Summary
このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。
Abstract
ヒト多能性幹細胞由来神経前駆細胞(NPC)と2次元培養で分化したニューロンは、疾患メカニズムを探索し、化合物を調知するための高含有スクリーニング(HCS)を行う強力なモデルシステムを表す。ライブラリまたは遺伝子変異現象を同定する。しかし、ヒト細胞ではNPCから機能への移行により、成熟したニューロンは数週間を要する。シナプスは通常、単層培養における3週間の分化後に形成を開始し、いくつかのニューロン特異的タンパク質、例えば後にパンニューロンマーカーNeuNを発現させる、または層5/6大脳皮質ニューロンマーカーCTIP2が発現し始める約4-5週間の分化後。この長い差別化時間は、少量のマルチウェルHCSプラットフォームに使用される最適な培養条件と互換性がありません。多くの課題の中には、細胞クラスタリングを最小限に抑えた均一に分布した細胞の必要性や、長期的な生存率と機能的シナプス成熟を促進する培養手順が必要です。1つのアプローチは、大容量フォーマットでニューロンを区別し、HCS互換マルチウェルで後の時点でそれらを再プレートすることです。このリプラットングアプローチを使用する際のいくつかの主な課題は、樹状および軸線ネットワークのストレスの多い中断のために、再現性と細胞の生存率に関する。ここでは、大容量フォーマットで4~8週間分化した後にヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来のニューロンを酵素的に再中断し、384ウェルマイクロチターに転送するための詳細で信頼性の高い手順を示します。プレート、および優れた細胞生存でさらに1〜3週間それらを培養する。このヒトニューロンの再起は、再めっきから2週間以内にシナプスアセンブリと成熟の研究を可能にするだけでなく、神経質再生と成長コーン特性の研究を可能にします。我々は、384ウェルプラットフォームを用いたニューリトジェネシスおよびシナプトジェネシスに対するスケーラブルなアッセイの例を提供する。
Introduction
ヒト多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンは、基礎研究、創薬、再生医療の分野でますます重要になってきています。その培養とメンテナンスを最適化し、特定のニューロンサブタイプに対する分化の効率を向上させるワークフローと手順は、急速に進化している1,2.創薬や標的検証における高含有量の解析に対応するモデルシステムとしてのヒト幹細胞由来ニューロンの有用性と費用対効果を向上させるためには、成熟した機能を生成するために必要な培養時間を短縮することが有用である。最大の堅牢性、再現性、表現型の関連性を維持しながら、ニューロン。3次元オルガノイド培養は神経発達研究3のブレークスルーを推進していますが、2次元単層培養は組織厚が最小限に抑えられるため、自動イメージングベースのアプリケーションと特に互換性があります。
しかし、ヒト神経・神経発達疾患のモデルへの画像化によるスクリーニング方法の適応は大きな課題である。生体内で人間の神経系が成熟する長引く時間枠は、遺伝子発現の自然なプログラムに対応し、神経の成熟を達成するために培養の延長時間を必要とする。
長い神経分化プログラムの実用的な結果の1つは、hiPSC由来単層培養の維持が十分なシナプス成熟を達成するために何週間も持続されなければならないということです。この間、未分化のままの神経前駆子は分裂し続ける。これらはすぐに培養を過剰に成長させ、実行可能なポストマイト性ニューロンを維持するために必要な栄養素含有量を奪うことができます。神経前駆細胞(NPC)を活発に分割すると、増殖基板のニューロンと競合することもできる。これは、このような培養物を、画像ベースのアッセイに不適当な接着性の問題の対象にすることができる。さらに、多くの研究者は、培養量が小さいほど、分化ニューロンの健良な集団を維持する難易度が高く、神経分化の後期段階を観察するのに十分な長さであることがわかります。言い換えれば、高含有スクリーニング(HCS)アプローチを用いてシナプス成熟のアッセイは、ヒト由来ニューロンにとって非常に困難であり得る。
これらの問題のいくつかを回避するために、以前に分化されたhiPSC由来ニューロンを再中断および再め換えする手順が用いられた。第一に、それは完全にコミットされたニューロンの集団における神経伝達の成長(または、より正確には、神経伝達の再生)の研究を可能にする。第二に、以前に分化されたニューロンを大容量フォーマット(10cmプレート以上など)から小容量フォーマット(HCS互換96または384ウェルマイクロチタープレートなど)に再め合わせることで、総培養時間を大幅に短縮できます。小さなボリューム条件。これは、インビトロでのその後の数週間にわたってシナプスアセンブリと成熟の研究を容易にします。
しかし、すでに長いニューライトと複雑な接続ネットワークを確立している成熟したニューロンの再め換えは、いくつかの課題を提示し、そのうちの1つは、時には高く、可変的な細胞死率である。ここでは、優れた細胞生存率および再現性をもたらす再めっき手順について説明する。一般的に、ニューロンは、トリキュレーションの前に基板から細胞を切り離すために、短いインキュベーション期間(通常〜3〜10分)のプロテオ分解酵素に曝露されます。この短いプロテオシス時間は、非神経細胞および未分化前駆体4、5、6を含む多くのタイプの分裂細胞を再中断および通過するために慣例的に使用される。しかし、長く相互接続された神経突起を持つ分化ニューロンのためには、細胞を基板から切り離すだけでなく、損傷を最小限に抑えながら個々の細胞を分離するために樹状および軸網を破壊することが不可欠です。実際、ニューロンの厚いメッシュワークは、通常、個々の細胞としてではなく、単一のシートとして基板から切り離される傾向があります。神経突起の厚いネットワークを緩めるために注意を払わなければ、ニューロンはトリチュレーション中に不可逆的に損傷を受けるだけでなく、それらの多くは、塊を除去するために使用されるフィルタを通過できず、細胞収率が悪くなります。以下では、これらの困難に対抗するために広く使用されているプロテアーゼインキュベーション手順に対する簡単な改変について説明する。
以下に説明するプロトコルでは、ニューロンは、プロテオ溶解酵素(例えば、アキュターゼ)などの軽度のプロテアーゼを用いて40〜45分間インキュベートされる。酵素を添加した後の最初の5〜10分の間に、ニューロンネットワークはシートとして基板から離陸する。プロテアーゼを用いたインキュベーションは、穏やかなトリタースとフィルタリングを進める前に、さらに30〜40分間進行します。この余分なインキュベーション時間は、材料の消化が細胞間ネットワークを緩和し、それによって後続のトリチュレーションが個々の細胞の懸濁液を生成することを保証するのに役立ちます。この手順は、細胞死を最小限に抑えながら再めっき時の細胞分布の均一性を最大化する。このリプラット法は、様々な分化プロトコル7、8、および様々なヒトCCから生成されたhiPSC由来のニューロン培養に応用することに成功しました。この手順は、名目上、幹細胞由来ニューロンのほとんどまたはすべての行での使用に適しています。我々は、拡張プロテアーゼインキュベーション時間が小さなフォーマットプレート(例えば、直径35ミリメートル)から培養物を再め換えに絶対に不可欠ではないことを観察しました。しかし、ここで示すように、大口径プレート(直径10cm以上)から再メッキする場合、おそらくそのようなプレート内のニューライトは非常に長いプロセスを拡張し、密に相互接続されたアレイを形成することができるため、大きな利点を提供します。
ここでは、この方法をデモンストレーションし、早期のニュー泌形成およびシナプス成熟のためのアッセイにおけるその応用を簡単に説明します。シナプスサイトでのコローカリゼーション。例では、このプロトコルが細胞の生存率と再現性を維持する上で提供する利点を強調しています。まず、研究者がヒトの新生の初期のステップを研究することを可能にする。実験設定は、げっ歯類皮質または海馬ニューロンの一次培養物に似ており、細胞は後期胎児または出生後の脳から抽出され、穏やかなプロテアーゼ治療後のトリチュレーションによって解離され、ニューライトを開始するか、手順9、10で切断されたニューライトを再生する。このようなげっ歯類の一次ニューロンと同様に、hiPSC由来のニューロンは、再形成後数時間以内にニューライトを形成または再生し始め、より少ない高い時空間イメージングに最適な環境で成長コーンおよびニューライト形態のイメージングを可能にする。周囲の未分化細胞。ニューロンが最初に前駆体集団から分化し始めたときに見られる可変遅延と異なる成長速度と比較して、神経突起の成長がより同期していることを観察しました。さらに、再めっきは、皮質層5/6転写因子CTIP2(チキンオブアルブミン上流プロモーター転写)などの神経発達の後半に現れるニューロンサブタイプマーカーを発現するニューロンのアッセイを可能にする。因子相互作用タンパク質2)、またはパンニューロンマーカーNeuN11.リメッキアプローチの特に有用な特徴は、HCSと互換性のある時間枠内でシナプトジェネシスが進行することです。
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Protocol
1. 再平言前の差別化期間
- 10cm皿上のニューロンを区別し、選択7、8のプロトコルを使用して、ニューロンがプロセスとの厚いネットワークを形成し、MAP2やTuJ1などの初期のニューロンマーカーだけでなく、NeuNなどの後期マーカーを発現します。
-
ニューロン分化プロセス中に4日ごとに選択の半分の媒体を変更します。
注:より広範なまたは頻繁な媒体の変化は、本質的な栄養因子を希釈し、成熟を好ましくない可能性があります。- iPSC由来WT126ニューロンについては、 次の分化後培養培地を使用する:5 mL 100x N2サプリメント、10 ng/mL BDNF、10 ng/mL GDNF、1 μg/mLラミニン、200 μMアスコルビン酸、1 μMジブティリル-cAMPおよび10mL SM1 500 mL Duls栄養混合物F-12(DMEM/F12)。徐々に、 ハーフメディアの変更を使用して、 神経基底媒体 (材料の表)と同じサプリメントに置き換えます。
- iPSC由来CVB WTニューロンの場合は、次の分化後培養培地:500mL神経基底A培地(材料表)と500mL DMEM/F12培地(2μg/mLラミニン、10mLグルタミンサプリメント(材料表)0.75 mg/mL重炭酸ナトリウム、5mL最小必須培地(MEM)非必須アミノ酸、0.2 mMアスコルビン酸、10 ng/mL BDNF、20 mL 50x B27、および10mL 100x N2サプリメント。
2. マルチウェルのコーティング
- 塗り直しの前日、ポリL-オルニチン(PLO)でコートする。無菌水にPLOを溶解し、ストック溶液(10mg/mL)を作ります。この在庫は-20 °Cで保管してください。プラスチックをコーティングする場合は、水中にPLO 1:100を希釈し、ガラスをコーティングする場合は50 μg/mL、プラスチックをコーティングする場合は1:1,000比(10μg/mL)の濃度を得ます。
- コーティングをターゲットプレートに直接塗布します。プレートサイズに適したコーティングの体積を使用します(すなわち、24ウェルプレートの場合は、ウェルあたり500μLのPLO溶液を適用します)。
- プレートが室温で一晩暗闇の中に座るようにします。
- 塗り替えの日にコーティングされた版を取り出し、無菌のバイオセーフティキャビネットに移す。
- PLO溶液を吸引し、滅菌水で2回すすいでください。
- リン酸緩衝生理食べ物(PBS)中の希釈ラミニン(1.15mg/mL)を1:400希釈。
注:4 °Cでラミニンを解凍し、すぐにラミニンと不均一なコーティングの凝集を避けるためにPBSに追加します。 - 滅菌水を吸引し、以前にPLOでコーティングされた井戸にラミニンコーティングの500 μLを適用します。
- 最低でも4~6時間の37°Cインキュベーターにプレートを置き、ガラス表面に対して最大16時間の長いインキュベーションを使用します。一貫したインキュベーション時間を使用します。
3. 分化ニューロンの再めっき
- 一度穏やかにPBSで分化ニューロンのリンスプレート。PBSをプレートの壁に静かに分散させ、細胞に直接分散させず、それらを破壊しないようにします。
- PBSをそっと吸引し、細胞に直接触れないように注意するが、研究者に向かって傾けながら皿の端から吸引する。
- 10cmプレート当たり、プロテオ溶解酵素(材料表)の少なくとも1mLを塗布し、細胞をインキュベーターに戻します。組織培養室が低湿度による高い蒸発速度を示す場合は、わずかに高いボリュームを追加します。
- プレートから切り離し、ニューロンネットワーク内の他のニューロンから切り離すために、40〜45分間プロテオ分解酵素を用いて細胞をインキュベートする。
注:このステップのタイミングは重要です。プロテアーゼを早期に消光すると、再めっき後の細胞死が増加する可能性があります。プロテオ溶解酵素メーカーは、37 °Cよりもはるかに低い温度を、通過細胞株(例えば、4°Cで一晩)のためのより長いインキュベーション期間で使用することをお勧めします。しかし、4°Cでのニューロンの取り扱いは、しばしば冷たい暴露後の生存率が悪いことが多いため、避けるべきである。製造業者はまた、37°Cの酵素との60分のインキュベーションは、その酵素的な不活性化につながると述べています。しかし、著者の経験では、37°CでのhiPSC由来の神経培養の40-45分のインキュベーションは、再形成時の効率的な解離と優れたニューロン生存率のために十分である。 - インキュベーション期間中に位相コントラスト顕微鏡上のニューロンをチェックし、ニューラルネットワークがプレートから完全に切り離され、プレートの下でプレートを短時間振ると小さなシートで分解し始めるまでプロテアーゼ治療を続けることを可能にします。顕微鏡。
- 消化を止めるために10cmプレートでプロテアーゼの1mLあたり5mLの新鮮なDMEM培地を用いてプロテアーゼ活性をクエンチする。血清ピペットを使用して、ネットワークを破壊するためにプレートに対して細胞を5〜8回穏やかにトリチュレートします。分化ニューロンは壊れやすいので、トリチュレーション時にあまりにも多くの圧力を加えないように注意してください。端が鋭すぎて狭すぎるため、P1000チップを使用しないでください。
- 100 μm の直径メッシュを持つセル ストレーナーを介してセルと溶液を適用し、ドロップによって新鮮な 50 mL 円錐チューブドロップします。
- 細胞が濾過した後、新鮮なDMEM媒体の追加の5 mLでストレーナーをすすいでいます。
- ベンチトップ遠心分離機のスピンセルを1,000 x gで5分間使用します。
- 円錐形のチューブをバイオセーフティキャビネットに戻し、ほとんどのメディアを吸引し、細胞が水分を保持するように約250 μLを残します。
- 新鮮なDMEM培養剤の2mLで細胞を穏やかに再中断する。ペレットをチューブの側面に対してピペットにしないでください。代わりに、円錐形の2〜3回を穏やかに反転し、それらを取り除くために5 mLの血清ピペの端を通して細胞を通過します。
- 再懸濁ニューロンの10 μLをヘモサイトメーターの端に適用します。
- この懸濁ステップ中に細胞の生存率を評価するために、細胞の液滴に8-10 μLのトリパンブルーを追加します。この混合物の10 μLをヘモサイトメーターまたは他の自動セルカウンタに適用します。位相明るい細胞を生存可能と評価し、トリパン青色染料を除外する。
- 生存細胞/mLの量を決定し、所望の細胞密度に応じて円錐管の内容物を希釈する準備をする。
- 384ウェルプレートのウェルあたりプレート〜10,000細胞;24ウェルプレート用にウェル当たり約150,000-200,000細胞をプレート。
- 適切な希釈を達成し、特定の細胞株の要件に応じて、B27やBDNFなどの追加の適切なサプリメントを追加するために、再懸濁細胞の円錐管に新鮮なDMEMを追加します。
- 円錐形のチューブをそっと傾けて2~3回混ぜます。
- 24ウェルプレートから、または16チャンネルのピペを使用して384ウェルマルチウェルプレートからラミニンコーティングを吸引し、PBSで1回すすいでください。
- 24ウェルプレートにP1000、または384ウェルプレート用の16チャンネルピペットを使用してPBSを吸引します。
- 束を避けるために、図8の動きで各井戸にセル溶液を適用します。めっきの均一性は、自動液体処理装置を使用して最適化することもできます。
注:再平小後2〜4日を開始する媒体へのラミニンの添加はまた、細胞の均質な分布を維持するのに役立ちます。 - 各井戸に対して手順 3.19 と 3.20 を繰り返します。
- プレートを37°Cと5%CO2に設定したインキュベーターに戻します。
- 2日後、セクション1.2に記載の分化後培養培地を用いて4日ごとに半分の培地の変化を開始する。所望の成熟時間の後、37°Cで3.7%ホルムアルデヒドを使用して培養物を修正し、実験要件に従って細胞を染色する。
4. 細胞生存率アッセイポストリメッキ
- ストック溶液を簡単に渦動させた後、早期細胞死レポーター(VivaFix:50μL培養培地あたり50μLストック溶液/ウェル当たり0.5μL)を追加します。
- ガラス底マルチウェルで培養した生細胞および死細胞を20分後、洗浄工程なしで、色素蛍が細胞内で1回だけ蛍がみえるので、または4',6-diamidino-2-フェニリンドール(DAPI)および/または他の抗体で固定および共染色する画像を撮る共焦点顕微鏡を使用して。
5. 免疫染色
- PBSで3.7%ホルムアルデヒドと120 mMスクロースを37°Cで20分間固定します。
- 0.2%のトリトンX-100を室温で5分間洗い流し、2%ウシ血清アルブミン(BSA)で30分間ブロックします。
- ウサギ抗MAP2抗体1:1,000、マウス抗β3チューブリン(TuJ1)抗体1:2,000、鶏抗NeuN抗体(1:100)およびラット抗CTIP2抗体(1:500)、またはマウス(1:500)で室温で1時間のリンプトを行わずにBSAを吸引し、マウスを使用する(1:500)。1:200)、ウサギの抗シナプス1(1:200)およびシナプス染色用ニワトリ抗MAP2抗体。
- PBSですすし、Alexa Fluor結合二次抗体とDAPIを37°Cで45分間インキュベートします。
- 最後に、イメージングの前にPBSで2回洗浄します。
6. カルシウムイメージング
- AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE(サルク生物学研究所、GT3コア施設)で培養細胞に感染し、10日後の再散写後3~4週間で自発的なカルシウム過渡性を評価する画像を用いて、
7. 画像の取得と解析
注:取得システムの詳細については、カラブレスら12を参照してください。
- 手動または自動の画像集録にはイメージングモジュール、および CellProfiler13などの画像解析ソフトウェア モジュールを使用して、形態測定を行います。
- 同じ視野内のニューロン(DAPI + MAP2またはTuJ1陽性細胞)の数で割った視野ごとの総長を測定することにより、TuJ1陽性ニューライトおよびMAP2陽性デンドライトの平均長さを計算します。
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Representative Results
数週間分化されているhiPSC由来ニューロンの再めっきは、いくつかの利点を提供しています.しかし、長く相互接続されたデンドライトと軸ゴン(図1A)を持つ分化ニューロンを切り離して再めあうと、不可逆的に損傷を受けたニューロンの割合が高い可能性があります。
プロトコルセクションで説明したように、我々は基板からニューロンを切り離すためにプロテオ分解酵素を用いてインキュベーションを使用した。典型的には、ニューライトの厚いメッシュワーク(図1A)のために、細胞は単一の同期状の層として一度にすべて剥離する傾向があり、これはしばしば井戸に浮かび始める(図1C)。これはかなり迅速に起こり、おそらくほとんどの研究室は、選択したプロテオ分解酵素でわずか5分後に細胞を集め、トリチュレーション(上下にピペッティング)によって細胞のシートを直ちに分解する傾向がある理由です。しかし、この機械的操作は、ニューロンに高いストレスをもたらすように見えます。ストレスの程度は、不十分なプロテアーゼインキュベーションによる明らかな損傷が35mm以下のプレートよりも10cm以上のプレートに対して大きいことが分かるので、神経ネットワークによってカバーされる領域に比例する可能性があると考えています。したがって、直感的に、酵素インキュベーションを40〜45分に延長すると、細胞解離時の細胞死が減少し(図1C)、時間をかけてプロセスを放出する生きた健康な細胞のより効率的な回復が可能であることがわかった。再平言後の日数 (図 1B)おそらく、穏やかなタンパク質溶解酵素を用いて延長インキュベーション時間を過わせることで、細胞とそのプロセスを互いに強く付着させるタンパク質の部分消化を可能にします。これにより、再懸濁プロセスは、過度に活発なトリチュレーションを必要とせずに個々の細胞を分離するために効率的に動作することができます。
拡張酵素インキュベーション手順の有効性を定量化するために、トリパンブルー(図1C)を用いてトリチュレーション直後の懸濁細胞の生存率を評価し、その後、早期細胞を用いて1、3、7日後に再現行を行った。デスマーカー(図2)。トリチュレーション直後、トリパンブルー染色は、プロテオ溶解酵素を用いて45分インキュベーションと比較して5分インキュベーション後に実質的に大きい細胞死があったことを示した(図1C)。この観察を例示するために使用した2つのiPSCラインは、異なるプロトコルを用いて神経前駆期からニューロンに分化し、再めっき手順に対して大きく異なる感度を示した。「ロゼット選択法」7を用いてNPCに分化したWT126ラインからの培養物は、急速な分化方法8を用いてCVB WT24ラインと区別される培養よりも損傷に対してより敏感であった。それにもかかわらず、両方の行について、拡張酵素インキュベーション手順を用いて即時細胞死の程度は約半減した。
再平描後、培養物は、DAPI陽性細胞の密度によって決定される拡張酵素インキュベーション手順を用いて、その後の数日間にわたって細胞生存率の概算倍増を示した(図2B、左のグラフ)。さらに、拡張酵素インキュベーションは、色素排除生存率キットを用いて検出された死細胞または死死細胞の密度を低くした(図2B、右のグラフ)。24時間後の再め換後に生存アッセイを用いて検出された死細胞の割合は、トリチュレーション直後にトリパンブルーを用いて見られるものよりも高かった。これはおそらく、これらの最初の24時間にわたって死んで死んでいる細胞の蓄積を反映しているが、生存率アッセイはトリパンブルーアッセイよりも細胞死をより敏感に検出する可能性もある。死細胞は、再平言後1~7日にわたって検出され続けた(図2B)。両方の実験群の初期めっき密度(5分および45分)は同一であり、三彩後細胞懸濁液の血球計生細胞数に基づいていた。重要なことは、すべての時間点で、生きた、健康な細胞の数は、5分インキュベーションと比較して45分酵素インキュベーションに続いて約2倍であった。これらの観察は、位相コントラスト顕微鏡を用いて、再めっき前、再めっき中、再めっき後(図1および図2)、各工程で細胞形態をモニタリングするために定性的に確認された。
彼らは数週間分化した後、hiPSC由来ニューロンを再め換えの利点の一つは、細胞のほとんどが前駆期を終了し、再め換え時に神経表現型にコミットされるということです.神経前駆体からの神経分化の移行段階は数日間にわたって起こり、β-IIIチューブリン(抗体TuJ1によって検出された)やMAP2などの初期のニューロンマーカーを徐々に発現する細胞が増える。遺伝子発現は数週間にわたって進化し、最終的にはNeuNなどの後期パンニューロンマーカー、またはCTIP2などの皮質ニューロンに対する細胞型特異的マーカーの発現をもたらす。したがって、以前に分化されたhiPSC由来ニューロンの再平方で、ニューロンの識別されたサブタイプにおいて、神経突起などの早期および一過性のニューロンイベントを研究することができます。図3は、より大きな培養皿における4週間の事前分化後に再メッキされた培養における初期のニューロンマーカーの即時存在を示す。NeuNおよびCTIP2発現ニューロンは、再平行後数日以内に容易に同定される(図3)。神経分化の特性とタイミングは、hiPSCラインによって異なる場合があります。ここで説明するWT126行およびCVB WT24行について、細胞の85±12%(n=2)および52±11%(n=5)それぞれ、拡張プロテアーゼインキュベーション手順を用いて再現散後4日目にβIII-チューブリンマーカーTuJ1に対して免疫反応性を発現した。両方の行について、細胞の30〜40%、およびニューロンの80〜90%も層5/6ネオ皮質マーカーCTIP2を発現する。生存率の向上に加えて、拡張プロテアーゼプロトコルはまた、図4に示すように、中程度に増強されたニューライトの成長(ニューロンあたりの平均ニューライト長さ)を高めた。両方の総ニューライト長さ(軸とデンドライトの両方を染色する抗体Tuj1を使用して定量);図 4B、左グラフ)およびデンドライトの成長(MAP2を使用して定量化され、デンドライトだけを汚す;図 4B,中心グラフ)を拡張プロテアーゼインキュベーション手順を用いた場合に好まれた。図2のDAPI陽性(+)セル数のグラフは、図4のセル数グラフと同じ画像サンプルに基づいていますが、図2ではフィジーソフトウェアが支援する非自動化法を用いて定量化されています。図4では、自動画像解析ソフトウェアプラットフォームCellProfilerを使用して定量化しました。これら2つの画像解析アプローチは、同様の結果をもたらしました。
リメッキは、神経突起の成長を研究するだけでなく、シナプスやニューロンの他の後に現れる生物学的特徴を研究するのにも役立ちます。実際、わずか1週間後に再塗流後、多くのシナプス前および後質タンパク質のマーカーを観察し、穿刺パターンで神経デンドライトを飾ります(図5A)。4週間後、我々はまた、機能シナプスの形成の指標である彼らのコローカリゼーションを検出し始めます(図5A)。さらに、自発的脱分極およびシナプス駆動電流からの電気活動は、カルシウムイメージング(図5B)または多電極アレイ(MEA)を用いて検出可能である。
図 1: 細胞解離のためのプロテオ分解酵素による長いインキュベーション後の神経生存率の優れた保存性(A) NPC由来ニューロンの相コントラスト画像を3週間分化した。左の画像のボックス化された領域は右に拡大されます。この段階では、ニューロンは、厚いメッシュワークを形成する長いプロセスを持っています。スケールバー = 80 μm (左)35 μm(右)。(B) 1日および5日後のhiPSC由来ニューロンの画像を選択した。スケールバー = 100 μm. (C) 左: 細胞はプロテアーゼ処理を始めから数分以内に単一シートとして剥離する。スケールバー = 200 μm.右:トリチュレーション細胞は、再めっき前にヘモサイトメーターにカウントされた後。グラフは、2つの異なるラインCVB WT24(***p< 0.0003、未対t検定)およびWT 126(***p< 0.0001、非対化t-test)の2つの異なるラインに対するプロテオ溶解酵素による5分後または45分インキュベーション後の非生存性、トリパン青色陽性細胞の定量化を示す。値は、4個の個々の反復の平均±S.E.Mを表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: 再平言後の数日後の神経生存率。(A) 5分および45分プロテアーゼインキュベーションを用いて1および3日後再め換後におけるWT126 NPC由来ニューロンの画像。死細胞は、敏感な早期細胞死レポーターで標識されています。対応する明るいフィールド画像が左側に表示されます。一部の細胞破片(青い矢印)は、通常、特に5分群で、再めっき後に検出されます。スケールバー = 150 μm. (B) CVB WT24 NPC由来培養の画像 1,3,7日後に5分および45分のプロテアーゼインキュベーションを用いて再塗布した。死細胞は、敏感な早期細胞死レポーター(赤)で標識される。生細胞および死滅細胞のすべての核は、DAPI(シアン)で標識される。マージされた白色信号は、DAPI および VivaFix 陽性 (+) セルを表します。いくつかの細胞はVivaFix染色を表示しますが、DAPI染色(右側の組み合わせ画像の赤いセル)を欠いています。これらは何時間も死んでいた可能性が高い細胞です。スケールバー: 25 μm.右のグラフは、プロテオ溶解酵素を用いた異なるインキュベーション時間後の死細胞(VivaFix/DAPI)の定量化を示しています(5分対45分:*p< 0.05 1 dおよび***p< 0.001、3 d;双方向ANOVA、続いて多重比較ボンフェロニポストホックテスト)。左のグラフは、全体的な細胞密度の変化を示しています (# DAPI(+) セルの 5 分対 45 分: *** p < 0.0001 すべての時間ポイント; 双方向分散分析、 続いて多重比較ボンフェローニポストホックテスト)すべての値は、3反復の平均±S.E.Mとして示され、条件ごとに最低1,500セルがスコア付けされます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 再めっき直後の後期ニューロンマーカーの検出可能な発現。CVB WT24 hiPSC由来細胞の培養物は、再平小後4日目に画像化し、45分間プロテアーゼインキュベーションを用いて、NPC期から4週間分化した10cm皿から。示された例は、TuJ1、MAP2、またはNeuNのパンニューロンマーカーについて染色した。または深層皮質ピラミッド型ニューロンマーカーCTIP2。広範なニューライトの存在と、TuJ1 と MAP2 の堅牢な表現に注意してください。特に、ニューロンのかなりの部分は、後期マーカーNeuNおよびCTIP2も発現する。スケールバー = 16 μm.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 再生中の酵素インキュベーションの短く、長い後に時間をかけて神経ライトとデンドライトの成長。(A) 再メッキされたCVB WT24 hiPSC由来ニューロンは、抗体Tuj1を用いて検出されたニューライトを迅速に拡張する。なお、拡張プロテアーゼインキュベーション時間は、ニューリトジェネシスを促進する。スケールバー = 25 μm. (B) ニューライトおよびデンドライトの長さの定量化、5分または45分のプロテアーゼを用いて1、3および7日後の再塗布後。全神経突起長はTuJ1(βIII-チューブリン)染色から定量した。デンドライト特異的染色は、全体的な細胞密度に対して補正されたMAP2染色snfから定量した(右グラフ)。すべての値は、3反復の平均±S.E.Mとして表示されます。ノイライト長さ 5 分対 45 分: * p < 0.05 1 日と 7 日で、 ** p < 0.01 3 日;デンドライトの長さ 5 分対 45 分: ** p < 0.01 1 日と 3 日で、7 日で有意ではない (ns) ;# DAPI(+) 5 分対 45 分: *** p < 0.0001 すべての時間ポイント。双方向ANOVA、続いて多重比較ボンフェローニポストホックテスト。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 再形成後の分化hiPSC由来ニューロンにおけるシナプトジェネシスおよび自発的カルシウム過渡性。(A)左:拡張プロテアーゼインキュベーションプロトコルを用いて4週間後に再め換え、前シナプスマーカーシナプシン1はMAP2陽性デンドライトに沿った穿刺クラスターで検出可能である。スケールバー = 5 μm.右:シナプス前クラスターとポストシナプスクラスター(黄色の矢印)の間のコローカライズを示す選択された樹状領域、潜在的に活性なシナプスの指標。スケールバー = 1.5 μm. (B)左: AAV8-syn-jGCaMP7f-WPREに感染したhiPSC由来ニューロンは、ネットワーク活動によって駆動される自発的なカルシウム過渡を監視するために使用された。明るいフィールド画像は、タイムラプスシリーズの一時点でGCaMP7蛍光の擬似色レンダリングに隣接して示されています。スケールバー = 25 μm. 着色された数値は、右側のトレースに示すように、GCaMP7蛍光が時間の経過とともに測定された4つの選択された細胞を示します。各色付きトレースは、1 つのセルに対応します。アスタリスクは、左側の画像が対応するライブ録音中の時間を指します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: 高いコンテンツスクリーニングおよび/または分化および神経伝達の成長またはMEA記録の詳細な研究のための培養hiPSCへの再めっき手順のワークフロー。より大きなフォーマット(例えば、10cm培養皿)で4週間以上成長したニューロンの分化培養から始まり、ニューロンは40〜45分間プロテアーゼでインキュベートされ、解離および再中断するために穏やかにトリチュレートされる。その後、細胞はHCSと互換性のあるマルチウェルに分配され、画像成長コーン(黄色の矢印)または他の構造と互換性のある基板上に再メッキ、またはマルチ電極アレイ記録に適したマルチウェル上に再メッキされます。スケールバー = 27 μm, 5 μm, 2.5 μm, 130 μm (左から右)この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、高含有量スクリーニングプラットフォームと互換性のある方法で、生存率、分化の成功、および細胞内イメージングを最適化するヒトニューロン培養の再停止と再平行化のための簡単な手順を実証しました。創薬に関連する他のアッセイ。図 6は、このようなアプリケーションの全体的なワークフローと例を示しています。
ここでは、皮質ニューロンの運命に向けられたhiPSC由来ニューロンに焦点を当てていますが、この方法はヒト胚性幹細胞由来ニューロンに対しても同様に適用可能であり、他方に向けられた幹細胞由来のニューロンにも同様に適用可能であると期待しています。ニューロン型14,15,16,17,18.さらに、この拡張プロテアーゼ手順は、FACSの選別や原発ニューロンの単一細胞分析など、確立された神経突起メッシュワークを有する細胞の再停止を必要とする他の状況に有益である可能性があると考えています19,20.
hiPSC由来ニューロンの再プラット化は、多くの主要な生物学的事象の細胞および分子機構を調べるための実行可能なモデルシステムを提供する。例えば、この手順は、ヒトのニューライトの成長と成長コーン特性の詳細な研究を容易にすることができ、および脊椎動物と無脊椎動物の両方の他の種を研究する数十年から構築された広範な知識ベースとの所見の比較。リプラットング手順により、細胞内構造と機能の光学的評価に適した大きな成長コーンを生成するために条件を最適化することが容易になったことがわかります(図6)。対照的に、hiPSCからのニューロンの初期分化時に観察される成長コーンは小さくコンパクトになる傾向があり、そのような培養における非ニューロン細胞の密度の高い配列は、基板条件を調整することが困難になります。成長円錐の広がりを促進し、複雑な組織環境内の個々の成長コーンをイメージする。したがって、新鮮な皿にニューロンを再めっきすることは、良好なイメージング条件下で成長コーンを見る「クリーナースレート」を提供します。
リメッキは、HCSに適した細胞培養プラットフォームを使用する場合に特に有利です。96、384または1536ウェルの個々のウェルの小さな作業量(それぞれ約100、50および5マイクロリットルの作業量)は、通常、蒸発および栄養の枯渇に対抗するために頻繁な(すなわち、毎日)培養物の変更を必要とする。頻繁なメディアの変化は、試薬や労力の面だけでなく、条件付きメディアを希釈し、機械的乱流のために細胞が基板から切り離される可能性を高めることによって、培養物の生存率を損なう可能性があります。hiPSCの再平方度は、動的神経表現型23のアッセイにおける培養物の多電配列21、22、または培養物のライブイメージングを用いた生理学的活性の記録を容易にすることができる。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
本研究は、精神疾患を研究する全国協同再プログラム細胞研究グループ(NCRCRG)の構成要素であり、NIH助成金U19MH1 2015-0644の支援を受けています。初期の作業は、NIH認可NS070297によってもサポートされました。私たちは、神経前駆細胞のWT 126ラインを提供してくれたキャロル・マルケット博士とフレッド・ゲージ博士、および神経前駆細胞のCVB WT24ラインを提供してくれたユージーン・ヨー博士とローレンス・ゴールドスタイン博士に感謝します。サンフォード・バーナム・プレビーズ医学発見研究所のアン・バン博士の研究室で、有益な議論をしてくださったデボラ・プレに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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