8 포토 리셉터 신경, 4 렌즈 은닉 원추 세포, 그리고 두 가지 기본 안료 세포에 포함 되어 있습니다. 각 ommatidium를 주변 안료 생산 격자 세포와 감각 강 모 그룹 있습니다. 포스트 mitotic 자연 및 틀에 박힌 6 각형 배열, 초파리 번데기 망막 세포 접착5,6,를 포함 하 여 전체적 프로세스의 연구에 대 한 우수한 모델 시스템을 제공 7,8,9,10 및 apoptosis11,12,13,,1415.
여러 게시 프로토콜 초파리 번데기16,,1718에서 눈 뇌 단지 추출 공기 압력을 이용 한다. 프로토콜 설명 여기 대신 활용 하 서 도구를 신중 하 고 정확 하 게 격리 눈-뇌 손상된 망막 조직을 얻기의 목적으로 단지. 이것은 망막에 대 한 활용 하는 경우 중요 한 형태학, 단백질, 또는 유전자 발현 분석 때문에 망막 손상 세포 스트레스 또는 죽음, 세포 표현 형 또는 진 식을 수정할 수 발생할 수 있습니다. 또한, 연습 후, 6 ~ 10 눈 두뇌 단지 10 ~ 15 분, 나이 및 해 부 눈 조직의 발달 단계에서 가변성을 최소화의 목표를 용이 하 게 고립 될 수 있다.
고정, immunostaining, 및 아래에 설명 된 전체 마운트 프로토콜은 형광 현미경 검사 법에 대 한 초파리 눈의 준비에 적합 하다. 망막은 관심사의 단백질을 대상으로 하는 항 체와 알을 품을 수 있다. 예를 들어 외화 접합 부품에 항 체 특성 셀을 포함 하 여, 모양 및 배치 평가19될 수 있도록 셀의 꼭대기 크기를 시각화 하기 위해 활용할 수 있습니다. 고정, 이전 서쪽 분석, 단백질 또는 RNA qRT-PCR에 사용 하기 위해 또는 RNA 시퀀싱을 추출 하기 위해 뇌에서 눈 죽 습 수 대신 수 있습니다.
Protocol
1. 조직 준비 초파리 를 설정 (앞에서 설명한20) 십자가 또는 원하는 유전자 형의 번데기를 특정 초파리 긴장 문화. 되도록 많은 pupae coincidently 등장, 그 영양소 풍부한 음식 미디어 또는 표준 식품 미디어 아낌없이 효 모-붙여넣기 보충에 중복이 비행 문화를 확립. 25 ° c.에 초파리 문화 유지 십자가 UAS GAL4 시스템을 활용 하 여, GMR GAL4 애벌?…
Representative Results
번데기 눈은 그 드라이브 morphogenesis 발달 과정을 조사 하는 우수한 모델 역할을 쉽게 액세스할 수 있는 조직 이다. 여기, 우리 망막 해 부는 면역 형광 꼭대기 외화 접합 (그림 3A, C) 또는 apoptosis (그림 3)25동안 활성화 되는 Dcp-1 caspase (그림 3D)를 감지 하는데. 이러한 방식을 명확 하 게 모집 등 (18 h APF)?…
Discussion
여기에 설명 된 초파리 번데기 눈 해 부 방법 10 ~ 15 분 이내 6-10 눈 두뇌 단지의 격리에 대 한 수 있습니다. 그러나, 인 내와 연습 절 개 기술을 지배 품질 및 해의 속도 향상 시키기 위해 필수적입니다. 이 짧은 해 부 시간 각 눈 약 동일한 개발 단계, 표현 형 또는 유전자 표현의 데이터 집합에서 망막에 있는 가변성을 감소를 통해. 우리의 프로토콜은 조직적으로 찢 어 또는 깎기, 눈에 손상을…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고에 잭 드럼과 도움이 의견에 대 한 우리의 검토 감사합니다. 이 작품은 R15GM114729에 의해 지원 되었다.
Materials
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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Cite This Article
DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation. J. Vis. Exp. (145), e59299, doi:10.3791/59299 (2019).