Summary
Este trabalho apresenta um método cirúrgico para dissecando Drosophila pupal retina juntamente com protocolos para o processamento de tecido para extração de RNA, análise ocidental e imuno-histoquímica.
Abstract
A retina pupal Drosophila fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas durante o desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos um protocolo confiável para a dissecação da retina pupal Drosophila delicada. Nossa abordagem cirúrgica utiliza ferramentas prontamente disponíveis microdissection para abrir pupas e extrair precisamente complexos de olho-cérebro. Estas podem ser fixas, submetidas a imuno-histoquímica e retinas então montadas em corrediças do microscópio e fotografadas se o objetivo é detectar estruturas celulares ou subcelulares. Alternativamente, as retinas não fixadas podem ser isoladas do tecido cerebral, lysed em buffers apropriadas e utilizadas para proteína gel de electroforese ou mRNA extração (avaliar a expressão de proteínas ou gene, respectivamente). Paciência e prática significativa podem ser necessária para dominar o microdissection protocolo descrito, mas uma vez dominado, o protocolo permite isolamento relativamente rápido da retina principalmente sem danos.
Introduction
A retina de Drosophila é composta de aproximadamente 750 omatídeos, rodeados por células de pigmento, dispostas em um favo de mel lattice1,2,3,4. Cada omatídeo contém oito neurônios fotoreceptor, quatro células cone secretoras de lente e duas células primárias de pigmento. Ao redor cada omatídeo são células produtoras de pigmento do retículo e grupos de cerdas sensoriais. Devido à sua natureza pós mitótica e estereotipado arranjo hexagonal, Drosophila pupal retina fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas incluindo célula adesão5,6, 7,8,9,10 e apoptose11,12,13,14,15.
Vários protocolos publicados utilizam pressão de ar para extrair complexos de olho-cérebro de Drosophila pupas16,17,18. O protocolo descrito aqui, em vez disso utiliza ferramentas microdissection para cuidadosamente e isolar precisamente complexos de olho-cérebro, com o objetivo de se obter o tecido da retina intacto. Isso é fundamental se as retinas são para ser utilizada para morfológica, proteína, ou expressão gênica analisa desde danos à retina podem resultar em estresse celular ou morte, que poderia modificar a expressão celular do fenótipo ou gene. Além disso, depois do treino, complexos de 6 a 10 olho-cérebro podem ser isolados em 10 a 15 min, facilitando o objetivo de minimizar a variabilidade na idade e grau de desenvolvimento do tecido do olho dissecado.
A fixação, imunocoloração e montagem em todo o protocolo descrito abaixo é adequado para a preparação dos olhos de drosófila para microscopia fluorescente. As retinas podem ser incubadas com anticorpos alvejando proteínas de interesse. Por exemplo, anticorpos para componentes de junção aderente podem ser utilizados para visualizar as circunferências apicais das células para que características, incluindo o tipo de célula, forma e arranjo podem ser avaliados19. Antes da fixação, olhos em vez disso podem ser clivados do cérebro com a finalidade de extração de proteínas para análise ocidental, ou RNA para uso em qRT-PCR ou a sequenciação do ARN.
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Protocol
1. tecido preparação
- Configurar Drosophila cruza (conforme descrito anteriormente20) ou cultura específicas cepas de drosófila para obter pupas do genótipo desejado. Para garantir que um grande número de pupas emerge coincidentemente, estabelecer essas culturas voar em duplicado na mídia de alimentos ricos em nutrientes ou padrão alimentar mídia generosamente suplementadas com levedura-colar.
- Manter as culturas de Drosophila , a 25 ° C. Para cruzamentos utilizando o sistema de UAS-GAL4, GMR-GAL4 é um condutor ideal expressado nas células do disco olho larval posteriores ao sulco morfogenético e durante todo o desenvolvimento pupal21,22,23, 24. o Cruz UAS-lacZ X GMR-GAL4 serve como um controle ideal Cruz como conduz a expressão da proteína β-galactosidase não endógena e inerte.
- Uso a ponta de uma tala de bambu 6" que tenha sido molhada com água destilada para gentilmente levante brancos pré-pupas (figura 1B) do lado dos frascos de cultura saudável (figura 1A) e coloque em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL (Figura 1).
- Coloque os tubos em uma caixa de ponta da pipeta plástico juntamente com um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada para manter a câmara em humidade suficiente para proteger as pupas de dessecação (Figura 1). Incube as pupas a 25 ° C até a dissecação.
- Use uma tala de bambu seco 6" para empurre suavemente as pupas para fora do tubo de microcentrifugadora e para um negro dissecando o prato. Coloque um pedaço de fita dupla-face fresco sobre o prato de dissecação longe as pupas.
- Usando um par de pinças, coloque cuidadosamente o lado dorsal pupas para cima (ou seja, operculums voltada para cima, figura 1B) para a fita (Figura 2A). Certifique-se de que as pupas aderirem bem a fita.
Nota: Umidade no caso pupal irá inibir a adesão seguro à fita, caso em que, permitir que as pupas secar antes de colocar na fita dupla-face.
2. dissecação de complexos de olho-cérebro
- Use a pinça para remover o opérculo da cada pupa (Figura 2).
- Use microdissection tesoura para cortar ou abrir o caso pupal da cada pupa. Aba abrir o caso pupal revelar-te a cabeça, tórax e segmento abdominal anterior, fixando as bordas do pupal caso a fita dupla-face (Figura 2).
Nota: Não é necessário revelar inteiramente as pupas. - Perfurar o abdome da pupa cada com Pinças afiadas, para agarrar o animal e removê-lo do seu caso pupal (Figura 2).
- Coloque o prato de dissecação preto, longe da fita, as pupas e cubra com cerca de 400 µ l de gelado-tampão-fosfato (PBS, pH 7,4).
- Segure cada pupa por abdômen com fórceps e com uma tesoura microdissection, fazer um corte limpo transversal pelo tórax inteiro, cortando a pupa na metade (Figura 2D).
- Retire o posterior remanescente de cada carcaça da PBS e ponha de lado o prato dissecação (não descarte, veja Passo 3.2.1).
- Usando dois pares de pinças bem, abra o tórax e a cabeça da cada pupa para revelar o olho-cérebro complexo (figura 2E). Para fazer isso, segure as bordas de corte do epitélio do tórax e gradualmente rasgar para abrir o tórax e depois ir a cápsula, expondo o tecido gordo olho-cérebro complexo e envolvente.
- Sem agarrar o tecido, use fórceps para guiar o olho-cérebro complexo longe os restos da cápsula da cabeça ou colher o olho-cérebro complexo da cápsula cabeça rasgada-aberto.
Nota: O complexo de olho-cérebro é em forma de haltere, off-White e mais translúcido do que a gordura de cor creme circundante (Figura 2B, E). - Com a pinça, cuidadosamente remova a gordura mais associada os complexos de olho-cérebro sem tocar o tecido do olho.
3. processamento de tecido para imunofluorescência
- Disse as pupas de pelo menos 6-10 como descritos (passos 2.1-2,9).
Nota: Três ou quatro repetições independentes de cada dissecação tendem a produzir dados suficientes para testar uma hipótese. -
Lavagem e fixação
- Corte a ponta de um P20 ou ponta da pipeta P100 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a ponta-abertura ao ~ 1 mm de raio e lubrificar pipetando uma mistura de PBS e gordura acima e para baixo. Esta gordura pode ser obtida os restos de carcaça removidos na etapa 2.6.
- Transferi os complexos de olho-cérebro ~ 400 µ l de PBS em um prato de vidro 9-bem, no gelo. Use a ponta lubrificada e uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 para transferir.
Nota: Complexos de olho-cérebro serão aderem às pontas sem lubrificação durante a pipetagem e danificados ou perdidos. - Remova a gordura restante associada com o tecido do olho, pipetando a PBS para cima e para baixo agite suavemente os complexos de olho-cérebro. Nesta e em todas as etapas de lavagem subsequente, não diretamente Pipete complexos de olho-cérebro acima e para baixo como isso irá danificar o tecido do olho frágil.
- Os complexos de olho-cérebro em um volume mínimo de transferência (< 20 µ l) de PBS pelo menos 250 µ l de fixador. Misture pipetando a solução acima e para baixo. Incube durante 35 min, no gelo.
Nota: A mesma dica lubrificada, preparada na etapa 3.1.1 pode ser usada para esta transferência. - Com a mesma ponta da pipeta, transferi os complexos de olho-cérebro em um bem contendo µ l ~ 400 de PBS. Misture pipetando a solução acima e para baixo e incube durante 5-10 min no gelo, de lavar. Repita a etapa de lavagem, pelo menos duas vezes.
Nota: Complexos de olho-cérebro podem ser mantidos por várias horas na última lavagem PBS, no gelo, ou a 4 ° C, antes de prosseguir para a etapa 3.3.1.
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Mancha do anticorpo
- Para bloquear o tecido antes da exposição às soluções de anticorpo, transferi os complexos de olho-cérebro de ~ 400 µ l de PBT. Use a ponta lubrificada e uma micropipeta P20 ou P100 de deslocamento do ar para a transferência. Incube durante 10 a 60 min, no gelo.
- Prepare a solução de anticorpo primário diluindo anticorpos apropriados em PBT. Desde que os complexos de olho-cérebro são incubados em 10 alíquotas µ l da solução de anticorpo, o volume preparado será idêntico de 10.
- Alíquota 10 µ l de solução de anticorpo em um poço limpo de uma bandeja de 72 poços de microplacas (ver discussão).
- Corte a ponta de uma ponta da pipeta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a ponta-abertura de ~0.5 mm de raio e lubrificar por pipetagem PBT acima e para baixo.
- Transferência de não mais que 5 complexos de olho-cérebro, num volume de < 3 µ l de PBS, em cada 10 µ l bem de solução anticorpo usando uma micropipeta de deslocamento de ar de P10 e ponta lubrificada.
- Homogeneizar a solução anticorpo pipetando a solução acima e para baixo. Não pipete os complexos de olho-cérebro acima e para baixo como isso irá danificar o tecido.
- Para minimizar a evaporação da solução de anticorpo, coloque um pequeno pedaço de tecido embebido em água destilada na bandeja de microplacas e selar a bandeja (por exemplo, com a tampa fornecida). Incubar durante uma noite a 4 ° C.
- Transferi os complexos de olho-cérebro da bandeja de microplacas para ~ 400 µ l de PBT em um prato de vidro 9-jorrava, para lavar. Use uma micropipeta de deslocamento de ar de P10 e ponta PBT-lubrificado (preparar conforme descrito na etapa 3.3.4). Misture pipetando a solução acima e para baixo. Incube durante 5-10 min no gelo.
- Repita a etapa de lavagem, pelo menos duas vezes. Use uma ponta de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para transferir os complexos de olho-cérebro entre soluções de lavagem.
- Prepare a solução de anticorpo secundário diluindo apropriados fluoróforo-etiquetado anticorpos secundários em PBT conforme necessário. 100 µ l de solução anticorpo secundário é suficiente por lote de pupas de 6-10. Alíquota da solução de anticorpo secundário em um prato de dissecação de vidro 9-jorrava.
- Transferi os complexos de olho-cérebro para solução de anticorpo secundário. Use uma ponta de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para a transferência.
- Incubar os complexos de olho-cérebro em solução de anticorpo secundário para 1-2 h à temperatura ambiente, ou 3-5 h a 4 ° C. Para evitar o branqueamento de fluorophores pela luz, cobrir a preparação com papel alumínio.
Nota: Duração ideal de incubação em solução de anticorpo secundário pode ser diferentes de acordo com os anticorpos primários e secundários usados. - Transferi os complexos de olho-cérebro ~ 400 µ l de PBT em um prato de vidro 9-bem, para lavar. Misture pipetando a solução acima e para baixo. Incube durante 5-10 min no gelo. Esta etapa de lavagem deve ser repetida pelo menos duas vezes.
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Fixação secundária
- Para uma fixação secundária, transferir os complexos de olho-cérebro para pelo menos 200 µ l de fixador e incubar durante 20 min em temperatura ambiente ou 35 min a 4 ° C.
Nota: Fixação secundária endurece o tecido do olho, que auxilia a montagem (passo 3.5). - Use uma dica de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para transferir complexos de olho-cérebro em ~ 400 µ l de PBT em um prato de vidro 9-bem, no gelo, lavar por 5 min.
- Repita a etapa de lavagem, pelo menos uma vez.
- Uso um P20 ou micropipeta de deslocamento de ar P100 e ponta PBT-lubrificado para transferir os complexos de olho-cérebro em ~ 400 µ l de PBS em um prato de vidro 9-bem, no gelo, para enxaguar para 1-2 min. mantém o tecido em movimento por pipetagem PBS, mas não o tecido , cima e para baixo para evitar complexos de olho-cérebro de sedimentação e aderindo ao prato de vidro durante o enxaguamento PBS.
- Para uma fixação secundária, transferir os complexos de olho-cérebro para pelo menos 200 µ l de fixador e incubar durante 20 min em temperatura ambiente ou 35 min a 4 ° C.
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Montagem
- Transferi os complexos de olho-cérebro ~ 200 µ l de mídia de montagem. Use uma ponta de PBT-lubrificado e P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar para transferir os complexos de olho-cérebro. Permitir que o tecido equilibrar na mídia para 1-2 h de montagem.
- Coloque uma gota de µ l de 5-8 de mídia fresco montagem numa lâmina de microscópio limpa.
- Corte uma ponta P10 com uma lâmina de barbear limpa para aumentar a ponta-abertura de ~0.5 mm de raio e usar isto e uma micropipeta de deslocamento de ar P10 para transferir os complexos de olho-cérebro em 5-8 µ l de montagem mídia à gota de montagem de mídia no slide.
- Use duas agulhas de tungstênio para separar os olhos dos lóbulos de óptica. Pino de um olho-cérebro complexo para o slide com uma agulha de tungstênio resistente e corte cada olho longe de seu lobo óptico associado com uma agulha fina de tungstênio (Figura 2F).
- Use a agulha fina de tungstênio para manobrar cada olho para a superfície da lâmina de microscópio com a superfície basal de cada olho adjacente ao slide. Delicadamente, abaixe uma lamínula limpa sobre o tecido e fixe com esmalte.
Nota: Organizar os olhos do slide para que eles estão perto um do outro ou em uma linha facilitará microscopia subsequente. - Imagem da retina usando microscopia confocal ou fluorescente.
Nota: Slides devem ser armazenados a 4 ° C se não fotografaram imediatamente.
4. preparação do tecido do olho para a mancha ocidental:
- Dissecar as pupas de 10-16 (passos 2.1-2.9) com as seguintes modificações: a) se reúnem e dissecar as pupas em dois lotes, 10-15 min separado e b) dissecar em PBS suplementado com inibidores de protease e fosfatase (PBS + pi).
- Transferir os complexos de olho-cérebro usando um P20 ou P100 micropipeta de deslocamento de ar e lubrificado ponta (preparada como passo 3.2.1) em ~ 400 µ l de PBS + pi em um prato de vidro 9-bem, no gelo, de lavar brevemente.
Nota: Esta dica lubrificada pode ser usada para as etapas subsequentes, 4.3 e 4.4. - Repita a etapa de enxágue duas vezes.
- Transferi todos os complexos de olho-cérebro ~ 400 µ l de PBS frio gelo + pi decantado em um prato limpo preto de dissecação.
- Remova cada olho os lóbulos de óptica usando uma agulha de tungstênio resistente (para firmar o complexo de olho-cérebro) e uma fina lâmina de barbear ou microdissection tesouras de corte limpa cada olho do lobo óptico.
Nota: Os olhos são 'pegajosos' nesta fase e podem aderir levemente para o prato de dissecação. Isto é vantajoso, como ele pode ajudar a facilitar a remoção dos olhos de lóbulos óptico (ver discussão). - 'Varra' todos os olhos em uma 'pilha' na PBS + pi sobre o prato de dissecação, usando uma lâmina de um belo par de pinças.
- Corte uma ponta P10 com uma lâmina de barbear limpa para alargar a abertura-dica para ~0.5 mm de raio e lubrifique o ponta-interior por pipetagem Western tecido Lysis Buffer (WTLB) acima e para baixo.
- Transferi os complexos de olho-cérebro em 5 µ l de PBS + pi em um tubo de microcentrifugadora 500 µ l. Use esta dica lubrificada e uma micropipeta de deslocamento de ar de P10 para completar a transferência.
- Coloque o tubo de microcentrifugadora no gelo. Adicione 1 volume (5 µ l) de WTLB para a amostra e 10 µ l de buffer de amostra 2 x proteína concentrada (ou 2,5 µ l de buffer de amostra 5 x proteína concentrada). Misture batendo.
- Vórtice a microcentrifuga tubo brevemente e spin para baixo amostra utilizando uma centrífuga mini desktop.
- Armazene a amostra a-20 º C até análise. Analise usando protocolos padrão.
5. preparação do tecido do olho para extração do RNA:
- Usando luvas, bancada limpa, microscópio, instrumentos de dissecação e preto dissecando o prato primeiro com etanol a 70% e, em seguida, reagente de descontaminação de RNase. Deixe-a secar.
- Dissecar as pupas de 30-40 como descritos (passos 2.1-2.9), com as seguintes modificações: um) se reúnem e dissecar as pupas de 6 a 8 em lotes, 15-20 min distante; b) dissecar em livre de nuclease PBS e c) isolar cada lote de olhos separadamente mas acumular todo o tecido da retina no mesmo tubo microcentrifuga (passo 5.5).
Nota: Ter duas pessoas a dissecar simultaneamente irá acelerar o isolamento eficiente de tecido do olho bom. - Para cada lote, isole a complexos de olho-cérebro (passos 2.1-2.9) e a transferência em ~ 400 µ l de PBS nuclease-livre em um prato de vidro 9-poço de lavar brevemente, no gelo, utilizando uma micropipeta de deslocamento de ar P20 ou P100 e ponta lubrificada (preparado conforme descrito na etapa 3.1.2).
Nota: Esta dica lubrificada pode ser usada para as etapas subsequentes, 5.4, 5.5 e 5,8. - Repita a etapa de enxágue duas vezes.
- Transferi os complexos de olho-cérebro em uma gota fresca µ 400 l de PBS gelado nuclease-livre em um preto limpo, dissecando o prato.
- Remova cada olho os lóbulos de óptica usando uma agulha de tungstênio resistente (para firmar o olho cérebro complexo) e uma fina lâmina de barbear ou microdissection tesouras de corte limpa cada olho do lobo óptico.
Nota: Os olhos são 'pegajosos' nesta fase e podem aderir levemente para o prato de dissecação. Isto é vantajoso, como ele pode ajudar a facilitar a remoção dos olhos de lóbulos óptico (ver discussão). - 'Varra' todos os olhos em uma 'pilha' na PBS nuclease livre sobre o prato de dissecação, usando uma lâmina de um belo par de pinças.
- Transferir os olhos para um tubo estéril de microcentrifuga livre de RNase e congelam em nitrogênio líquido.
- Repita a dissecação (etapas 5,3-5,8) de cada lote de pupas. Transferência de cada lote de olhos no mesmo tubo microcentrifuga que tem sido mantido em nitrogênio líquido (passo 5.5) para acumular todos os olhos em um tubo.
- Armazene as amostras a-80 ° C até a extração do RNA.
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Representative Results
O olho pupal é um tecido facilmente acessível que serve como um excelente modelo para investigar os processos de desenvolvimento que morfogênese da unidade. Aqui, podemos ter dissecado as retinas e usado a imunofluorescência para detectar as junções adherens apical (Figura 3A, C) ou a caspase Dcp-1 (Figura 3D) que é ativada durante a apoptose (Figura 3)25. Essas abordagens permitem observar claramente as células durante processos chave morfogenéticas, incluindo o recrutamento e a morfogênese de células primárias (a partir de 18 h APF), a intercalação de treliça as células ao redor de cada omatídeo (18-24 h APF), o estabelecimento da terciário nicho (21-24 h APF), alterações no tamanho da célula e forma (de 18 a 40 h APF) e apoptose (de 18 a 33 ~ h APF). O calendário destes eventos morfogenético é dependente da temperatura e, portanto, variará modestamente em resposta a pequenas diferenças nas temperaturas de incubadora em configurações diferentes de laboratório. No entanto, por cerca de 40 h APF, a disposição final das células geralmente é alcançada (Figura 3B, C) e esta é uma idade ideal, na qual se deseja avaliar as consequências de mutação genética ou modificou a expressão gênica. Por exemplo, seguinte expressão ectópica de Diap1, um inibidor do núcleo da apoptose caspase ativação (Figura 3)26, nossa abordagem permite quantificar o consequente aumento do número de células da estrutura quando comparado a um controle GMR > lacZ retina. Um pode também facilmente avaliar apoptose mais diretamente, utilizando o anticorpo anti-Dcp-1 ou outras abordagens para detectar células morrendo (Figura 3D).
Lisado do olho pode ser interrogado usando análise ocidental para determinar a presença e/ou expressão relativa de proteínas de interesse. Aqui, mostramos a detecção de caderina, o componente do núcleo dos adherens cruzamentos, em tipo selvagem S Cantão retinas dissecado a 21 e 40 h APF olhos (Figura 4A). Quantificação desta amostra ocidental do borrão (direita, Figura 4A) revelou que a expressão relativa de caderina, não diferiu substancialmente nestes dois-pontos de tempo, quando a intensidade da banda é normalizada de acordo com a expressão de GAPDH (um núcleo enzima metabólica). Tais análises seria normalmente realizadas em três vias, em vez de apenas uma vez, como mostrado aqui.
É essencial para isolar o mRNA de alta pureza de Drosophila pupal retinas se o objetivo é analisar a expressão gênica usando aplicações de sequenciamento avançado (por exemplo, Next-Gen, RNA-seq). Encontramos que mais de 60 olhos por genótipo ou condição experimental de dissecação é ideal se o objetivo é isolar > 1 mg de RNA de alta qualidade (Figura 4B). Aqui, mostramos um exemplo de um espectro de absorbância de uma amostra de RNA isolado de 57 olhos de tipo selvagem S Cantão , dissecados em 40 h APF (Figura 4B, painel superior). A absorvência de pico em 260 nm corresponde ao comprimento de onda de absorbância de RNA. Apresentamos também uma tabela refletindo o rendimento do RNA e A260/A280 e rácios de pureza A260/A230 de seis amostras de RNA, reunidos em 21 h ou 40 h/a APF. Estes dados refletem diferenças sutis no ARN ceder quando a extração do RNA.
Figura 1 : Seleção e cultura de pupas para dissecação. (A) vagando ínstar larval terceiro (L3) larvas e pupas localizar ao longo dos lados das culturas de Drosophila saudáveis. (B) pré-pupas podem ser identificados por sua cor branca translúcida como pigmento ainda tem que ser gerado na caixa protetora pupal. Eixo anterior-posterior e dorso-ventral da pupa são mostrados em azul. Uma tala de bambu úmido é usada para desalojar e escolha pré-pupas das paredes do frasco. (C) pupas são colocadas dentro de tubos de 1,5 mL microcentrifuga que são rotulados adequadamente (genótipo, data da colheita e tempo de coleta) e (D) cultivadas dentro de uma câmara umidificada montada a partir de uma caixa vazia-ponta da pipeta. Umidade é mantida, colocando um pedaço de tecido úmido dentro da caixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Dissecando o olho pupal. (A) pupas são adere a fita dupla-face em um preto dissecando o prato. Anteriores, posteriores e dorsais coordenadas são indicadas em azul. (B) isolar complexos de olho-cérebro (um único um é mostrado aqui), (C) a pupa primeiro é removido do seu caso pupal. Passos importantes neste processo são mostrados. Linhas vermelhas indicam onde rasgar e abra a caixa do pupa depois de removido o opérculo. As pupas são então removidas do caso pupal rasgado com fórceps. Pupa (D) um exposto primeiro é cortado ao longo do tórax com tesoura microdissection (posição indicada com uma linha tracejada vermelha) e o epitélio de cabeça então cuidadosamente rasgada aberto (setas vermelhas), como mostrado em (E) para revelar o complexo opaco olho-cérebro. (F) após incubação com anticorpos adequados, as retinas são cortadas de complexos de olho-cérebro. Passos importantes neste processo são mostrados. O olho-cérebro é estabilizado com uma agulha de tungstênio resistente (à esquerda) e as retinas removido com uma agulha fina de tungstênio (à direita). Para análises de RNA e proteínas, as retinas não fixadas podem ser limpa cortadas de lóbulos de óptica usando uma fina lâmina de barbear ou tesoura microdissection, ao invés de uma agulha fina de tungstênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imunofluorescência do olho pupal. (A) anticorpos DE caderina junções de adherens apical de rótulo de células do olho pupal. Todas as imagens no painel A reuniram-se na região central de uma retina usando microscopia confocal, minimamente modificada com um software de processamento de imagem e são apresentadas na mesma escala (barra de escala = 5 µm). Observe o crescimento e rearranjo de células de 18 h APF a h 27 APF. (B) dos desenhos animados da vista apical de um único omatídeo totalmente modelados a 40 h APF (à esquerda) e um ommatidium em secção transversal. Tipos de células são codificados por cores conforme listado na chave. Os fotorreceptores são enterrados abaixo da superfície do neuroepithlium pseudoestratificado e rodeados por cone e células de pigmento. Três grupos de cerdas cercam cada omatídeo. (C) pequenas regiões de uma retina de controle no qual lacZ foi expressa (à esquerda) ou Diap1 (à direita) para inibir a apoptose de células de pigmento secundárias e terciárias. Rotulagem dos adherens cruzamentos com anti-DE-caderina permite a análise da forma, arranjo e número do celular. Imagens foram capturadas usando microscopia fluorescente padrão. (D) uma retina inteira incubada com anticorpos para ativado Dcp-1, uma caspase ativada durante a apoptose, que prunes numerosas células do olho. Imagem foi capturada utilizando microscopia confocal. Linha pontilhada branca delineia o olho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Análises de expressão da proteína e do gene do olho pupal. (A) Western blot (à esquerda) de 28 olhos dissecados 21 h APF ou 40 h/a APF, sondou com anticorpos para cad de e, como um controle de carregamento, GAPDH. Análises das intensidades de banda de proteína (direita) revela concentrações comparáveis de cad de presente nestes grupos de retinas, em relação a GAPDH. (B) espectro de absorbância única de uma amostra de RNA extraído as retinas de Cantão S dissecadas a 40 h APF (topo). Pico de absorbância nota em 260 nm. Tabela documentando os rácios de quantidade e pureza do RNA extraído as retinas pupal de Cantão S isoladas a 21 e 40 h APF (parte inferior). Estes dados resultam de três conjuntos de amostras independentes. Pupas para cada conjunto de amostra foram levantadas e incubadas nas mesmas condições e dissecadas no mesmo dia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O método de dissecação de olho pupal drosófila descrito aqui permite o isolamento de 6 a 10 complexos de olho-cérebro dentro de 10 a 15 min. No entanto, paciência e prática são essenciais para dominar a técnica de dissecação e melhorar a qualidade e a velocidade de dissecações. Desta vez de dissecação curto garante que cada olho é aproximadamente mesmo fase de desenvolvimento, reduzindo a variabilidade na expressão do fenótipo ou gene de retina em um conjunto de dados. Enquanto protocolos alternativos podem exigir menos prática para mestre, nosso protocolo é projetado para isolar metodicamente o delicado tecido da retina, minimizando o risco de rasgar ou ruptura, porque os danos ao olho poderiam induzir stress via ativação ou mesmo morte celular. Aconselhamos a iniciantes para o primeiro mestre a dissecação de pupas cultivadas para 40 h APF antes de tentar dissecar olhos mais jovens. Recomendamos configurar replicar cruza para todos os experimentos (etapa 1.1), que irão garantir que há sempre pupas suficientes disponíveis para coleta (etapa 1.3). As retinas podem ser dissecadas em vários momentos durante o desenvolvimento pupal, dependendo os eventos distintos morfogenéticas de interesse para o pesquisador. Estes podem incluir o recrutamento e a morfogênese de células primárias (a partir de 18 h APF), intercalação de células retículo (18-24 h APF), estabelecimento do nicho terciário (21-24 h APF), alterações no tamanho da célula e forma (de 18 a 40 h APF) e apoptose (de 18 a 33 ~ h APF) (Figura 3A).
Se durante a abertura inicial do caso pupal (passo 2.2, Figura 2), o tórax de uma pupa é perfurado, o pesquisador deve ser capaz de prosseguir com a dissecação. No entanto, se a cabeça é inicialmente perfurada, extrair complexos de olho-cérebro danificado pode ser difícil. Ao remover uma pupa do seu caso pupal (etapa 2.3, Figura 2, painel direito), o caso de pupa abdominal às vezes pode desalojar da fita dupla-face e permanecem embrulhado sobre o abdome da pupa. Isso é improvável um obstáculo, embora a pupa pode flutuar quando cercado por PBS até o abdômen e anexado caso pupa são separadas da pupa (passo 2.6). Para preservar a integridade do tecido da retina, é imperativo que é fixo ou congelado mais rapidamente possível após a punção inicial das pupas. Além disso, usando soluções geladas e manter o tecido no gelo (ou a 4 ° C), sempre que possível em todo o protocolo irá preservar o tecido e a integridade celular, levando a melhor imunofluorescência, análise de proteínas ou RNA-análise. Para as aplicações este último, é importante remover todo o cérebro e o tecido gordo de olhos como estes tecidos vai contaminar análises (passo 2.9 e 4.3 ou 5.4).
O complexo de pupa de olho-cérebro pode aderir a dissecação, vidro e pontas de pipetas sem lubrificação ferramentas quando unfixed ou durante lavagens de PBS/lavagens, levando a dano tecidual. Para evitar isso, recomendamos a lubrificação meticulosa de pontas de pipetas e não lavar pratos de vidro 9-poço com etanol (sabão do prato também deve ser evitado). Em vez disso, simplesmente limpar pratos de vidro com água destilada H2O e lubrifique, se necessário, com uma lavagem PBT antes de usar. Agulhas, tesoura e pinça de dissecação devem também ser principalmente limpa com água destilada H2O, exceto quando preparar estes para extração de RNA-as dissecções (etapa 5.1). No entanto, luz adesão entre as retinas e vidro corrediças do microscópio pode ajudar unfurling olhos e posicionando-os em slides quando separar olhos de lóbulos óptica durante a montagem (etapa 3.5.4 e 3.5.5). Da mesma forma, aderência luz dos olhos de preto dissecando pratos pode ser usada para achatar e muito ligeiramente estiramento do tecido que facilita o rompimento limpo de conexões óptica olho lobo quando isolando as retinas para proteína ou RNA analisa (etapa 4.5 e 5.6). Encontramos que microdissection tesoura ou uma lâmina de barbear bem são excelentes ferramentas para rapidamente e de forma limpa cleave unfixed olhos de lóbulos de óptica.
Durante a mancha do anticorpo primário, ao invés de incubação complexos de olho-cérebro em bandejas de 72-bem micro (etapa 3.3.5), um prato de vidro 9-bem pode ser usado. Para evitar a evaporação da solução anticorpo durante a noite, certifique-se de tapar os poços do prato de vidro com uma lamela ou slide. No entanto, esta abordagem exigirá 40-50 µ l de solução de anticorpo primário para um lote de 6-10 olho-cérebro complexos incubada em um poço de prato de vidro 9-bem, ao invés de 20 µ l de solução de anticorpo primário distribuída entre 2 poços de uma bandeja de 72-bem micro.
Fixação secundária de complexos de olho-cérebro (passo 3.4) antes de montar os olhos em corrediças do microscópio (passo 3.5) marginalmente endurecerá o tecido para que seja mais fácil cravar os olhos de lóbulos de óptica e os olhos são menos propensos a dobrar ou aderir às agulhas de dissecação. Após uma incubação de 1-2h em meio de montagem (etapa 3.5.1), os complexos de olho-cérebro tornar-se um pouco opaco e, portanto, mais fácil de ver, enquanto a montagem. Além disso, depois de 1-2h em meio de montagem, a maioria dos anticorpos secundários serão devidamente protegidos da foto-branqueamento durante a imagem latente fluorescente. Incubar as retinas pernoitar na mídia de montagem antes de montagem não é recomendada, pois isso torna as retinas macio, eliminando o efeito de enrijecimento da fixação secundária.
Para análises ocidentais, o lisado pelo menos 20 olhos é necessária para detectar confiavelmente proteínas usando anticorpos que reconhecem robustamente Drosophila proteínas (por exemplo, Figura 4A). No entanto, um maior número de olhos pode ser necessário se houver baixa expressão da proteína alvo de interesse. Se a lise do tecido para a mancha ocidental subsequente é incompleto (passo 4.7), o volume de WTLB adicionado à amostra pode ser aumentado marginalmente e o volume de tampão de amostra concentrada ajustado em conformidade (etapa 4.9). Para a extração de RNA, dissecação rápida de um número significativo de olhos pode ser necessária se o objetivo é isolar uma grande quantidade de RNA de alta qualidade (passo 5.2, veja Figura 4B). Este potencial inconveniente pode ser superado se dois cientistas, que dominaram a dissecação de pupa-olho de Drosophila colaboram para dissecar esses grandes números de retina voar simultaneamente. No entanto, o montante total do RNA necessário dependerá as exigências da instituição ou instalações, realizando análise de RNA, o tipo de análise de RNA ou sequenciamento e o kit de extração de RNA que é usado.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Zack tambor e nossos revisores para comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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