Summary
Cet article présente une méthode chirurgicale dissection Drosophila pupes rétines ainsi que de protocoles pour le traitement du tissu pour l’immunohistochimie, l’Ouest analyse et extraction de l’ARN.
Abstract
La rétine de pupes de Drosophila fournit un système excellent modèle pour l’étude des processus morphogénétiques pendant le développement. Dans cet article, nous présentons un protocole fiable pour la dissection de la rétine de pupes de Drosophila délicate. Notre approche chirurgicale utilise des outils de microdissection facilement disponibles pour ouvrir des pupes et extraire précisément complexes de l’oeil-cerveau. Ces peuvent être fixe, soumis à l’immunohistochimie et rétines puis montés sur lames de microscope et imagés si l’objectif est de détecter les structures cellulaires ou infracellulaires. Alternativement, interprétations rétines peuvent être isolées du tissu cérébral, lysées dans les tampons appropriés et utilisés pour gel électrophorèse ou ARNm extraction de protéine (évaluer l’expression de protéines ou de gènes, respectivement). Patience et pratique importante est requise pour maîtriser le protocole de microdissection décrit, mais une fois maîtrisé, le protocole permet d’isolement relativement rapide des rétines essentiellement intacts.
Introduction
La rétine de la drosophile est composée d’environ 750 ommatidies entourés de cellules pigmentaires disposés en nid d’abeilles trellis1,2,3,4. Chaque Ommatidie contient les neurones photorécepteurs huit, quatre cellules de cône sécrétant des lentilles et deux cellules de pigment primaires. Entourant chaque Ommatidie est les cellules productrices de pigment de treillis et de groupes de soies sensorielles. En raison de sa nature post-mitotique et stéréotypée arrangement hexagonal, la rétine de pupes de Drosophila fournit un système d’excellent modèle pour l’étude des processus morphogénétiques dont cell adhesion5,6, 7,8,9,10 et apoptose11,12,13,14,15.
Plusieurs protocoles publiés utilisent la pression d’air pour extraire des complexes de l’oeil-cerveau de Drosophila nymphes16,17,18. Le protocole décrit ici plutôt utilise microdissection outils soigneusement et isoler précisément complexes de l’oeil-cerveau dans le but d’obtenir des tissus rétiniens intact. Cela est crucial si les rétines ne doivent être utilisées pour morphologiques, protéine, ou l’expression des gènes analyse puisque la rétine peut endommager le stress cellulaire ou la mort, qui pourrait modifier l’expression de phénotype ou gène cellulaire. En outre, après l’entraînement, complexes d’oeil-cerveau de 6 à 10 peuvent être isolés dans 10 à 15 min, facilitant le but de réduire au minimum la variabilité dans l’âge et le stade de développement du tissu oculaire disséqués.
La fixation et immunostaining entier-montez le protocole décrit ci-dessous convient pour la préparation des yeux de drosophile pour la microscopie de fluorescence. Rétines peuvent être incubées avec l’anticorps ciblant les protéines d’intérêt. Par exemple, anticorps dirigés contre des composants de jonction adherens peut être utilisé pour visualiser les circonférences apicales des cellules pour que les caractéristiques y compris le type de cellule, forme et la disposition peuvent être mises en recouvrement19. Avant la fixation, les yeux peut plutôt être clivé du cerveau aux fins d’extraction de protéine pour l’analyse de l’ouest, ou ARN devant servir à qRT-PCR ou RNA-sequencing.
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Protocol
1. préparation du tissu
- Mise en place de Drosophila traverse (comme décrit plus haut20) ou la culture de certaines souches de Drosophila afin d’obtenir des nymphes du génotype désiré. Pour s’assurer qu’un grand nombre de nymphes émergence soit dit en passant, mettre en place ces cultures voler en double sur les médias d’aliments riches en nutriments ou norme alimentaire généreusement additionnée de levure-pâte.
- Maintenir les cultures de la drosophile à 25 ° C. Pour les croisements utilisant le système de GAL4-UAS, GMR-GAL4 est un pilote idéal exprimé dans des cellules de le œil larvaire disque postérieurs du sillon morphogénétique et tout au long de la pupe développement21,22,23, 24. la croix SAMU-lacZ X GMR-GAL4 sert un contrôle idéal cross comme il pousse l’expression de la protéine β-galactosidase non endogènes et inerte.
- Utiliser la pointe d’une tige de bambou 6" qui a été mouillée à l’eau distillée pour soulever des pupes avant blancs (Figure 1 b) du côté de flacons de culture sain (Figure 1 a) délicatement et placer dans un tube de microtubes de 1,5 mL (Figure 1).
- Placer les tubes dans une boîte de pointe de pipette en plastique avec un petit morceau de tissu imbibé d’eau distillée afin de maintenir la chambre à une humidité suffisante pour protéger les pupes de dessiccation (Figure 1). Incuber les pupes à 25 ° C jusqu'à la dissection.
- Utilisez une attelle de bambou sec 6" pour pousser doucement la pupe du tube de microcentrifuge et sur un noir plat de dissection. Posez un morceau frais de ruban adhésif double-face sur le plat de dissection de la pupe.
- À l’aide d’une paire de pinces, placer soigneusement la face dorsale de pupes vers le haut (c'est-à-dire, les opercules vers le haut, Figure 1 b) sur le ruban adhésif (Figure 2 a). Veiller à ce que les nymphes adhèrent parfaitement à la bande.
Remarque : L’humidité sur la pupe sera inhibent l’adhésion sécurisée sur la bande, auquel cas, permettre les pupes sécher avant de les placer sur le ruban double-face à.
2. dissection de l’oeil-cerveau Complexes
- Utiliser les pinces pour enlever l’opercule de chaque chrysalide (Figure 2).
- Utiliser des ciseaux de microdissection à trancher ou couper la pupe de chaque chrysalide. Rabat ouvert la pupe de révéler la tête, le thorax et le segment abdominal antérieur, sécurisation des bords de la pupe à l’adhésif double face (Figure 2).
Remarque : Il n’est pas nécessaire de révéler entièrement les pupes. - Percer l’abdomen de chaque chrysalide avec une forte pince, pour saisir l’animal et de retirer de sa pupe (Figure 2).
- Placez les pupes sur le plat de dissection noir, loin de la bande et couvrir avec environ 400 µL de glacee-tampon-solution de phosphate (PBS, pH 7,4).
- Saisir chaque chrysalide de l’abdomen avec pinces et ciseaux de microdissection, faites une coupe propre transversale à travers le thorax entier, coupant la chrysalide en demi (Figure 2D).
- Retirez le vestige postérieur de chaque carcasse du PBS et mettre de côté sur le plat de dissection (ne pas jeter, reportez-vous à l’étape 3.2.1).
- À l’aide de deux paires de pinces fines, ouvrir le thorax et la tête de chaque chrysalide pour révéler le complexe de l’oeil-cerveau (Figure 2E). Pour ce faire, saisissez les coupe-bords de l’épithélium du thorax et peu à peu se déchirer pour ouvrir le thorax et la tête puis capsule, exposant ainsi le tissu graisseux oeil-cerveau complexe et les environs.
- Sans saisir le tissu, utiliser le forceps pour guider le complexe de l’oeil-cerveau loin les restes de la capsule céphalique ou évider le complexe de l’oeil-cerveau de la capsule céphalique ouvert déchiré.
NOTE : Le complexe de l’oeil-cerveau est en forme d’haltère, blanc cassé et plus translucide que la graisse environnante de couleur crème (Figure 2 b, E). - Avec une pince, retirer délicatement la plupart gras associés avec les complexes de l’oeil-cerveau sans toucher les tissus oculaires.
3. le traitement du tissu pour l’Immunofluorescence
- Disséquer les pupes d’au moins 6 à 10 comme décrits (étapes 2.1-2,9).
NOTE : Trois ou quatre réplicats indépendantes de chaque dissection tendent à produire suffisamment de données pour tester une hypothèse. -
Lavage et Fixation
- Couper l’extrémité d’un P20 ou P100 de pipette avec une lame de rasoir propre à accroître l’ouverture pointe à environ 1 mm de rayon et lubrifier en pipettant également, un mélange de PBS et de gras vers le haut et en bas. Cette graisse peut provenir des restes de carcasse retirées au point 2.6.
- Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBS dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace. Utiliser la pointe lubrifiée et une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 pour transférer.
NOTE : Complexes de l’oeil-cerveau seront respecter des conseils non lubrifiés pendant le pipetage et endommagés ou perdus. - Enlever le gras restant associé avec les tissus de le œil en pipettant également, le PBS haut et bas pour agiter doucement les complexes de l’oeil-cerveau. En cela et toutes les étapes de lavage ultérieure, ne pas directement pipetter complexes de l’oeil-cerveau de haut en bas car cela endommagerait les tissus de le œil fragile.
- Les complexes de l’oeil-cerveau dans un volume minimal de transfert (< 20 µL) de PBS au moins 250 µL de fixatif. Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas. Incuber pendant 35 min, sur la glace.
Remarque : La pointe lubrifiée même préparée à l’étape 3.1.1 peut être utilisée pour ce transfert. - Avec la même pipette, transvaser les complexes de l’oeil-cerveau dans un bien contenant ~ 400 µL de PBS. Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas et incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace, se laver. Répétez l’étape de la laver au moins deux fois.
Remarque : Les complexes de l’oeil-cerveau peuvent être maintenus pendant plusieurs heures dans le lavage final de PBS, sur glace ou à 4 ° C, avant de passer à l’étape 3.3.1.
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Anticorps
- Pour bloquer le tissu avant des exposer aux solutions d’anticorps, transférer les complexes de l’oeil-cerveau à ~ 400 µL de PBT. Utiliser la pointe lubrifiée et une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 pour le transfert. Incuber pendant 10 à 60 minutes, sur la glace.
- Préparer la solution d’anticorps primaire en diluant anticorps appropriés en PBT. Complexes de l’oeil-cerveau sont incubés à 10 µL d’extraits de solution d’anticorps, le volume préparé sera une adaptation de 10.
- Aliquote de 10 µL de solution d’anticorps dans un bien propre d’un plateau de 72 puits microwell (voir discussion).
- Couper l’extrémité d’une pointe de pipette P10 avec une lame de rasoir propre à accroître l’ouverture pointe à ~0.5 mm de rayon et lubrifier par pipetage PBT de haut en bas.
- Pas plus de 5 complexes d’oeil-cerveau, dans un volume de transfert < 3 µL de PBS, dans chaque 10 µL de solution d’anticorps à l’aide d’une micropipette de déplacement aérien P10 et la pointe lubrifiée.
- Homogénéiser la solution d’anticorps en pipettant également la solution de haut en bas. Ne pas pipeter les complexes de l’oeil-cerveau de haut en bas, car cela endommagerait le tissu.
- Pour minimiser l’évaporation de la solution d’anticorps, placer un petit morceau de tissu imbibé d’eau distillée dans le bac de micropuits et sceller la barre d’État (par exemple, avec le couvercle fourni). Incuber une nuit à 4 ° C.
- Transférer les complexes de l’oeil-cerveau du plateau microwell dans ~ 400 µL de PBT dans un plat en verre 9-sourdait, se laver. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P10 et embout PBT-lubrifié (préparer comme indiqué au point 3.3.4). Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas. Incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace.
- Répétez l’étape de la laver au moins deux fois. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau entre solutions de lavage.
- Préparer la solution d’anticorps secondaire en diluant appropriés fluorophore-tag anticorps secondaires en PBT tel que requis. Il suffit de 100 µL de solution d’anticorps secondaire par lot de 6-10 chrysalides. Partie aliquote de la solution d’anticorps secondaire dans un plat en verre 9-sourdait dissection.
- Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans la solution d’anticorps secondaire. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour le transfert.
- Incuber les complexes de l’oeil-cerveau dans la solution d’anticorps secondaire pendant 1-2 h à température ambiante, ou 3-5 h à 4 ° C. Pour empêcher le blanchiment de fluorophores par la lumière, couvrir la préparation avec une feuille.
Remarque : La durée optimale d’incubation dans une solution d’anticorps secondaire peut varier selon les anticorps primaires et secondaires utilisés. - Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBT dans un plat en verre de 9 puits, se laver. Mélanger en pipettant également la solution de haut en bas. Incuber pendant 5 à 10 minutes sur la glace. Cette étape de lavage doit être répétée au moins deux fois.
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Fixation secondaire
- Pour une fixation secondaire, transférer les complexes de l’oeil-cerveau au moins 200 µL de fixateur et incuber pendant 20 min à température ambiante ou à 35 min à 4 ° C.
Remarque : La fixation secondaire raidit le tissu oculaire, ce qui facilite le montage (étape 3.5). - Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour transférer des complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBT dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace, se laver pendant 5 min.
- Répétez l’étape de la laver au moins une fois.
- Utiliser un P20 ou P100 micropipette de déplacement aérien et embout PBT-lubrifié pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBS dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace, de rincer pendant 1-2 min. gardent le tissu en mouvement par pipetage PBS, mais pas le tissu , haut et bas pour éviter les complexes de l’oeil-cerveau de décantation et respectant le plat en verre au cours de PBS-rinçage.
- Pour une fixation secondaire, transférer les complexes de l’oeil-cerveau au moins 200 µL de fixateur et incuber pendant 20 min à température ambiante ou à 35 min à 4 ° C.
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Montage
- Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 200 µL de supports de montage. Utiliser une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et embout PBT-lubrifié pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau. Laisser le tissu s’équilibrer dans les médias pendant 1-2 h de montage.
- Déposer une goutte µL 5-8 de supports de montage fraîche sur une lame de microscope propre.
- Couper un bout de P10 avec une lame de rasoir propre à accroître l’ouverture pointe à ~0.5 mm de rayon et utiliser ceci et une micropipette de déplacement aérien P10 pour transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans 5-8 µL de montage des médias dans la baisse du support de montage sur la diapositive.
- Deux aiguilles de tungstène permet de séparer les yeux des lobes optiques. Épingler un complexe oeil-cerveau à la diapositive avec une aiguille de tungstène robuste et trancher chaque oeil loin de son lobe optique associée avec une aiguille fine tungstène (Figure 2F).
- Utilisez l’aiguille fine de tungstène de manœuvre de chacun des deux yeux à la surface de la lame de microscope avec la surface terrière de chaque œil adjacent à la diapositive. Doucement baisser une lamelle couvre-objet propre sur le tissu et fixer avec les vernis à ongles.
NOTE : Organiser les yeux sur la diapositive pour qu’ils soient proches ou en ligne facilitera la microscopie ultérieure. - Images de la rétine à l’aide de la microscopie fluorescente ou confocale.
NOTE : Diapositives doivent être conservées à 4 ° C sinon imagés immédiatement.
4. préparation du tissu oculaire pour éponger occidental :
- Disséquer les pupes de 10-16 (étapes 2,1 à 2,9) avec les modifications suivantes : a) recueillir et disséquer les nymphes en deux lots, 10-15 min apart et b) découpent dans du PBS additionné d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (PBS + pi).
- L’oeil-cerveau complexes à l’aide d’un P20 de transfert ou P100 micropipette de déplacement de l’air et lubrifié pointe (préparé comme au point 3.2.1) en ~ 400 µL de PBS + pi dans un plat en verre de 9 puits, sur la glace, de rincer brièvement.
NOTE : Cette astuce lubrifiée peut être utilisée pour les étapes suivantes 4.3 et 4.4. - Répéter deux fois l’étape de rinçage.
- Transférer tous les complexes de l’oeil-cerveau dans ~ 400 µL de PBS froid glace + pi décanté sur un plat de dissection propre noir.
- Retirez les lobes optiques en utilisant une aiguille solide de tungstène (pour stabiliser le complexe de l’oeil-cerveau) de chaque oeil et une fine lame de rasoir ou de la microdissection ciseaux pour couper proprement chaque œil du lobe optique.
Remarque : Les yeux est « collantes » à ce stade et peut adhérer légèrement à la dissection plat. C’est avantageuse car elle peut aider à faciliter le retrait des yeux des lobes optiques (voir discussion). - « Balayer » tous les regards dans une « pile » dans le PBS + pi sur le plat de dissection, à l’aide d’une lame d’une belle paire de pinces.
- Couper un bout de P10 avec une lame de rasoir propre d’élargir l’ouverture pointe à ~0.5 mm de rayon et lubrifier l’astuce-intérieur de pipetage Western tissu Lysis Buffer (WTLB) en haut et en bas.
- Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans 5 µL de PBS + pi dans un tube de microcentrifuge 500 µL. Utilisez cette astuce lubrifiée et une micropipette de déplacement aérien P10 pour effectuer le transfert.
- Placer le tube de microcentrifuge sur glace. Ajouter 1 volume (5 µL) de WTLB à l’échantillon et 10 µL de tampon 2 x concentré de protéine (ou 2,5 µL de tampon concentré de protéine x 5). Mélanger en tapotant.
- Vortex la microcentrifugeuse tube brièvement, puis tourner vers le bas de l’échantillon à l’aide d’une mini-centrifugeuse de bureau.
- Conserver l’échantillon à-20 ° C jusqu'à l’analyse. Analyser à l’aide de protocoles standard.
5. préparation du tissu oculaire pour l’Extraction de l’ARN :
- Porter des gants, paillasse propre, microscope, outils de dissection et noir dissection plat tout d’abord avec l’éthanol à 70 %, puis de réactif de décontamination de RNase. Laisser pour sécher.
- Disséquer les 30-40 nymphes comme décrits (étapes 2,1 à 2,9) avec les modifications suivantes : un) se rassemblent et disséquer les pupes de 6 à 8 par lots, 15-20 min d’intervalle ; b) disséquer exempte de nucléase PBS et c) isoler chaque lot d’yeux séparément mais accumuler le tissu rétinien tous dans le même tube de microcentrifuge (étape 5.5).
NOTE : Ayant deux personnes à disséquer simultanément s’accélérera isolation efficace des tissus bon oeil. - Pour chaque lot, isoler les oeil-cerveau complexes (étapes 2,1 à 2,9) et le transfert en ~ 400 µL de PBS exempte de nucléase dans un plat en verre de 9 puits de rincer brièvement, sur la glace, à l’aide d’une micropipette de déplacement aérien P20 ou P100 et astuce lubrifié (préparé comme indiqué au point 3.1.2).
NOTE : Cette astuce lubrifiée peut être utilisée pour les étapes suivantes 5.4, 5.5 et 5.8. - Répéter deux fois l’étape de rinçage.
- Transférer les complexes de l’oeil-cerveau dans une goutte de frais 400 µL de PBS d’exempte de nucléase glacée sur un propre noir plat de dissection.
- Retirer les lobes optiques utilisant une aiguille de tungstène robuste (pour stabiliser le cerveau oeil complex) de chaque oeil et une fine lame de rasoir ou de la microdissection ciseaux pour couper proprement chaque œil du lobe optique.
Remarque : Les yeux est « collantes » à ce stade et peut adhérer légèrement à la dissection plat. C’est avantageuse car elle peut aider à faciliter le retrait des yeux des lobes optiques (voir Discussion). - « Balayer » tous les regards dans une « pile » dans du PBS exempte de nucléase sur le plat de dissection, à l’aide d’une lame d’une belle paire de pinces.
- Transférer les yeux dans un tube de microcentrifuge stérile RNase-libre et flash-congélation dans l’azote liquide.
- Répétez la dissection (étapes 5.3-5,8) de chaque lot de pupes. Transférer chaque lot d’yeux dans le même tube de microcentrifuge qui a été conservé dans l’azote liquide (étape 5.5) d’accumuler tous les regards dans un tube.
- Conserver les échantillons à-80 ° C jusqu'à l’extraction de l’ARN.
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Representative Results
Le œil nymphal est un tissu facile d’accès qui sert un excellent modèle pour étudier les processus de développement de la morphogenèse de ce lecteur. Ici, nous avons disséqué les rétines et immunofluorescence permettant de détecter les jonctions adherens apicale (Figure 3 a, C) ou la caspase Dcp-1 (Figure 3D) qui est activé au cours de l’apoptose (Figure 3)25. Ces approches permettent d’observer clairement des cellules au cours de processus morphogénétiques clés, y compris le recrutement et la morphogenèse des cellules primaires (à partir de 18 h CSA), l’intercalation du réseau de cellules autour de chaque Ommatidie (18-24 h CSA), la mise en place de la niche tertiaire (21-24 h CSA), les changements dans la taille des cellules et forme (à partir de 18 h à 40 h CSA) et de l’apoptose (de 18 à 33 ~ h CSA). Le calendrier de ces événements morphogénétiques est dépendante de la température et varie donc modestement en réponse à des différences mineures dans les températures d’incubateur dans différents laboratoires. Toutefois, environ 40 h CSA, la disposition finale des cellules est habituellement obtenue (Figure 3 b, C) et c’est un âge idéal à partir duquel doit évaluer les conséquences d’une mutation génétique ou modifié l’expression des gènes. Par exemple, suivant l’expression ectopique de Diap1, un inhibiteur de la base de l’apoptose caspase activation (Figure 3)26, notre approche permet de quantifier l’augmentation conséquente du nombre de cellules de grille par rapport à un contrôle GMR > lacZ rétine. On peut aussi facilement évaluer l’apoptose plus directement en utilisant l’anticorps anti-Dcp-1 ou autres approches pour détecter les cellules mourantes (Figure 3D).
Oeil de lysat peut être interrogée à l’aide de l’Ouest analyse pour déterminer la présence et/ou l’expression relative de protéines d’intérêt. Ici, l’élément central de jonctions adherens, dans la rétine de S Canton de type sauvage, nous montrons la détection de la DE-cadhérine, disséqué à 21 et 40 h CSA yeux (Figure 4 a). Quantification de la tache occidentale de cet échantillon (à droite, Figure 4 a) a révélé que l’expression relative de la DE-cadhérine, ne diffèrent pas substantiellement à ces deux moments, quelle intensité de bande est normalisée selon l’expression de GAPDH (un noyau enzymes métaboliques). Ces analyses seraient habituellement effectués en triple plutôt que juste une fois, comme illustré ici.
Il est essentiel d’isoler les ARNm de haute pureté de Drosophila rétines pupes si son objectif est d’analyser l’expression des gènes en utilisant des applications avancées de séquençage (Next-Gen, RNA-seq). Nous avons trouvé que plus de 60 yeux par génotype ou de la condition expérimentale de dissection est optimal si son but est d’isoler > 1 mg de l’ARN haute qualité (Figure 4 b). Ici, nous montrons un exemple d’un spectre d’absorbance d’un échantillon de RNA isolés de 57 yeux S Canton de type sauvage, disséqué à 40 h CSA (Figure 4 b, panneau supérieur). L’absorbance de pic à 260 nm correspond à la longueur d’onde d’absorbance de l’ARN. Nous présentons un tableau illustrant le rendement RNA et A260/A280 et ratios de pureté A260/A230 de six échantillons d’ARN, que se sont réunis à 21 h ou 40 h CSA. Ces données reflètent des différences subtiles dans l’ARN rendement lors de l’extraction des RNA.
Figure 1 : Sélection et la culture des pupes de dissection. (A) errant de larves de troisième stade larvaire (L3) les larves et les nymphes localiser le long des côtés des cultures saines de drosophile . (B) les nymphes sont reconnaissables par leur couleur blanche translucide comme pigment n’a pas encore généré dans l’étui de pupe. Un axe antérieur-postérieur et dorsale-ventral de la nymphe sont indiqués en bleu. Une attelle de bambou humide sert à déloger et choisir des pupes avant des murs flacon. Chrysalide (C) est placés à l’intérieur des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL qui sont étiquetés de manière appropriée (génotype, date du prélèvement et moment de la collecte) et (D) cultivés à l’intérieur une chambre humidifiée Assemblée à partir d’une boîte vide-l’embout de la pipette. Humidité est maintenue en plaçant un morceau de tissu humide à l’intérieur de la boîte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Dissection de le œil pupal. Nymphes (A) sont respectées, ruban adhésif double-face sur un fond noir plat de dissection. Coordonnées antérieures, postérieures et dorsales sont indiquées en bleu. (B) pour isoler les complexes de l’oeil-cerveau (une seule est illustré ici), (C), la chrysalide est tout d’abord retiré de sa pupe. Des mesures importantes dans ce processus sont indiqués. Les lignes rouges indiquent où se déchirer et ouvrir la pupe après avoir retiré l’opercule. Les pupes sont ensuite éliminés de la pupe déchiré avec une pince. Chrysalide (D) exposé est d’abord coupée le long du thorax avec la microdissection ciseaux (position indiquée par la ligne rouge en pointillés) et l’épithélium tête puis soigneusement éventré (flèches rouges), comme montré dans (E) pour révéler le complexe opaque oeil-cerveau. (F) après l’incubation avec l’anticorps appropriés, les rétines sont découpés en tranches de complexes de l’oeil-cerveau. Des mesures importantes dans ce processus sont indiqués. L’oeil-cerveau est stabilisé avec une aiguille de tungstène robuste (à gauche) et les rétines enlevé avec une aiguille fine tungstène (à droite). Pour les protéines et les analyses en RNA rétines interprétations peuvent être coupées proprement des lobes optiques à l’aide d’une fine lame de rasoir ou de ciseaux de microdissection, plutôt que d’une aiguille fine tungstène. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Immunofluorescence de le œil pupal. (A) anticorps anti-DE-cadhérine étiquette adherens apicale jonctions des cellules de le œil de pupe. Toutes les images dans le groupe A ont été recueillies dans la région centrale de la rétine à l’aide de la microscopie confocale, très peu modifiée avec un logiciel de traitement d’image et sont présentées à la même échelle (échelle graphique = 5 µm). Noter la croissance et le réarrangement des cellules de 18 h CSA à 27 h CSA. (B) dessin animé de la vue apicale d’une Ommatidie entièrement à motif unique à 40 h CSA (à gauche) et une Ommatidie en coupe transversale. Types de cellules sont des pays figurant dans la clé. Les photorécepteurs sont enfouis sous la surface de la neuroepithlium pseudostratifié et entourés par les cônes et les cellules pigmentaires. Trois groupes de poils entourent chaque Ommatidie. (C) petites régions de la rétine de contrôle dans lequel lacZ était exprimé (à gauche) ou Diap1 (à droite) pour inhiber l’apoptose des cellules pigmentaires secondaires et tertiaires. Étiquetage des jonctions adherens avec anti-DE-cadhérine permet l’analyse du nombre de cellules, arrangement et la forme. Des images ont été capturés à l’aide de la microscopie fluorescente standard. (D) une rétine entière incubée avec l’anticorps anti-activé Dcp-1, une caspase activé pendant l’apoptosis, qui émonde les nombreuses cellules de le œil. Image a été capturée à l’aide de la microscopie confocale. En pointillé blanc expose l’oeil. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyses d’expression protéique et gène de le œil pupal. (A) la tache occidentale (à gauche) de 28 yeux disséqué à 21 h CSA ou 40 h CSA, hybridés avec des anticorps à la CAO et, comme un contrôle de chargement, GAPDH. Analyses des intensités de bande de protéine (droite) révèle des concentrations comparables de dé-cad présents dans ces groupes des rétines, par rapport à GAPDH. Spectre d’absorbance unique (B) d’un échantillon de RNA extrait de rétines Canton S disséqués à 40 h CSA (en haut). Pic d’absorbance remarque à 260 nm. Table documentant les rapports de quantité et de la pureté de l’ARN extrait des rétines pupes Canton S isolés 21 et 40 h CSA (en bas). Ces données proviennent de trois ensembles d’échantillons indépendants. Nymphes pour chaque ensemble d’échantillons ont été soulevés et incubés dans les mêmes conditions et disséqués le jour même. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La méthode de dissection de pupes oeil Drosophila décrite ici permet l’isolement des complexes d’oeil-cerveau 6 à 10 de 10 à 15 min. Cependant, patience et pratique sont indispensables afin de maîtriser la technique de dissection et d’améliorer la qualité et la rapidité des dissections. Ce temps de dissection court s’assure que chaque oeil est approximativement le même stade de développement, réduisant la variabilité dans l’expression de phénotype ou gène des rétines dans un ensemble de données. Tandis que d’autres protocoles peuvent nécessiter moins pratique au maître, notre protocole est conçu pour isoler méthodiquement délicat tissu rétinien tout en minimisant le risque de déchirure ou de cisaillement, parce que les dommages aux yeux pourraient induire l’activation de voie de stress ou même mort cellulaire. Nous conseillons les débutants au premier maître la dissection des pupes cultivées à 40 h CSA avant de tenter de disséquer les yeux plus jeune. Nous recommandons la mise en place de réplication traverse pour toutes les expériences (étape 1.1) qui vont à ce qu’il y a toujours des pupes suffisamment disponible pour collection (étape 1.3). Rétines peuvent être disséqués à divers intervalles au cours du développement de pupe, selon les événements morphogénétiques distincts d’intérêt pour le chercheur. Ceux-ci peuvent inclure le recrutement et la morphogenèse des cellules primaires (à partir de 18 h CSA), intercalation de cellules de treillis (18-24h APF), mise en place de la niche tertiaire (21-24 h CSA), changements dans la taille des cellules et la forme (à partir de 18 h à 40 h CSA) et de l’apoptose (de 18 à 33 ~ h CSA) (Figure 3 a).
Si au cours de l’ouverture initiale de la pupe (étape 2.2, Figure 2), le thorax d’une nymphe est percé, le chercheur soit encore en mesure de procéder à la dissection. Toutefois, si la tête est initialement percée, extraction des complexes de l’oeil-cerveau intact peut être difficile. En enlevant une nymphe de sa pupe (étape 2.3, Figure 2, panneau de droite), la pupe abdominal peut parfois déloger de l’adhésif double face et rester enveloppé sur l’abdomen de la chrysalide. C’est probablement pas un obstacle, bien que la nymphe peut flotter lorsqu’entourée de PBS jusqu'à l’abdomen fixé pupe sont dissociées de la nymphe (étape 2.6). Afin de préserver l’intégrité du tissu rétinien, il est impératif qu’il est fixe ou congelé aussi rapidement que possible après la piqûre initiale de la pupe. En outre, grâce aux solutions glacées et maintenir le tissu sur la glace (ou à 4 ° C) dans la mesure du possible tout au long du protocole pour préserver le tissu et l’intégrité cellulaire, conduisant à l’immunofluorescence mieux, analyse des protéines ou RNA-analyse. Pour les applications de ce dernier, il est important d’enlever tous les cerveau et les tissus adipeux des yeux comme ces tissus finira par contaminer les analyses (étape 2,9 et 4,3 ou 5.4).
Le complexe de pupes oeil-cerveau peut adhérer à la dissection, de verre et de pointes de pipette non lubrifié outils lorsque fixées ou lors de lavages/rinçages de PBS, conduisant à des lésions tissulaires. Pour éviter cela, nous vous recommandons de lubrification minutieuse des pointes de pipette et pas plats en verre de 9-bien laver avec de l’éthanol (savon à vaisselle doit également être évité). Au lieu de cela, nettoyez simplement les plats en verre avec distillée H2O et lubrifier, si nécessaire, avec un rinçage PBT avant leur utilisation. Aiguilles, ciseaux et pinces à dissection aussi principalement dentés distillée H2O, sauf lors de la préparation de ceux-ci pour les dissections de l’extraction de l’ARN (étape 5.1). Cependant, légère adhérence entre la rétine et des lames de microscope vitre peut aider à unfurling yeux et leur positionnement sur des lames en séparant les yeux des lobes optiques lors du montage (étape 3.5.4 et 3.5.5).). De même, légère adhérence des yeux au noir dissection plats peut être utilisé pour aplatir et extensibles très légèrement le tissu qui facilite la séparation propre de connexions lobe optique œil lorsque isoler les rétines de protéine ou ARN analyse (étape 4.5 et 5.6). Nous avons trouvé que microdissection ciseaux ou une lame de rasoir fine sont d’excellents outils pour rapidement et proprement cliver les yeux non fixées des lobes optiques.
Au cours de la coloration, l’anticorps primaire plutôt que l’incubation des complexes de l’oeil-cerveau en barquettes micro 72-puits puits (étape 3.3.5), un plat en verre de 9 puits plutôt utilisable. Pour empêcher l’évaporation de la solution d’anticorps du jour au lendemain, n’oubliez pas de plafonner les puits de plat de verre avec une lamelle couvre-objet ou de la diapositive. Toutefois, cette approche nécessitera de 40-50 µL de solution d’anticorps primaire pour un lot de 6-10 oeil-cerveau complexes incubés dans un puits de 9 puits de verre plat, plutôt que de 20 µL de solution d’anticorps primaires répartie entre 2 puits d’un plateau micro 72-puits puits.
La fixation secondaire des complexes d’oeil-cerveau (étape 3.4) avant de fixer les yeux sur des lames de microscope (étape 3.5) sera légèrement raidir le tissu afin qu’il est plus facile de s’attacher aux yeux des lobes optiques et les yeux sont moins susceptibles de se coucher ou de se conformer aux aiguilles de la dissection. Après une incubation de 1 à 2 h dans le milieu de montage (étape 3.5.1), les complexes de l’oeil-cerveau deviennent légèrement opaque et donc plus faciles à voir tout en montage. En outre, après 1-2 h en milieu de montage, la plupart des anticorps secondaires vont être convenablement protégés contre photo-blanchiment au cours de l’imagerie de fluorescence. Incubation des rétines pendant la nuit dans les supports de montage avant le montage n’est pas recommandée car cela rend les rétines doux, annulant l’effet de renfort de la fixation secondaire.
Pour les analyses de l’ouest, le lysat au moins 20 yeux est nécessaire pour détecter de façon fiable les protéines en utilisant des anticorps qui reconnaissent robustement protéines Drosophila (par exemple, la Figure 4 a). Toutefois, un plus grand nombre des yeux peut être nécessaire s’il y a faible expression de la protéine cible d’intérêt. Si la lyse des tissus pour éponger occidental ultérieur est incomplète (étape 4.7), le volume des WTLB ajouté à l’échantillon peut être légèrement augmenté et le volume de tampon concentré échantillon ajusté en conséquence (étape 4,9). Pour l’extraction de l’ARN, dissection rapide d’un nombre important des yeux peut être requise si l’objectif est d’isoler une grande quantité d’ARN de haute qualité (étape 5.2, voir Figure 4 b). Cet inconvénient potentiel peut être surmonté si les deux scientifiques qui ont maîtrisé la dissection de pupes-oeil de Drosophila collaborent pour disséquer ces grands nombres des rétines mouches simultanément. Cependant, le montant total de l’ARN requis dépendra les exigences de l’établissement ou l’installation effectuant l’analyse RNA, le type d’analyse RNA ou séquençage et le kit d’extraction d’ARN qui est utilisé.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Zack tambour et nos évaluateurs des commentaires utiles sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
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