Summary
Este artículo presenta un método quirúrgico para disección Drosophila pupas retinas junto con protocolos para el procesamiento del tejido para la extracción de RNA, inmunohistoquímica y análisis occidental.
Abstract
La retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de procesos morfogenéticos durante el desarrollo. En este trabajo, presentamos un protocolo confiable para la disección de la delicada retina pupal de Drosophila . Nuestro abordaje utiliza herramientas fácilmente disponibles de microdisección para abrir pupas y precisamente extraer complejos músculo-ojo-cerebro. Estos pueden fijarse, objeto de immunohistochemistry y retinas entonces montados en portaobjetos de microscopio y reflejados si el objetivo es detectar estructuras celulares o subcelulares. Alternativamente, retinas interpretaciones pueden ser aislados del tejido cerebral, lisis en buffers de apropiada y utilizadas para que proteína gel electroforesis o mRNA extracción (evaluar la expresión de la proteína o gen, respectivamente). Paciencia y práctica significativa pueden ser necesario para dominar el protocolo de microdisección descrito, pero una vez dominado, el protocolo permite aislamiento relativamente rápida de retinas principalmente intactas.
Introduction
La retina de Drosophila se compone de aproximadamente 750 ommatidia rodeada de pigmento las células dispuestas en panal enrejado1,2,3,4. Cada ommatidium contiene ocho neuronas fotorreceptoras, cuatro células secretoras de la lente de cono y dos células de pigmento primarias. Que rodean cada ommatidium son células productoras de pigmento de enrejado y los grupos de cerdas sensoriales. Debido a su naturaleza poste-mitotic y arreglo hexagonal estereotipada, la retina pupal de Drosophila proporciona un sistema modelo excelente para el estudio de los procesos morfogenéticos incluyendo células adherencia5,6, 7,8,9,10 y apoptosis11,12,13,14,15.
Varios protocolos publicados utilizan presión de aire a extraer complejos músculo-ojo-cerebro de Drosophila pupa16,17,18. El protocolo descrito aquí en su lugar utiliza instrumentos de microdisección para cuidadosamente y precisamente aislar complejos músculo-ojo-cerebro con el objetivo de obtener tejido retiniano intacto. Esto es crucial si retinas son para ser utilizados para morfológicos, proteína o expresión génica análisis ya que puede dañar a retinas estrés celular o incluso la muerte, que podría modificar la expresión del fenotipo o gene del celular. Además, después de la práctica, pueden aislarse complejos músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 minutos, facilitando el objetivo de minimizar la variabilidad en la edad y etapa de desarrollo de tejido ocular disecada.
La fijación, inmunotinción y montaje de todo Protocolo se describe a continuación es conveniente para la preparación de ojos de Drosophila para microscopía fluorescente. Retinas pueden ser incubadas con anticuerpos contra proteínas de interés. Por ejemplo, anticuerpos contra componentes de ensambladura de los adherens puede ser utilizado para visualizar las circunferencias apicales de las células para poder características como tipo de la célula, forma y arreglo de los19. Antes de la fijación, ojos en su lugar pueden ser hendidos del cerebro con el fin de extracción de proteínas para análisis occidental o ARN para su uso en qRT-PCR o secuenciación del RNA.
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Protocol
1. preparación de tejido
- Configurar Drosophila cruza (como se describe anteriormente20) o cepas específicas de Drosophila para obtener pupas del genotipo deseado de la cultura. Para asegurar que un gran número de pupas emerge coincidentemente, establecer estas culturas mosca por duplicado en medios de alimentos ricos en nutrientes o alimentos medios suplidos generosamente con pasta de levadura.
- Mantener cultivos de Drosophila a 25 ° C. Para cruces utilizando el sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 es un conductor ideal expresado en células de ojo larvas disco posteriores al surco morfogenético y desarrollo pupal21,22,23, 24. Cruz de la Cruz UAS-lacZ X GMR-GAL4 sirve como un control ideal como unidades de expresión de la proteína β-galactosidasa no endógeno e inerte.
- Uso la punta de una 6" bambú tablilla que se ha mojado con agua destilada suavemente Levante blanco pre-pupa (figura 1B) del lado de los frascos de cultivo sano (figura 1A) y coloque en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL (figura 1).
- Colocar los tubos en una caja de punta de pipeta de plástico junto con un pequeño trozo de tejido empapado en agua destilada para mantener la cámara a humedad suficiente para proteger a las pupas de desecación (figura 1). Incubar las pupas a 25 ° C hasta la disección.
- Utilizar una tablilla de bambú seco 6" para empujar suavemente las pupas hacia fuera del tubo de microcentrífuga y sobre un negro plato de disección. Pone un fresco pedazo de cinta de doble cara en el plato disección de las pupas.
- Usando un par de pinzas, coloque cuidadosamente el lado dorsal de pupas para arriba (es decir, opérculos hacia arriba, figura 1B) en la cinta (figura 2A). Asegúrese de que las pupas se adhieren bien a la cinta.
Nota: Humedad en la envoltura pupal inhiben la adhesión segura a la cinta, en cuyo caso, permitir que las pupas secar antes de colocar en la cinta de doble cara.
2. disección de ojo-cerebro complejos
- Utilizar pinzas para quitar el opérculo de cada pupa (figura 2).
- Utilice tijeras de microdisección para rebanar o cortar abierto la envoltura pupal de cada pupa. La aleta abrir la envoltura pupal para revelar la cabeza, el tórax y el segmento abdominal anterior, asegurar los bordes de la envoltura pupal en la cinta de doble cara (figura 2).
Nota: No es necesario revelar completamente las pupas. - Perforar el abdomen de cada pupa con pinzas afiladas, agarrar al animal y sacarlo de su envoltura pupal (figura 2).
- Colocar las pupas en el plato negro de disección, de la cinta y cubra con unos 400 μL de helada-tampón-solución de fosfato (PBS, pH 7,4).
- Sujete cada pupa por el abdomen con pinzas y tijeras de microdisección, hacer un corte limpio transversal a través del tórax entero, corte la pupa en medio (Figura 2D).
- Eliminar el remanente posterior de cada canal de PBS y poner a un lado en la bandeja de disección (descartar, consulte el paso 3.2.1).
- Con dos pares de Pinzas finas, abra el tórax y la cabeza de cada pupa para revelar el ojo-cerebro complejo (Figura 2E). Para ello, sujete los bordes de corte del epitelio del tórax y gradualmente rasgar para abrir el tórax y luego la cápsula, exponiendo el tejido gordo ojo-cerebro complejo y sus alrededores.
- Sin agarrar el tejido, use pinzas para guía del complejo de ojo-cerebro lejos de los restos de la cápsula de la cabeza o pala el complejo músculo-ojo-cerebro de la cápsula principal abierto rasgado.
Nota: El complejo de ojo-cerebro es en forma de pesa de gimnasia, grisáceo y más transparente que la grasa circundante de color crema (figura 2B, E). - Con pinzas, con cuidado retire grasa más asociada a los complejos de músculo-ojo-cerebro sin tocar el tejido del ojo.
3. procesamiento del tejido para inmunofluorescencia
- Diseccionar al menos 6-10 pupas como descritos (pasos 2.1-2.9).
Nota: Tres a cuatro repeticiones independientes de cada disección tienden a producir suficientes datos para probar una hipótesis. -
Lavado y fijación
- Cortar la punta de un P20 o pipeta P100 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de punta a ~ 1 mm de radio y lubricar mediante pipeteo una mezcla de PBS y grasa hacia arriba y hacia abajo. Esta grasa se puede obtener de los restos de caparazón quitados en el paso 2.6.
- Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBS en un plato de vidrio 9-bien, en el hielo. Utilizar la punta lubricada y una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 para transferir.
Nota: Complejos de músculo-ojo-cerebro se adhieren a los consejos sin lubricación durante el pipeteo y ser dañados o perdidos. - Eliminar la grasa restante asociada con el tejido del ojo mediante pipeteo PBS hacia arriba y hacia abajo para agitar suavemente los complejos músculo-ojo-cerebro. En este y todos los pasos de lavado posterior, no directamente pipetear complejos músculo-ojo-cerebro arriba y abajo esto dañará el tejido frágil ojo.
- Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro de un volumen mínimo (< 20 μl) de PBS en por lo menos 250 μl de fijador. Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 35 min, en el hielo.
Nota: Puede utilizarse la misma punta lubricada preparada en el paso 3.1.1 para este traslado. - Con la misma punta de pipeta, transfiera los complejos músculo-ojo-cerebro en un pozo que contiene μl de ~ 400 de PBS. Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo e incubar durante 5-10 min en hielo, para lavar. ¡Repetir el lavado por lo menos dos veces.
Nota: Complejos de músculo-ojo-cerebro se pueden mantener durante varias horas en el último lavado PBS, en hielo o a 4 ° C, antes de proceder al paso 3.3.1.
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Tinción de anticuerpos
- Para bloquear el tejido antes de la exposición a las soluciones de anticuerpos, transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBT. Utilice la punta lubricada y una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 para la transferencia. Incubar durante 10 a 60 min, en el hielo.
- Preparar la solución de anticuerpo primario mediante la dilución de anticuerpos apropiados en PBT. Desde complejos músculo-ojo-cerebro se incuban en 10 alícuotas de μl de solución de anticuerpo, el volumen elaborado será una repetición de 10.
- Alícuota 10 μl de solución de anticuerpo en un pozo limpio de una bandeja de 72 bien de micropocillos (ver discusión).
- Cortar la punta de una pipeta P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de punta a ~0.5 mm de radio y lubrique por PBT pipeteo arriba y abajo.
- Transferir no más de 5 complejos de músculo-ojo-cerebro, en un volumen de < 3 μl de PBS, en cada 10 μl de solución de anticuerpo utilizando una micropipeta de desplazamiento de aire P10 y la punta lubricada.
- Homogeneizar la solución de anticuerpo por pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo. No pipetear los complejos músculo-ojo-cerebro arriba y abajo, esto dañará el tejido.
- Para minimizar la evaporación de la solución de anticuerpo, coloque un pedazo pequeño de tejido empapado en agua destilada a la bandeja de micropocillos y sellar la bandeja (por ejemplo, con la tapa siempre). Incubar durante una noche a 4 ° C.
- Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro de la bandeja de micropocillos a ~ 400 μL de PBT en un plato de cristal llenos de 9, para lavar. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P10 y PBT-lubricar punta (preparar como se describe en el paso 3.3.4). Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 min en hielo.
- ¡Repetir el lavado por lo menos dos veces. Utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta PBT-lubricado para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro entre soluciones de lavado.
- Preparar la solución de anticuerpo secundario diluyendo apropiados etiquetado fluoróforo secundarios anticuerpos en PBT como sea necesario. 100 μl de solución de anticuerpo secundario es suficiente por la hornada de pupas de 6-10. Parte alícuota de la solución de anticuerpo secundario en una bandeja de disección de vidrio cayeron 9.
- Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro en solución de anticuerpo secundario. Utilice una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y PBT-lubricar punta para la transferencia.
- Incubar los complejos músculo-ojo-cerebro en solución de anticuerpo secundario de 1-2 h a temperatura ambiente o 3-5 h a 4 ° C. Para prevenir el blanqueo de fluoróforos por la luz, cubrir la preparación con papel de aluminio.
Nota: La duración óptima de incubación en la solución de anticuerpo secundario puede diferir según los anticuerpos primarios y secundarios utilizados. - Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBT en un plato de vidrio de 9 pozos, lavar. Mezclar mediante pipeteo la solución hacia arriba y hacia abajo. Incubar durante 5-10 min en hielo. Este paso de lavado debe repetirse al menos dos veces.
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Fijación secundaria
- Para una fijación secundaria, transferir los complejos músculo-ojo-cerebro al menos 200 μL de fijador e incubar por 20 min a temperatura ambiente o a 35 min a 4 ° C.
Nota: La fijación secundaria endurece el tejido del ojo, que ayuda de montaje (paso 3.5). - Utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta PBT-lubricado para transferir complejos músculo-ojo-cerebro ~ 400 μL de PBT en un plato de cristal de 9 pozos, con hielo, lavar durante 5 minutos.
- Repita el paso de lavado al menos una vez.
- Uso un P20 o P100 Micropipetas de desplazamiento de aire y punta lubricada de PBT para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro ~ 400 μL de PBS en un plato de vidrio 9-bien, en el hielo, para enjuagar durante 1-2 minutos mantienen el tejido en movimiento por pipeteo PBS, pero no el tejido , hacia arriba y hacia abajo para evitar complejos de músculo-ojo-cerebro de colocar y adherir el plato de vidrio durante el enjuague de PBS.
- Para una fijación secundaria, transferir los complejos músculo-ojo-cerebro al menos 200 μL de fijador e incubar por 20 min a temperatura ambiente o a 35 min a 4 ° C.
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Montaje
- Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro a ~ 200 μL de medio de montaje. Utilizar una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta PBT-lubricado para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro. Permitir que el tejido se equilibren en los medios de comunicación para 1-2 h de montaje.
- Coloque una gota de 5-8 μl fresco del medio de montaje en un portaobjetos limpio.
- Corte una punta de P10 con una cuchilla de afeitar limpia para aumentar la apertura de punta a ~0.5 mm de radio y utilizar esto y una micropipeta de desplazamiento de aire P10 para transferir los complejos músculo-ojo-cerebro en 5-8 μl de medio de montaje sobre la gota de medio de montaje de la diapositiva.
- Usar dos agujas de tungsteno para separar los ojos de los lóbulos ópticos. Prender un complejo músculo-ojo-cerebro a la diapositiva con una aguja de tungsteno resistente y rodajas cada ojo de su lóbulo óptico asociado con una aguja de tungsteno finas (figura 2F).
- Utilizar la aguja de tungsteno fina maniobra cada ojo a la superficie de lo portaobjetos con la superficie basal de cada ojo junto a la diapositiva. Suavemente baje un cubreobjetos limpio sobre el tejido y garantizar con esmalte de uñas.
Nota: Arreglar los ojos en la diapositiva para que queden cerca uno del otro o en línea facilitará la microscopia posterior. - Imagen de la retina mediante microscopía confocal o fluorescente.
Nota: Diapositivas deben ser almacenadas a 4 ° C si no reflejadas inmediatamente.
4. preparación del tejido ocular para Western Blotting:
- Diseccionar pupas de 10-16 (pasos 2.1-2.9) con las siguientes modificaciones: a) se reúnen y disecar las pupas en dos tandas, 10-15 min aparte y b) diseccionar en PBS suplementado con los inhibidores de la proteasa y fosfatasa (PBS + pi).
- Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro utilizando un P20 o P100 Micropipetas de desplazamiento de aire y lubricada punta (preparado como en el paso 3.2.1) en ~ 400 μL de PBS + pi en un plato de vidrio 9-bien, en el hielo, enjuague brevemente.
Nota: Este tip lubricado puede utilizarse para realizar los siguientes pasos 4.3 y 4.4. - Repita el paso de enjuague dos veces.
- Transferir todos los complejos de músculo-ojo-cerebro a ~ 400 μL de PBS frío hielo + pi decantó en un plato limpio negro de disección.
- Retire cada ojo de los lóbulos ópticos utilizando una aguja de tungsteno resistente (para calmar el complejo músculo-ojo-cerebro) y una fina hoja de afeitar o el microdissection tijeras para corte limpio de cada ojo del lóbulo óptico.
Nota: Ojos son 'pegajosos' en esta etapa y pueden adherirse levemente al disección plato. Esto es ventajoso ya que puede ayudar a facilitar la eliminación de los ojos de los lóbulos ópticos (ver discusión). - 'Barrido' todos los ojos en una 'pila' en el PBS + pi en la bandeja de disección, usando una hoja de un buen par de pinzas.
- Corte una punta de P10 con una cuchilla de afeitar limpia para ensanchar la abertura de punta a ~0.5 mm de radio y lubricar la punta interior por pipeteo Buffer de lisis de tejido (WTLB) occidental hacia arriba y hacia abajo.
- Transferencia de los complejos de músculo-ojo-cerebro de 5 μl de PBS + pi en un tubo de microcentrífuga de 500 μl. Utilice este Consejo lubricado y una micropipeta de desplazamiento de aire P10 para completar a la transferencia.
- Coloque el tubo de microcentrífuga en hielo. Agregar 1 volumen (5 μl) de WTLB a la muestra y 10 μl de tampón de muestra de concentrado de proteína de x 2 (o 2,5 μl de tampón de muestra de concentrado de proteína de 5 x). Mezclar golpeando.
- Vórtice de la microcentrífuga brevemente del tubo y girar por ejemplo utilizando una centrífuga mini escritorio.
- Almacenar la muestra a-20 ° C hasta su análisis. Analizar utilizando protocolos estándar.
5. preparación del tejido ocular para la extracción de RNA:
- Uso de guantes, escritorio limpio, microscopio, herramientas de disección y negro disección plato primero con etanol al 70% y luego con reactivo de descontaminación de Rnasa. Deje que se seque.
- Diseccionar pupas de 30-40 como descritos (pasos 2.1-2.9) con las siguientes modificaciones: a) se reúnen y diseccionar pupas de 6 a 8 lotes, 15-20 min aparte; b) diseccionar en PBS y c libre de nucleasas) aislar por separado cada lote de ojos sino acumular todo el tejido retiniano en el mismo tubo de microcentrífuga (paso 5.5).
Nota: Tener a dos personas diseccionar al mismo tiempo acelerará el aislamiento eficiente del tejido de buen ojo. - Por cada lote, aislar los complejos músculo-ojo-cerebro (pasos 2.1-2.9) y transferencia a ~ 400 μL de PBS libre de nucleasas en un plato de vidrio 9-bien aclarar brevemente, en el hielo, utilizando una micropipeta de desplazamiento de aire P20 o P100 y punta lubricada (preparado como se describe en el paso 3.1.2).
Nota: Este tip lubricado puede utilizarse para realizar los siguientes pasos 5.8, 5.4 y 5.5. - Repita el paso de enjuague dos veces.
- Transferir los complejos músculo-ojo-cerebro en una gota fresca 400 μL de PBS helado libre de nucleasas en un limpio negro plato de disección.
- Retire cada ojo de los lóbulos ópticos utilizando una aguja de tungsteno resistente (para calmar el cerebro ojo complejo) y una fina hoja de afeitar o el microdissection tijeras para corte limpio de cada ojo del lóbulo óptico.
Nota: Ojos son 'pegajosos' en esta etapa y pueden adherirse levemente al disección plato. Esto es ventajoso ya que puede ayudar a facilitar la eliminación de los ojos de los lóbulos ópticos (ver discusión). - 'Barrido' todos los ojos en una 'pila' en el PBS libre de nucleasas en la bandeja de disección, usando una hoja de un buen par de pinzas.
- Transferencia de los ojos a un tubo de microcentrífuga estéril libre de ARNasas y flash-congelación en nitrógeno líquido.
- Repita la disección (pasos 5.3-5.8) de cada lote de pupas. En el mismo tubo de microcentrífuga que se ha mantenido en nitrógeno líquido (paso 5.5) para acumular todos los ojos en un tubo de transferencia de cada lote de ojos.
- Almacenar las muestras a-80 ° C hasta la extracción de RNA.
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Representative Results
El ojo de pupa es un tejido de fácil acceso que sirve como un excelente modelo para investigar procesos de desarrollo morfogénesis de la drive. Aquí, nosotros hemos diseccionado retinas y utiliza inmunofluorescencia para detectar las ensambladuras de los adherens apical (Figura 3A, C) o la caspasa Dcp-1 (figura 3D) que se activa durante la apoptosis (figura 3)25. Estos enfoques permiten observar claramente las células durante los procesos morfogenéticos clave incluyendo el reclutamiento y la morfogénesis de células primarias (de 18 h APF), la intercalación del enrejado de las células alrededor de cada ommatidium (18-24 h APF), el establecimiento de la nicho superior (21-24 h APF), cambios en el tamaño celular y forma (de 18 h a 40 h APF) y apoptosis (de 18 a ~ 33 h APF). El calendario de estos eventos morfogenéticos es dependiente de la temperatura y por lo tanto variará levemente en respuesta a pequeñas diferencias en la temperatura de la incubadora en el laboratorio diferentes. Sin embargo, por alrededor 40 h APF, generalmente se logra la disposición final de las células (figura 3B, C) y esta es una edad ideal en la que evaluar las consecuencias de la mutación genética o modifica la expresión génica. Por ejemplo, siguiente expresión ectópica de Diap1, un inhibidor de la base de apoptosis caspasa activación (figura 3)26, nuestro enfoque nos permite cuantificar el consecuente aumento en el número de células de la reticular en comparación con un control GMR > lacZ retina. Uno puede fácilmente evaluar apoptosis más directamente utilizando el anticuerpo anti-Dcp-1 u otros métodos para detectar las células muertas (figura 3D).
Lisado de ojo puede ser interrogado mediante análisis occidental para determinar la presencia o expresión relativa de proteínas de interés. Aquí, mostramos la detección de-cadherin, el componente principal de las uniones, en retinas de Cantón S tipo salvaje disecado en 21 y 40 h APF ojos (Figura 4A). Cuantificación de esta muestra de Western blot (derecha, Figura 4A) reveló que la expresión relativa de-Cadherin, no difieren sustancialmente en estos dos momentos, cuando la intensidad de banda se normaliza según expresión de la GAPDH (un núcleo enzima metabólica). Tales análisis generalmente se realizaría en triplicado en lugar de sólo una vez, como se muestra aquí.
Es esencial aislar mRNA de alta pureza de retinas pupas de Drosophila , si su objetivo es analizar la expresión génica utilizando aplicaciones de secuencia avanzada (por ejemplo, Next-Gen, RNA-seq). Hemos encontrado que más de 60 ojos por genotipo o condición experimental de disección es óptimo si el objetivo es aislar > 1 mg de ARN de alta calidad (Figura 4B). A continuación, os mostramos un ejemplo de un espectro de absorbancia de una muestra de RNA aislado de 57 ojos de Cantón S de tipo salvaje, disecados en 40 h APF (Figura 4B, panel superior). La absorbancia máxima a 260 nm corresponde a la longitud de onda de absorbancia del ARN. También presentamos una tabla que refleja la producción de RNA y A260/A280 y proporciones de pureza A260/A230 de seis muestras de RNA, que se reunieron en 21 h o 40 h APF. Estos datos reflejan diferencias sutiles en el ARN rendimiento al extraer RNA.
Figura 1 : Cultura de pupas para disección y selección. (A) por larvas de tercer estadio (L3) las larvas y pupas de localizan a lo largo de los lados de las culturas sanas de Drosophila . (B) pre pupas pueden identificarse por su color blanco translúcido como pigmento todavía tiene que ser generado en el estuche de pupa. Eje anterior-posterior y dorsal-ventral de la pupa se muestran en azul. Una tablilla de bambú húmedo se utiliza para desalojar y selección pre pupas de las paredes del frasco. Pupas (C) se colocan dentro de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL que están etiquetados adecuadamente (genotipo, fecha de colección y el tiempo de colección) y (D) cultivadas dentro de una cámara humidificada montada a partir de una caja vacía de punta de la pipeta. Humedad se mantiene colocando un trozo de tejido húmedo dentro de la caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Disección del ojo pupa. (A) pupas se adhieren a la cinta de doble cara en un negro plato de disección. Anteriores, posteriores y dorsales coordenadas se indican en azul. (B) para aislar complejos músculo-ojo-cerebro (solo uno se muestra aquí), (C) la pupa es quitado de su envoltura pupal. Se muestran los pasos importantes en este proceso. Líneas rojas indican donde rasgar y abrir la envoltura pupal, después se retira el opérculo. Las pupas se eliminan luego de la envoltura pupal rasgada con fórceps. Pupa (D) un expuesto primero se corta a lo largo del tórax con tijeras de microdisección (posición indicada con línea roja discontinua) y el epitelio cabeza cuidadosamente rasgada abierto (flechas rojas), como se muestra en (E) para revelar el complejo opaco ojo-cerebro. (F) tras la incubación con los anticuerpos apropiados, retinas son rodajas de complejos músculo-ojo-cerebro. Se muestran los pasos importantes en este proceso. Ojo-cerebro se estabiliza con una aguja de tungsteno resistente (izquierda) y las retinas extraer con una aguja fina tungsteno (derecha). Para análisis de RNA y proteínas, retinas no fijadas se pueden cortar limpiamente de lóbulos ópticos utilizando una fina hoja de afeitar o tijeras de microdisección, en lugar de una aguja fina de tungsteno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Inmunofluorescencia del pupal ojo. (A) anticuerpos DE cadherin sello apical las uniones de las células del ojo pupal. Todas las imágenes en el panel A se reunieron en la región central de una retina mediante microscopía confocal, mínimamente modificada con un software de procesamiento de imagen y se presentan en la misma escala (barra de escala = 5 μm). Nota el crecimiento y reordenamiento de las células de APF de 18 h a 27 h APF. (B) la historieta de la vista apical de un ommatidium modelada completamente solo a 40 h APF (izquierda) y un ommatidium en sección transversal. Tipos de células son codificados por color como se indica en la clave. Los fotorreceptores están enterrados debajo de la superficie de la neuroepithlium seudoestratificado y rodeados de cono y las células del pigmento. Tres grupos de cerdas rodean cada ommatidium. (C) regiones pequeñas de una retina de control expresó que lacZ (izquierda) o Diap1 (derecha) para inhibir la apoptosis de las células del pigmento secundarias y terciarias. Etiquetado de las uniones con anti-DE-cadherin permite el análisis del número de células, el arreglo y la forma. Imágenes fueron capturadas usando microscopia fluorescente estándar. (D) una retina entera se incubaron con anticuerpos activa Dcp-1, una caspasa activada durante la apoptosis, que pasas de numerosas células del ojo. Imagen fue capturada usando microscopia confocal. Línea punteada blanca delinea el ojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis de expresión de proteína y gen del ojo pupa. (A) Western blot (izquierda) de 28 ojos disecados en APF de 21 h o 40 h APF, sondeado con los anticuerpos a la cad y como control de carga, GAPDH. Análisis de las intensidades de la banda de proteína (derecha) revela concentraciones comparables de la cad presentes en estos grupos de retinas, en relación con la GAPDH. (B) espectro de una absorbancia de una muestra de RNA extraída de Cantón S retinas disecados en 40 h APF (arriba). Pico de absorbancia Nota a 260 nm. Tabla que documentan las relaciones de cantidad y pureza del ARN extraído de retinas pupas Cantón S aislados en 21 y 40 h APF (abajo). Estos datos proceden de tres grupos de muestras independientes. Pupas para cada conjunto de muestras se levantó y se incubaron en las mismas condiciones y disecados en el mismo día. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de disección de ojo pupal de Drosophila aquí descrito permite el aislamiento de complejos de músculo-ojo-cerebro de 6 a 10 en 10 a 15 min. Sin embargo, paciencia y práctica son esenciales para dominar la técnica de disección y mejorar la calidad y velocidad de disecciones. Este tiempo breve disección asegura que cada ojo es aproximadamente la misma etapa de desarrollo, reducir la variabilidad en la expresión del fenotipo o gen de retinas en un conjunto de datos. Mientras protocolos alternativos pueden requerir menos práctica para el maestro, nuestro protocolo está diseñado para aislar metódicamente delicado tejido retiniano y reducir al mínimo el riesgo de rasgado o cizallamiento, debido a daños en el ojo podrían inducir estrés vía activación o incluso muerte celular. Asesoramos a principiantes para primer maestro de la disección de pupas cultivadas a 40 h APF antes de intentar diseccionar ojos más jóvenes. Recomendamos configurar replicación cruces para todos los experimentos (paso 1.1) que se asegurarán de que siempre hay suficientes pupas disponibles para colección (paso 1.3). Retinas pueden ser disecados en una variedad de puntos de tiempo durante el desarrollo pupal, dependiendo de los distintos eventos morfogenéticos de interés para el investigador. Estos pueden incluir la contratación y la morfogénesis de células primarias (de 18 h APF), intercalación de células del enrejado (18-24 h APF), establecimiento del nicho terciario (21-24 h APF), cambios en el tamaño celular y forma (de 18 h a 40 h APF) y apoptosis (de 18 a ~ 33 h APF) (Figura 3A).
Si durante la apertura inicial de la envoltura pupal (paso 2.2, figura 2), se pincha el tórax de una pupa, el investigador todavía debe ser capaz de continuar con la disección. Sin embargo, si la cabeza inicialmente se pincha, extracción complejos músculo-ojo-cerebro intacto puede ser difícil. Al retirar una pupa de su envoltura pupal (paso 2.3, figura 2, panel derecho), la envoltura pupal abdominal a veces puede desalojar de la cinta de doble cara y permanecer envuelta sobre el abdomen de la pupa. Esto es poco probable que un obstáculo, aunque la pupa puede flotar cuando rodeado de PBS hasta el abdomen y conectado envoltura pupal se cortó de la pupa (paso 2.6). Para preservar la integridad del tejido retiniano, es imperativo que es fijado o congelado tan pronto como sea posible después de la punción inicial de las pupas. Además, uso de soluciones frías y mantener el tejido en el hielo (o a 4 ° C) siempre que sea posible a través del Protocolo de preservar el tejido y la integridad celular, llevando a inmunofluorescencia mejor, análisis de la proteína o RNA-análisis. Para las aplicaciones de este último, es importante eliminar todo cerebro y tejido adiposo de ojos como estos tejidos contamine el análisis (paso de 2,9 y 4,3 ó 5.4).
El complejo de pupa músculo-ojo-cerebro puede adherirse a la disección, el vidrio y pipetas sin lubricación herramientas desmontado o PBS lavados/enjuagues, conduce al daño de tejido. Para evitar esto, se recomienda una lubricación de puntas de pipeta y no lavar los platos de vidrio 9-bien con etanol (detergente también se debe evitar). En cambio, simplemente limpiar platos de vidrio con agua destilada de H2O y lubricar, si es necesario, con un enjuague PBT antes de usarlo. Agujas, tijeras y pinzas de disección deben también principalmente limpiarse con agua destilada de H2O, excepto durante la preparación de éstos para disecciones de extracción de RNA (paso 5.1). Sin embargo, luz adherencia entre la retina y portaobjetos de vidrio puede ayudar a desplegar ojos y posicionándolos en las diapositivas cuando separa ojos lóbulos ópticos durante el montaje (paso 3.5.4 y 3.5.5). Del mismo modo, ligera adherencia de ojos negro disección platos se puede utilizar para aplanar y ligeramente elástico el tejido que facilita la separación limpia de las conexiones del lóbulo óptico de ojo al aislamiento de retinas para proteínas o ARN analiza (paso 4.5 y 5.6). Hemos encontrado que el microdissection tijeras o una cuchilla fina son excelentes herramientas rápida y limpiamente hender ojos interpretaciones de lóbulos ópticos.
Durante la tinción de anticuerpo primario, en el lugar de incubación complejos músculo-ojo-cerebro en bandejas de 72-bien micro-bien (paso 3.3.5), un plato de vidrio 9-bien en su lugar sirven. Para evitar la evaporación de la solución de anticuerpo durante la noche, asegúrese de que tapar los pozos del plato de vidrio con un cubreobjetos o diapositiva. Sin embargo, este enfoque requerirá 40-50 μl de solución de anticuerpo primario para un lote de 6-10 complejos de músculo-ojo-cerebro incubados en un pozo de plato de cristal 9-bien, en lugar de 20 μl de solución de anticuerpo primario distribuido entre 2 pocillos de una bandeja micro 72-bien-bien.
Fijación secundaria de complejos músculo-ojo-cerebro (paso 3.4) antes de montar ojos en portaobjetos (paso 3.5) endurece ligeramente el tejido por lo que es más fácil allegarse los ojos de los lóbulos ópticos y los ojos no suelen doblar o adherirse a agujas de disección. Después de una incubación de 1-2 h en el medio de montaje (paso 3.5.1), los complejos de músculo-ojo-cerebro ser ligeramente opaco y por lo tanto, fáciles de ver y de montaje. Además, después de 1-2 h en el medio de montaje, más anticuerpos secundarios estarán convenientemente protegidos de foto-blanqueo durante proyección de imagen fluorescente. Retinas durante la noche en los medios de montaje de incubación antes de montaje no se recomienda ya que esto hace que la retina suave, negar el efecto de la rigidez de fijación secundaria.
Para los análisis occidentales, el lisado de por lo menos 20 ojos es necesaria para detectar de manera fiable las proteínas utilizando anticuerpos que reconocen eficacia proteínas de Drosophila (p. ej., Figura 4A). Sin embargo, un mayor número de ojos puede ser necesario si hay baja expresión de la proteína diana de interés. Si la lisis del tejido para borrar occidental posterior es incompleta (paso 4.7), puede aumentarse ligeramente el volumen del WTLB añadido a la muestra y el volumen de concentrado tampón ajustado en consecuencia (paso 4.9). Para la extracción de RNA, disección rápida de un número significativo de los ojos puede ser necesaria si el objetivo es aislar una gran cantidad de RNA de alta calidad (paso 5.2, ver Figura 4B). Superar esta desventaja potencial si dos científicos que han dominado la disección de ojo pupal de Drosophila colaboran para diseccionar estas grandes cantidades de moscas retinas simultáneamente. Sin embargo, la cantidad total de ARN necesaria dependerá de las necesidades de la institución o establecimiento realizando análisis de ARN, el tipo de análisis de ARN o secuencia y el kit de extracción de RNA que se utiliza.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Zack tambor y nuestros revisores para comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por R15GM114729.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adobe Photoshop | Adobe | Image processing software | |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Beta-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. | ||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| cOmplete, EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 4693132001 | |
| Confocal microscope (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | or similar microscope | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Fluorescence microscope (TCS SP5 DM microscope) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Image Studio software version 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Image processing software for quantitation of Western blots. | |
| Laemmli sample buffer | Bio-Rad | 161-0737 | 2X concentrated protein sample buffer, supplement with beta mercaptoethanol as per manufacturer's instructions. |
| Lane marker reducing sample buffer | ThermoFisher Scientific | 39000 | 5X concentrated protein sample buffer. |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| Nuclease-free PBS (PBS in 0.1% DEPC, pH 7.4) | Add appropriate volume of DEPC to PBS, mix well and incubate overnight at room temperature with constant stirring. Autoclave for at least 20 minutes. Store at 4°C | ||
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBS+pi (PBS plus protease and phoshatase inhibitors) | 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in PBS, pH 7.4. | ||
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| RNA extration kit: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Promega | Z6110 | |
| Rnase decontamination reagent (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium Fluoride | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 50860 | |
| Spectrophotometer (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| WTLB (western tissue lysis buffer) | 150mM NaCl, 1.5% Triton X-100, 1mM EDTA, 20% glycerol, 10mM NaF, 1mM beta-glycerol phosphate and 1mM Na3VO4 in 50mM Tris-HCl (pH 7.5). Supplement with one cOmplete protease cocktail table per 10 mL solution. | ||
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
References
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W. Pattern formation in the Drosophila eye. Current opinion in genetics & development. 17 (4), 309-313 (2007).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Developmental Dynamics. 241 (1), 136-149 (2012).
- Hayashi, T., Carthew, R. W. Surface mechanics mediate pattern formation in the developing retina. Nature. 431, 647 (2004).
- Bao, S., Cagan, R. Preferential Adhesion Mediated by Hibris and Roughest Regulates Morphogenesis and Patterning in the Drosophila Eye. Developmental Cell. 8 (6), 925-935 (2016).
- Cordero, J. B., Larson, D. E., Craig, C. R., Hays, R., Cagan, R. Dynamic Decapentaplegic signaling regulates patterning and adhesion in the Drosophila pupal retina. Development (Cambridge, England). 134 (10), 1861-1871 (2007).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing Drosophila pupal retina. Mechanisms of development. 125 (3-4), 223-232 (2008).
- Martín-Bermudo, M. D., Bardet, P. L., Bellaïche, Y., Malartre, M. The vav oncogene antagonises EGFR signalling and regulates adherens junction dynamics during Drosophila eye development. Development. 142 (8), 1492-1501 (2015).
- Chan, E. H., Chavadimane Shivakumar, P., Clément, R., Laugier, E., Lenne, P. F. Patterned cortical tension mediated by N-cadherin controls cell geometric order in the Drosophila eye. eLife. 6, e22796 (2017).
- Lin, H. V., Rogulja, A., Cadigan, K. M. Wingless eliminates ommatidia from the edge of the developing eye through activation of apoptosis. Development. 131 (10), 2409-2418 (2004).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mechanisms of development. 121 (12), 1523-1530 (2004).
- Mendes, C. S., et al. Cytochrome c‐d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina. EMBO reports. 7 (9), 933-939 (2006).
- Monserrate, J., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death & Differentiation. 14 (2), 209-217 (2007).
- Bushnell, H. L., et al. JNK is antagonized to ensure the correct number of interommatidial cells pattern the Drosophila retina. Developmental Biology. 433 (1), 94-107 (2018).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Hsiao, H. Y., et al. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4347 (2012).
- Tea, J. S., Cespedes, A., Dawson, D., Banerjee, U., Call, G. B. Dissection and Mounting of Drosophila Pupal Eye Discs. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (93), e52315 (2014).
- Johnson, R. I., Cagan, R. L. A Quantitative Method to Analyze Drosophila Pupal Eye Patterning. PLoS ONE. 4 (9), e7008 (2009).
- Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Ellis, M. C., O'Neill, E. M., Rubin, G. M. Expression of Drosophila glass protein and evidence for negative regulation of its activity in non-neuronal cells by another DNA-binding protein. Development. 119 (3), 855-865 (1993).
- Duffy, B. J. GAL4 system in drosophila: A fly geneticist's swiss army knife. genesis. 34 (1-2), 1-15 (2002).
- Li, W. Z., Li, S. L., Zheng, H. Y., Zhang, S. P., Xue, L. A broad expression profile of the GMR-GAL4 driver in Drosophila melanogaster. Genet Mol Res. 11 (3), 1997-2002 (2012).
- Song, Z., McCall, K., Steller, H. DCP-1, a Drosophila Cell Death Protease Essential for Development. Science. 275 (5299), 536-540 (1997).
- Hay, B. A., Wassarman, D. A., Rubin, G. M. Drosophila homologs of baculovirus inhibitor of apoptosis proteins function to block cell death. Cell. 83 (7), 1253-1262 (1995).
