Summary
وتعرض هذه الورقة طريقة جراحية لتشريح المورفولوجية شبكية العين الخوادر جنبا إلى جنب مع بروتوكولات لمعالجة الأنسجة إيمونوهيستوتشيميستري والتحليل الغربي، واستخراج الحمض النووي الريبي.
Abstract
الشبكية الخوادر المورفولوجية يوفر نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات morphogenetic أثناء التطوير. في هذه الورقة، نقدم بروتوكول موثوقة لتشريح الشبكية الخوادر المورفولوجية الدقيقة. نهجنا الجراحية يستخدم أدوات ميكروديسيكشن--متاحة بسهولة لفتح الخوادر ودقة استخراج مجمعات العين والدماغ. هذه يمكن ثابتة، ويتعرضون إيمونوهيستوتشيميستري، وشبكية العين ثم شنت على شرائح المجهر وتصويرها إذا كان الهدف الكشف عن الهياكل الخلوية أو سوبسيلولار. بدلاً من ذلك، يمكن تكون معزولة عن أنسجة المخ شبكية العين غير المثبتة وتفكيك في المخازن المؤقتة المناسبة وتستخدم لاستخراج التفريد أو مرناً هلام بروتين (لتقييم تعبير البروتين أو الجينات، على التوالي). ممارسة هامة والصبر قد يكون مطلوباً للماجستير في بروتوكول ميكروديسيكشن ووصف، ولكن حالما يتقن، البروتوكول يمكن عزلة سريعة نسبيا من شبكية العين أساسا غير التالفة.
Introduction
المورفولوجية الشبكية تتكون من حوالي 750 ommatidia محاطة بالخلايا الصبغية مرتبة في قرص العسل شعرية1،2،،من34. كل أوماتيديوم يحتوي على ثمانية من الخلايا العصبية مستقبله وأربع خلايا المخروط إفراز عدسة خليتين الصباغ الأولية. المحيطة بكل أوماتيديوم هي الخلايا المنتجة لصبغة شعرية ومجموعات شعيرات حسية. نظراً للطبيعة الانقسامية بعد وترتيب سداسية النمطية، يوفر الشبكية الخوادر المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة العمليات مورفوجينيتيك بما في ذلك خلية التصاق5،6، 7،،من89،10 والمبرمج11،12،13،،من1415.
تستخدم العديد من البروتوكولات المنشورة ضغط الهواء لاستخراج مجمعات العين والدماغ من المورفولوجية الخوادر16،،من1718. البروتوكول هو موضح هنا بدلاً من ذلك يستخدم أدوات ميكروديسيكشن بعناية ودقة عزل مجمعات العين والدماغ بهدف الحصول على نسيج الشبكية غير التالفة. هذا أمر بالغ الأهمية إذا كانت ستستخدم لشبكية العين المورفولوجية، والبروتين، أو التعبير الجيني يحلل حيث يمكن أن يؤدي إلى تلف شبكية العين الإجهاد الخلوية أو الموت، والتي يمكن أن تعدل تعبير النمط الظاهري أو الجينات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، بعد الممارسة، يمكن أن تكون معزولة في 10 إلى 15 دقيقة، تيسير تحقيق هدف تقليل التقلبات في العمر ومرحلة النمو من نسيج العين تشريح 6 إلى 10 مجمعات العين والدماغ.
التثبيت، وإيمونوستينينج، وبروتوكول الجامعة-جبل الموصوفة أدناه مناسبة لإعداد عيون المورفولوجية للفحص المجهري نيون. يمكن المحتضنة شبكية العين مع الأجسام المضادة لاستهداف البروتينات ذات الاهتمام. على سبيل المثال، يمكن استخدام أجسام مضادة لمكونات مفرق أدهيرينس تصور سيركومفيرينسيس قمي من الخلايا حتى تكون الخصائص بما في ذلك نوع الخلية، الشكل والترتيب المقررة19. قبل التثبيت، يمكن بدلاً من ذلك أن المشقوق عيون من الدماغ غرض استخراج البروتين للتحليل الغربي، أو الحمض النووي الريبي للاستخدام في قرة-PCR أو تسلسل الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد الأنسجة
- إعداد المورفولوجية الصلبان (كما تم وصفه سابقا20) أو ثقافة معينة سلالات المورفولوجية للحصول على الخوادر للنمط الوراثي المطلوب. للتأكد من أن ظهور عدد كبير من الخوادر بالصدفة، تنشئ هذه الثقافات يطير في مكررة على الأغذية الغنية بالمغذيات وسائط أو وسائل الإعلام الغذاء القياسية سخاء وتستكمل مع الخميرة ولصق.
- الحفاظ على الثقافات المورفولوجية عند 25 درجة مئوية. لاستخدام نظام UAS GAL4 الصلبان، هو تقرير الرصد العالمي--GAL4 برنامج تشغيل مثالية المعرب عنها في العين اليرقات القرص الخلايا الخلفي ثلم morphogenetic وفي جميع أنحاء تطوير الخوادر21،،من2223، 24-يخدم UAS لاكز X GAL4 تقرير الرصد العالمي عبر كعنصر تحكم مثالية الصليب كما يقود هو التعبير عن البروتين غير الذاتية وخاملة β-جالاكتوسيداسي.
- استخدام تلميح جبيرة الخيزران 6 "التي كانت مبللة بماء مقطر رفع الخوادر قبل أبيض (الشكل 1B) من جانب الثقافة الصحية القنينات (الشكل 1A) برفق ووضع في أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي (الشكل 1).
- ضع الأنابيب في مربع تلميح ماصة بلاستيكية جنبا إلى جنب مع قطعة صغيرة من الأنسجة غارقة في الماء المقطر للحفاظ على الدائرة في الرطوبة الكافية لحماية الخوادر من جفاف (الشكل 1). احتضان الخوادر في 25 درجة مئوية حتى التشريح.
- استخدام الخيزران جبيرة جافة 6 "بلطف دفع الخوادر في من أنبوب ميكروسينتريفوجي وعلى أسود تشريح طبق. وضع قطعة جديدة من الشريط على الوجهين على طبق تشريح بعيداً عن الخوادر.
- استخدام زوج من الملقط، بعناية وضع الجانب الظهرية الخوادر الأعلى (أي، أوبيركولومس مواجهة، الشكل 1B) على الشريط (الشكل 2A). ضمان تقيد الخوادر جيدا للشريط.
ملاحظة: الرطوبة في حالة الخوادر سوف تمنع التصاق آمنة إلى الشريط، وفي هذه الحالة، يسمح الخوادر أيردري قبل أن يضع على الشريط على الوجهين.
2-تشريح العين والدماغ مجمعات
- استخدام الملقط لإزالة أوبيركولوم من كل عذراء (الشكل 2).
- استخدام مقص ميكروديسيكشن لشريحة أو قص فتح القضية الخوادر لكل عذراء. رفرف فتح القضية الخوادر للكشف عن الرأس والصدر، والجزء البطني الأمامي، تأمين حواف القضية الخوادر للشريط على الوجهين (الشكل 2).
ملاحظة: من الضروري لم تكشف تماما الخوادر. - بيرس في البطن من كل عذراء بالملقط حادة، إدراك الحيوان، وإزالته من مرافعته الخوادر (الشكل 2).
- ضع الخوادر في على طبق تشريح السوداء، بعيداً عن الشريط، وتغطية مع حوالي 400 ميليلتر من المثلج الفوسفات-مخزنة-الحل (PBS، درجة الحموضة 7.4).
- فهم كل عذراء بالبطن مع ملقط ومقص ميكروديسيكشن، وجعل قطع نظيفة مستعرضة من خلال الصدر كامل، قطع الخادرة في النصف (الشكل 2D).
- إزالة بقايا الخلفي من كل الذبيحة من برنامج تلفزيوني، ووضعت إلى جانب واحد على طبق تشريح (عدم تجاهل، راجع الخطوة رقم 3.2.1).
- باستخدام اثنين من أزواج من الملقط غرامة، فتح الصدر والرأس لكل عذراء لتكشف عن مجمع العين والدماغ (الشكل 2E). للقيام بهذا، فهم القص-حواف ظهارة القفص الصدري والدموع تدريجيا فتح الصدر والرأس ثم كبسولة، تعريض العين والدماغ معقدة والمحيطة الأنسجة الدهنية.
- دون استيعاب الأنسجة، استخدام الملقط لتوجيه المجمع العين والدماغ بعيداً عن بقايا الكبسولة الرأس أو حلج القطن المجمع العين والدماغ من الكبسولة التي مزقتها-فتح الرأس.
ملاحظة: المجمع العين والدماغ على شكل الدمبل، والبيض، وشفافة أكثر من لون الدهون المحيطة بها (الشكل 2، ه). - مع الملقط، بعناية إزالة معظم الدهون المرتبطة بالمجمعات العين والدماغ دون لمس أنسجة العين.
3-تجهيز الأنسجة الفلورة
- تشريح الخوادر مالا يقل عن 6-10 كوصف (خطوات 2.1-2.9).
ملاحظة: ثلاثة أو أربعة replicates مستقلة لكل تشريح تميل إلى أن تسفر عن بيانات كافية لاختبار فرضية. -
الغسيل والتثبيت
- قص طرف P20 أو تلميح ماصة P100 مع شفرة حلاقة نظيفة لزيادة نصيحة-الافتتاح ~ 1 مم في دائرة نصف قطرها وتليين قبل بيبيتينج مزيج من برنامج تلفزيوني والدهون صعودا وهبوطاً. يمكن الحصول على هذه الدهون من مخلفات الذبيحة بإزالة في الخطوة 2، 6.
- تحويل المجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في صحن زجاج 9-جيدا، على الجليد. استخدام تلميح مشحم وهواء تشريد ميكروبيبيتي P20 أو P100 لنقل.
ملاحظة: العين والدماغ المجمعات سوف تلتزم بنصائح أونلوبريكاتيد أثناء بيبيتينج وتتعرض للضرر أو فقدت. - إزالة الدهون المتبقية المرتبطة بنسيج العين التي بيبيتينج برنامج تلفزيوني صعودا وهبوطاً للطف دوامة مجمعات العين والدماغ. في هذا المجال وجميع الخطوات اللاحقة الغسيل، لا مباشرة "الماصة؛" مجمعات العين والدماغ صعودا وهبوطاً كهذا سيضر نسيج العين الهشة.
- نقل مجمعات العين والدماغ في حجم الحد أدنى (< 20 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني في مالا يقل عن 250 ميليلتر من مثبت. مزيج من بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً. احتضان لمدة 35 دقيقة، على الجليد.
ملاحظة: يمكن استخدام تلميح مشحم نفس إعدادها في الخطوة 3.1.1 لهذا النقل. - مع تلميح ماصة نفسه، نقل مجمعات العين والدماغ في ميليلتر ~ 400 تتضمن أيضا من برنامج تلفزيوني. مزيج من بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة على الجليد، أن يغسل. كرر الخطوة الغسيل مرتين على الأقل.
ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بمجمعات العين والدماغ لعدة ساعات في الغسيل PBS النهائية، على الجليد، أو عند 4 درجة مئوية، قبل الانتقال إلى الخطوة 3.3.1.
-
تلطيخ جسم
- إلى كتلة الأنسجة قبل التعرض لجسم الحلول، نقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميليلتر من PBT. استخدام تلميح مشحم وهواء تشريد ميكروبيبيتي P20 أو P100 للنقل. احتضانها ل 10 إلى 60 دقيقة، على الجليد.
- تحضير حل جسم الأولية بتمييع الأجسام المضادة المناسبة في PBT. إذ هي المحتضنة مجمعات العين والدماغ في 10 ميليلتر مختبرين لجسم الحل، ستكون وحدة التخزين أعد تكرار 10.
- الكوة ميليلتر 10 حل جسم في بئر نظيفة من علبة ميكروويل 72-جيدا (انظر المناقشة).
- قص غيض من طرف ماصة P10 مع شفرة حلاقة نظيفة لزيادة نصيحة-افتتاح مم ~0.5 في دائرة نصف قطرها وتليين قبل PBT بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- نقل لا يزيد عن 5 مجمعات العين والدماغ، في حجم < 3 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، في كل ميليلتر 10 جيدا لحل جسم باستخدام P10 هواء تشريد ميكروبيبيتي ونصيحة مشحم.
- مجانسة الأضداد الحل قبل بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً. لا "الماصة؛" مجمعات العين والدماغ صعودا وهبوطاً كهذه ستؤدي إلى الأضرار الأنسجة.
- للتقليل من تبخر المحلول جسم، ضع قطعة صغيرة من الأنسجة غارقة في الماء المقطر في علبة ميكروويل وختم علبة الورق (على سبيل المثال، مع غطاء المقدمة). تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- تحويل المجمعات العين والدماغ من علبة ميكروويل إلى ~ 400 ميليلتر من PBT في صحن زجاج وليد 9، أن يغسل. استخدام P10 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ونصيحة مشحم PBT (إعداد كما هو موضح في الخطوة 3.3.4). مزيج من بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً. احتضان لمدة 5-10 دقائق على الجليد.
- كرر الخطوة الغسيل مرتين على الأقل. استخدام P20 أو P100 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ونصيحة مشحم PBT لنقل مجمعات العين والدماغ بين حلول المياه والصرف الصحي.
- تحضير حل جسم الثانوية بتمييع المناسبة fluorophore معلم الثانوي الأجسام المضادة في PBT كما هو مطلوب. 100 ميليلتر من حل جسم الثانوية ما يكفي كل دفعة الخوادر 6-10. قاسمة الحل جسم الثانوية في طبق تشريح زجاج ويليد 9.
- نقل مجمعات العين والدماغ في حل جسم الثانوية. استخدام P20 أو P100 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ومشحم PBT تلميح للنقل.
- تبني مجمعات العين والدماغ في حل جسم الثانوية ح 1-2 في درجة حرارة الغرفة، أو ح 3-5 في 4 درجات مئوية. لمنع تبييض من فلوروفوريس بالضوء، تشمل الإعداد مع إحباط.
ملاحظة: قد تختلف المدة المثلى للحضانة في حل جسم الثانوي وفقا للأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة. - تحويل المجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميليلتر من PBT في صحن زجاج 9-جيدا، أن يغسل. مزيج من بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً. احتضان لمدة 5-10 دقائق على الجليد. يجب تكرار هذه الخطوة الغسيل مرتين على الأقل.
-
التثبيت الثانوية
- لتثبيت ثانوية، نقل مجمعات العين والدماغ إلى مالا يقل عن 200 ميليلتر من مثبت واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 35 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: التثبيت الثانوية يتصلب نسيج العين، الذي يساعد التركيب (الخطوة 3، 5). - استخدام P20 أو P100 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ومشحم PBT نصيحة لتحويل المجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميليلتر من PBT في صحن زجاج 9-جيدا، على الجليد، يغسل لمدة 5 دقائق.
- كرر الخطوة الغسيل مرة واحدة على الأقل.
- استخدام P20 أو P100 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ومشحم PBT نصيحة لتحويل المجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في صحن زجاج 9-جيدا، على الجليد، شطف للحد الأدنى 1-2 الحفاظ على الأنسجة في الحركة ببرنامج تلفزيوني بيبيتينج، ولكن ليس الأنسجة ، صعودا وهبوطاً لمنع مجمعات العين والدماغ من تسوية والتمسك بالطبق الزجاج خلال برنامج تلفزيوني-الشطف.
- لتثبيت ثانوية، نقل مجمعات العين والدماغ إلى مالا يقل عن 200 ميليلتر من مثبت واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 35 دقيقة في 4 درجات مئوية.
-
تصاعد
- تحويل المجمعات العين والدماغ إلى ~ 200 ميليلتر من تركيب وسائط. استخدام P20 أو P100 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ومشحم PBT تلميح لنقل مجمعات العين والدماغ. تسمح الأنسجة حجته في تركيب وسائط ح 1-2.
- ضع قطره 5-8 ميليلتر من تصاعد جديد وسائط الإعلام إلى شريحة مجهر نظيفة.
- قص نصيحة P10 مع شفرة حلاقة نظيفة زيادة نصيحة-افتتاح مم ~0.5 في دائرة نصف قطرها واستخدام هذا و P10 هواء تشريد ميكروبيبيتي نقل مجمعات العين والدماغ في 5-8 ميليلتر من تركيب وسائط إلى قطره من تركيب وسائط على الشريحة.
- استخدم اثنين التنغستن الإبر لفصل العيون من الفصوص البصرية. دبوس مجمع عين والدماغ إلى الشريحة بإبرة تنغستن قوي وشريحة كل العين بعيداً عن الفص البصري المرتبط بإبرة تنغستن غرامة (الشكل 2 واو).
- استخدام إبرة التنغستن غرامة للمناورة كل عين على سطح الشريحة المجهر مع السطح القاعدي لكل العين المجاور للشريحة. بلطف أدنى زلة غطاء نظيف على الأنسجة وآمنة مع طلاء الأظافر.
ملاحظة: ترتيب عيون على الشريحة بحيث تكون قريبة من بعضها البعض أو في خط سيسهل مجهرية اللاحقة. - صورة شبكية العين باستخدام مجهر فلوري أو [كنفوكل].
ملاحظة: الشرائح يجب أن تكون مخزنة في 4 درجات مئوية إذا لم يكن تصويرها فورا.
4-إعداد نسيج العين النشاف الغربية:
- تشريح 10-16 الخوادر (خطوات 2.1-2.9) مع إدخال التعديلات التالية: أ) جمع وتشريح الخوادر في دفعتين، 10-15 دقيقة عن بعضها البعض وب) تشريح في برنامج تلفزيوني وتستكمل مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (برنامج تلفزيوني + pi).
- نقل مجمعات العين والدماغ باستخدام P20 أو P100 الهواء التشريد ميكروبيبيتي ومشحم نصيحة (إعداد كما هو الحال في الخطوة 3.2.1) إلى ~ 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + pi في صحن زجاج 9-جيدا، على الجليد، شطف بإيجاز.
ملاحظة: يمكن استخدام هذا تلميح مشحم للخطوات اللاحقة 4، 3 و 4-4. - كرر الخطوة شطف مرتين.
- تحويل جميع المجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميليلتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني + pi وفوجازارو على طبق تشريح أسود نظيفة.
- إزالة كل عين من الفصوص البصرية باستخدام إبرة تنغستن قوي (لثابت المجمع العين والدماغ) وعلى ما يرام شفرة حلاقة أو ميكروديسيكشن المقص لقص نظيفة كل عين من الفص البصري.
ملاحظة: العيون هي 'لزجة' في هذه المرحلة ويجوز التمسك باستخفاف طبق تشريح. وهذا مفيد كما أنها يمكن أن تساعد في تسهيل إزالة العيون من الفصوص البصري (انظر المناقشة). - 'الاجتياح' كل العيون إلى 'كومة' في برنامج تلفزيوني + pi على طبق تشريح، باستخدام شفرة واحدة من زوج خير من الملقط.
- قص نصيحة P10 مع شفرة حلاقة نظيفة لتوسيع نصيحة-افتتاح مم ~0.5 في دائرة نصف قطرها وتليين الحافة الداخلية من بيبيتينج الغربية الأنسجة تحلل المخزن المؤقت (وتلب) صعودا وهبوطاً.
- نقل مجمعات العين والدماغ في 5 ميليلتر من برنامج تلفزيوني + pi في أنبوب ميكروسينتريفوجي 500 ميليلتر. استخدم هذا تلميح مشحم و P10 هواء تشريد ميكروبيبيتي لإكمال عملية النقل.
- وضع أنبوب ميكروسينتريفوجي على الجليد. إضافة إلى حجم 1 (5 ميليلتر) وتلب للعينة، و 10 ميليلتر من البروتينات المركزة x 2 عينة المخزن المؤقت (أو 2.5 ميليلتر من البروتينات المركزة x 5 عينة المخزن المؤقت). مزيج من التنصت.
- دوامة ميكروسينتريفوجي الأنبوبة بإيجاز وتدور أسفل نموذج باستخدام أجهزة الطرد مركزي سطح مكتب المصغر.
- تخزين العينة في-20 درجة مئوية حتى التحليل. تحليل استخدام البروتوكولات القياسية.
5-إعداد نسيج العين لاستخراج الحمض النووي الريبي:
- ارتداء القفازات و benchtop نظيفة والمجهر، أدوات تشريح والأسود تشريح طبق أولاً مع الإيثانول 70% ومن ثم رناسي الكاشف إزالة التلوث. السماح لتجف.
- تشريح الخوادر 30-40 كوصف (خطوات 2.1-2.9) مع إدخال التعديلات التالية:) جمع وتشريح الخوادر 6 إلى 8 على دفعات، 15-20 دقيقة عن بعضها البعض؛ ب) تشريح في برنامج تلفزيوني خالية من نوكلياسي وج) عزل كل دفعة من العيون بشكل منفصل ولكن تتراكم كل نسيج الشبكية في أنبوب ميكروسينتريفوجي نفسه (الخطوة 5، 5).
ملاحظة: وجود شخصين تشريح وفي نفس الوقت ستسرع كفاءة عزل نسيج العين جيدة. - لكل دفعة، عزل مجمعات العين والدماغ (خطوات 2.1-2.9) ونقل إلى ~ 400 ميليلتر من برنامج تلفزيوني نوكلاس خالية في صحن زجاج 9-جيدا شطف بإيجاز، على الجليد، باستخدام P20 أو P100 ميكروبيبيتي التشرد الجوية ونصيحة مشحم (إعداد كما هو موضح في الخطوة 3.1.2).
ملاحظة: يمكن استخدام هذا تلميح مشحم للخطوات اللاحقة 5.4 و 5.5 و 5.8. - كرر الخطوة شطف مرتين.
- نقل مجمعات العين والدماغ في قطره جديدة 400 ميليلتر من المثلج خالية نوكلاس برنامج تلفزيوني على أسود نظيفة تشريح طبق.
- إزالة كل عين من الفصوص البصرية باستخدام إبرة تنغستن قوي (لثابت الدماغ العين المعقدة) وعلى ما يرام شفرة حلاقة أو ميكروديسيكشن المقص لقص نظيفة كل عين من الفص البصري.
ملاحظة: العيون هي 'لزجة' في هذه المرحلة ويجوز التمسك باستخفاف طبق تشريح. وهذا مفيد كما أنها يمكن أن تساعد في تسهيل إزالة العيون من الفصوص البصري (انظر المناقشة). - 'الاجتياح' كل العيون إلى 'كومة' في PBS نوكلاس مجاناً على طبق تشريح، باستخدام شفرة واحدة من زوج خير من الملقط.
- نقل العينين إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي خالية من رناسي عقيمة والفلاش-التجميد في النيتروجين السائل.
- كرر تشريح (خطوات 5.3-5.8) لكل دفعة من الخوادر. نقل كل دفعة من العيون في أنبوب ميكروسينتريفوجي نفسها التي ظلت في النتروجين السائل (الخطوة 5، 5) لتجميع كل العيون في أنبوب واحد.
- تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العين الخوادر هو أنسجة يسهل الوصول إليها بمثابة نموذج ممتاز للتحقيق في العمليات الإنمائية morphogenesis محرك الأقراص هذا. هنا، نحن قد تشريح شبكية العين واستخدمت الفلورة للكشف عن الوصلات أدهيرينس قمي (الشكل 3 ألف، جيم) أو caspase Dcp-1 (الشكل 3D) التي يتم تفعيلها أثناء [ابوبتوسس] (الشكل 3)25. تسمح هذه النهج بوضوح مراقبة الخلايا أثناء العمليات morphogenetic الرئيسية بما في ذلك التوظيف و morphogenesis الخلايا الأولية (من ح 18 الاتحادية)، والخلايا الالكترود شعرية حول كل أوماتيديوم (18-24 ح APF)، إنشاء مكانة التعليم العالي (21-24 ح الاتحادية)، والتغيرات في حجم الخلية والشكل (من 18 ح إلى ح 40 الاتحادية)، والمبرمج (من 18 إلى ~ 33 ح الاتحادية). توقيت هذه الأحداث morphogenetic تتوقف على درجة الحرارة، ولذلك سوف تختلف متواضعة ردا على الاختلافات الطفيفة في درجات حرارة الحاضنة في إعدادات المختبر المختلفة. ومع ذلك، قبل حوالي 40 ح الإدارة العامة الاتحادية، الترتيب النهائي للخلايا وعادة ما يتحقق (الشكل 3، ج) وهذا هو عصر مثالية التي يتم تقييم النتائج المترتبة على الطفرات الوراثية أو تعديل التعبير الجيني. على سبيل المثال، التعبير التالي حمل خارج الرحم Diap1، مثبط أساسية للمبرمج caspase التنشيط (الشكل 3)26، ونهجنا يسمح أحد للتحديد الكمي لما يترتب عليه من الزيادة في عدد الخلايا شعرية بالمقارنة مع عنصر تحكم تقرير الرصد العالمي > لاكز الشبكية. واحد بسهولة أيضا تقييم المبرمج أكثر مباشرة باستخدام الأجسام المضادة-Dcp-1 أو نهج أخرى للكشف عن خلايا الموت (الشكل 3D).
يمكن استجوابهم العين ليستي استخدام التحليل الغربي لتحديد وجود و/أو التعبير النسبي للبروتينات للفائدة. هنا، علينا إظهار كشف دي-كادهيرين، العنصر الأساسي من تقاطعات أدهيرينس، في نوع البرية S كانتون شبكية العين تشريح في ح 21 و 40 APF عيون (الشكل 4 أ). التحديد الكمي لهذه العينة وصمة عار الغربية (الحق، الشكل 4A) كشفت عن أن التعبير النسبي عن دي-كادهيرين، لم تختلف كثيرا في هذه المرة-النقطتين، عندما يتم تطبيع كثافة الفرقة وفقا للتعبير عن جابده (نواة إنزيم الأيضي). أن عادة إجراء هذه التحليلات في ثلاث بدلاً من مجرد مرة واحدة، كما هو موضح هنا.
من الضروري عزل مرناً عالية النقاء من المورفولوجية الخوادر شبكية العين إذا كان الهدف واحد تحليل التعبير الجيني باستخدام تطبيقات التسلسل المتقدمة (مثل الجيل المقبل، وتسلسل الحمض النووي الريبي). وقد وجدنا أن تشريح عيون أكثر من 60 كل حالة تجريبية أو النمط الوراثي الأمثل إذا كان هدف واحد عزل > 1 مغ من الحمض النووي الريبي عالية الجودة (الشكل 4 باء). هنا، نعرض مثالاً امتصاص الأطياف عينة الحمض النووي الريبي المعزولة من نوع البرية 57 S كانتون العيون، وتشريح في ح 40 الاتحادية (الشكل 4 باء، أعلى اللوحة). امتصاص الذروة في 260 nm يناظر الطول الموجي امتصاص للجيش الملكي النيبالي. ونقدم أيضا جدولاً يعكس العائد الجيش الملكي النيبالي و A260/A280 و A260/A230 نقاء النسب من ست عينات الحمض النووي الريبي، تجمعوا في 21 ح أو ح 40 الاتحادية. وتعكس هذه البيانات تعطي الفروق الدقيقة في الحمض النووي الريبي عند استخراج الحمض النووي الريبي.
الشكل 1 : التحديد والثقافة الخوادر للتشريح- (أ) تجول الطور اليرقات الثالثة (L3) اليرقات والخوادر لتحديد موقع على طول جانبي صحية المورفولوجية الثقافات. يمكن تحديد الخوادر (ب) قبل لونها أبيض شفاف حسبما الصباغ ولم يتم إنشاؤها في حالة الخوادر وقائية. المحور الأمامي الخلفي والظهريه البطني من الخادرة تظهر باللون الأزرق. يستخدم على جبيرة الخيزران رطبة لإزاحة واختيار ما قبل الخوادر من جدران القنينة. الخوادر (ج) توضع داخل أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل التي هي وصفت بشكل مناسب (النمط الوراثي، وتاريخ جمع، ووقت جمع) و (د) مثقف داخل دائرة هوميديفيد تجميعها من مربع تلميح ماصة فارغة. يتم الاحتفاظ بالرطوبة بوضع قطعة من الأنسجة رطبة داخل المربع. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تشريح العين الخوادر. الخوادر (أ) التقيد بالشريط على الوجهين على أسود تشريح طبق. يتم الإشارة إلى إحداثيات الأمامي والخلفي، والظهريه باللون الأزرق. (ب) عزل مجمعات العين والدماغ (واحد واحد هو موضح هنا)، (ج) عذراء أولاً إزالة من مرافعته الخوادر. تظهر الخطوات الهامة في هذه العملية. تدل الخطوط الحمراء أين المسيل للدموع وفتح القضية الخوادر بعد إزالة في أوبيركولوم. ثم تتم إزالة في الخوادر من القضية الخوادر ممزقة مع الملقط. أولاً قطع عذراء (د) تعرض على طول الصدر مع ميكروديسيكشن المقص (الوضع المشار إليه مع خط أحمر متقطع) ورأسه ظهارة ثم ممزقة بعناية مفتوحة (الأسهم الحمراء)، كما هو مبين في (ه) للكشف عن المجمع الدماغ العين معتمة. (و) بعد الحضانة مع الأجسام المضادة المناسبة، هي شرائح شبكية العين من مجمعات العين والدماغ. تظهر الخطوات الهامة في هذه العملية. واستقرت في العين والدماغ بإبرة تنغستن قوي (يسار) وشبكية العين إزالتها بإبرة تنغستن غرامة (يمين). للبروتين وتحاليل الحمض النووي الريبي، يمكن خفض شبكية العين غير المثبتة نظيفة من الفصوص البصرية باستخدام شفرة حلاقة غرامة أو مقص ميكروديسيكشن، بدلاً من إبرة تنغستن غرامة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الفلورة العين الخوادر. (أ) أجسام مضادة للتسمية دي-كادهيرين أدهيرينس قمي تقاطعات خلايا العين الخوادر. كل الصور في لوحة ألف تجمعوا في المنطقة الوسطى من الشبكية باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]، تعديل الحد الأدنى مع برامج معالجة صور، وترد على نفس النطاق (شريط المقياس = 5 ميكرومتر). ملاحظة النمو وإعادة ترتيب الخلايا من ح 18 الاتحادية إلى 27 ح الإدارة العامة الاتحادية. (ب) الرسوم المتحركة من رأي قمي أوماتيديوم منقوشة تماما واحد في ح 40 الاتحادية (يسار) وأوماتيديوم في المقطع العرضي. أنواع الخلايا مرمزة كما هو موضح في المفتاح. مدفونة تحت سطح نيوروبيثليوم بسيودوستراتيفيد فوتوريسيبتورس ومحاطة بمخروط وصبغ الخلايا. ثلاث شعيرات مجموعات تحيط بكل أوماتيديوم. (ج) المناطق الصغيرة للتحكم الشبكية التي لاكز أعرب (يسار) أو Diap1 (يمين) تمنع المبرمج للخلايا الصبغية التعليم الثانوي والعالي. وسم من تقاطعات أدهيرينس مع مكافحة-دي-كادهيرين يتيح تحليل عدد الخلايا، والترتيب، والشكل. تم القبض على الصور باستخدام مجهر فلوري القياسية. (د) أكمله شبكية المحتضنة مع الأجسام المضادة لتنشيط التعاون الميداني-1، caspase تفعيلها خلال المبرمج، الذي تقتطع خلايا عديدة من العين. صورة تم التقاطها باستخدام مجهرية [كنفوكل]. ويحدد خط منقط أبيض العين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : تحليل تعبير البروتينات والجينات العين الخوادر. (A) وصمة عار الغربية (إلى اليسار) من 28 عيون تشريح في 21 ح APF أو ح 40 الاتحادية، سبر مع الأجسام المضادة دي كندي، وكعنصر تحكم تحميل، جابده. تحليلات للبروتين الفرقة كثافات (يمين) يكشف عن تركيزات مماثلة كاد دي موجودة في هذه المجموعات من شبكية العين، بالنسبة إلى جابده. (ب) طيف امتصاص واحد عينة الحمض النووي الريبي المستخرج من شبكية العين S كانتون تشريح في ح 40 الاتحادية (أعلى). ملاحظة امتصاص الذروة في 260 نيوتن متر. الجدول توثيق النسب المبلغ والنقاء من الحمض النووي الريبي المستخرج من شبكية العين الخوادر S كانتون معزول في ح 21 و 40 الاتحادية (أسفل). وتنشأ هذه البيانات من ثلاث مجموعات عينة مستقلة. الخوادر لكل مجموعة من مجموعات العينة التي أثيرت والمحتضنة في نفس الظروف وتشريح في نفس اليوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة تشريح العين الخوادر المورفولوجية الموصوفة هنا يسمح للعزلة من 6 إلى 10 مجمعات العين في الدماغ خلال 10 إلى 15 دقيقة. ومع ذلك، الصبر والممارسة ضرورية بغية إتقان تقنية تشريح وتحسين نوعية وسرعة من تشريح. يضمن هذا الوقت القصير تشريح كل عين تقريبا المرحلة الإنمائية ذاتها، الحد من تقلب في تعبير النمط الظاهري أو الجينات لشبكية العين في مجموعة البيانات. في حين قد تتطلب بروتوكولات بديلة أقل ممارسة لإتقان، لدينا بروتوكول يهدف إلى عزل نسيج الشبكية الحساسة منهجي مع تقليل خطر تمزق أو القص، نظراً للأضرار التي لحقت العين يمكن الحث على تنشيط مسار الإجهاد أو حتى موت الخلية. أننا ننصح المبتدئين لأول ماجستير تشريح الخوادر مثقف إلى ح 40 الاتحادية قبل محاولة تشريح عيون الأصغر سنا. نوصي بإنشاء تكرار الصلبان لكل التجارب (الخطوة 1، 1) مما يضمن أن هناك دائماً الخوادر كافية متاحة لجمع (الخطوة 1، 3). يمكن تشريح شبكية العين في مجموعة متنوعة من تيميبوينتس أثناء تطوير الخوادر، اعتماداً على الأحداث morphogenetic المتميزة التي تهم الباحث. وهذه يمكن أن تشمل التوظيف و morphogenesis الخلايا الأولية (من ح 18 الاتحادية) والالكترود خلايا شعرية (18-24 ح APF)، إنشاء مكانة التعليم العالي (21-24 ح APF)، تغييرات في حجم الخلية والشكل (من 18 ح إلى ح 40 الاتحادية) والمبرمج (من 18 إلى ~ 33 ح الاتحادية) (الشكل 3A).
إذا أثناء افتتاح الأولية في القضية الخوادر (الخطوة 2-2، الشكل 2)، هو ثقب الصدر من عذراء، ينبغي أن يكون الباحث لا تزال قادرة على المضي قدما مع التشريح. ومع ذلك، إذا كان في البداية هو ثقب الرأس، استخراج المجمعات غير التالفة في الدماغ العين قد يكون صعباً. عند إزالة عذراء من مرافعته الخوادر (الخطوة 2.3، الرقم 2، اللوحة اليمنى)، قضية الخوادر البطن يمكن أحياناً إزاحة من الشريط على الوجهين وتبقى ملفوفة حول البطن عذراء. هذا من غير المحتمل عقبة، على الرغم من أن قد تعدت عذراء عندما محاطة ببرنامج تلفزيوني حتى البطن وتعلق قضية الخوادر يتم فصلها عن عذراء (الخطوة 2، 6). للحفاظ على سلامة نسيج الشبكية، من المحتم أنها ثابتة أو المجمدة، في أسرع وقت ممكن بعد ثقب الأولية الخوادر. وبالإضافة إلى ذلك، باستخدام حلول المثلج والحفاظ على الأنسجة على الجليد (أو عند 4 درجة مئوية) كلما كان ذلك ممكن في جميع أنحاء البروتوكول سيتم الحفاظ على الأنسجة وسلامة الخلوية، مما يؤدي إلى تحسين الفلورة، البروتين-تحليل أو تحليل الحمض النووي الريبي. للتطبيقات الأخيرة، من المهم إزالة جميع المخ والأنسجة الدهنية من عيون كهذه الأنسجة سوف تلوث التحليلات (الخطوة 2.9 و 4.3 أو 5.4).
يمكن أن تنضم المجمع الخوادر في الدماغ العين إلى نصائح ماصة أونلوبريكاتيد والزجاج وتشريح أدوات عندما تنتفي أو خلال برنامج تلفزيوني يغسل/يشطف، مما يؤدي إلى تلف الأنسجة. لمنع هذا، نوصي تزييت الدقيق من نصائح ماصة ولا غسالة الزجاج جيدا 9 أطباق مع الإيثانول (صحن الصابون وينبغي أيضا تجنب). بدلاً من ذلك، ببساطة تنظيف الأطباق الزجاج مع المقطر ح2س وتليين، إذا لزم الأمر، مع شطف PBT قبل استخدامها. ملقط تشريح والمقص والإبر يجب أيضا أساسا تنظيف مع المقطر ح2س، فيما عدا عند إعداد هذه لاستخراج الحمض النووي الريبي تشريح (الخطوة 5، 1). ومع ذلك، يمكن مساعدة التصاق الخفيفة بين شبكية العين وشرائح المجهر الزجاج في رفعوا العيون ووضعها على الشرائح عندما يفصل العينين الفصوص البصرية أثناء تصاعد (الخطوة 3.5.4 و 3.5.5). وبالمثل، يمكن استخدام التصاق الخفيفة من العيون إلى اللون الأسود تشريح الأطباق تسطيح وخفيفا جداً تمتد يحلل الأنسجة مما يسهل تنظيف قطع الاتصالات البصرية العين الفص عند عزل شبكية العين للبروتين أو الحمض النووي الريبي (الخطوة 4، 5 و 5-6). وقد وجدنا أن ميكروديسيكشن مقص أو شفرة حلاقة غرامة وأدوات ممتازة تنشق بسرعة ونظيفة عيون غير المثبتة من الفصوص البصرية.
خلال تلطيخ جسم الأولية، بدلاً من أن تفرخ مجمعات العين والدماغ في الدقيقة 72-بئر الصواني (الخطوة 3.3.5)، طبق زجاج 9-جيدا يمكن بدلاً من ذلك استخدام. لمنع تبخر المحلول جسم بين عشية وضحاها، يجب التأكد من آب الآبار صحن زجاج مع كشف الغطاء أو الشريحة. ومع ذلك، يتطلب هذا النهج 40-50 ميليلتر من حل جسم الأولية لمجموعة من 6-10 مجمعات العين والدماغ المحتضنة في بئر واحدة من صحن زجاج 9-جيدا، بدلاً من 20 ميليلتر من حل جسم الأولية موزعة بين الآبار 2 من علبة الدقيقة 72-بئر.
التثبيت الثانوية من مجمعات العين والدماغ (الخطوة 3، 4) قبل تركيب عيون على شرائح المجهر (الخطوة 3، 5) سوف هامشيا تشديد الأنسجة حيث أن من الأسهل تهزم العيون من الفصوص البصرية والعيون أقل احتمالاً لإضعاف أو التمسك بالإبر تشريح. بعد ح 1-2 حضانة في تصاعد المتوسطة (الخطوة 3.5.1)، تصبح مجمعات العين والدماغ معتمة قليلاً ومن ثم أسهل لترى بينما تصاعد. وبالإضافة إلى ذلك، بعد 1-2 ساعة في المتوسط المتصاعدة، معظم الأجسام المضادة الثانوية سوف تكون تأهيلاً مناسباً محمية من تبييض الصورة أثناء التصوير الفلورسنت. حضانة شبكية العين بين عشية وضحاها في تركيب وسائل الإعلام قبل تصاعد غير مستحسن، وهذا يجعل شبكية العين لينة، ويلغي أثر تشديد التثبيت الثانوية.
للتحليلات الغربية، مطلوب ليساتي العيون على الأقل 20 موثوق بها الكشف عن البروتينات باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف بقوة المورفولوجية البروتينات (مثل الشكل 4A). ومع ذلك، عددا أكبر من عيون قد يلزم إذا كان هناك التعبير منخفضة من البروتين المستهدف للفائدة. إذا تحلل الأنسجة النشاف الغربية اللاحقة هي ناقصة (الخطوة 4، 7)، يمكن زيادة حجم وتلب إضافة إلى العينة هامشيا وحجم عينة مركزة المخزن المؤقت تبعاً (الخطوة 4.9). لاستخراج الحمض النووي الريبي، تشريح السريع لعدد كبير من العيون قد يلزم إذا كان الهدف عزل كمية كبيرة من الحمض النووي الريبي عالية الجودة (الخطوة 5، 2، انظر الشكل 4 باء). يمكن التغلب على هذا العائق المحتمل إذا كان التعاون اثنين من العلماء الذين أتقنوا المورفولوجية الخوادر العين تشريح تشريح هذه الإعداد الكبيرة من شبكية العين يطير في نفس الوقت. ومع ذلك، المبلغ الإجمالي للجيش الملكي النيبالي المطلوبة سيتوقف على متطلبات المؤسسة أو المرفق إجراء تحليل الحمض النووي الريبي، ونوع تحليل الحمض النووي الريبي أو التسلسل، وأدوات استخراج الحمض النووي الريبي الذي يتم استخدامه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر طبل زاك ولدينا المراجعين لتعليقات مفيدة على المخطوطة. وأيد هذا العمل R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
