Summary
Questo protocollo descrive una procedura dettagliata per la resuspending e la coltura di neuroni derivati da cellule staminali umane che in precedenza erano differenziati dai progenitori neurali in vitro per più settimane. La procedura facilita i saggi basati sull'imaging di neuriti, sinapsi e marcatori neuronali che esprimono tardivamente in un formato compatibile con la microscopia leggera e lo screening ad alto contenuto.
Abstract
I neuroni differenziati nella coltura bidimensionale dalle cellule progenitrici staminali derivate da cellule staminali (NPC) umane rappresentano un potente sistema modello per esplorare i meccanismi della malattia ed eseguire lo screening ad alto contenuto (HCS) per interrogare il composto o identificare i fenotipi della mutazione genica. Tuttavia, con le cellule umane la transizione da PNG funzionale a funzionale, neurone maturo richiede diverse settimane. Le sinapsi in genere iniziano a formarsi dopo 3 settimane di differenziazione nella coltura dei monostrato, e diverse proteine neuronali specifiche, ad esempio il successivo marcatore pan-neuronale NeuN, o il marcatore del neurone corticale cerebrale cTIP2, di livello 5/6, iniziano ad esprimere circa 4-5 settimane dopo la differenziazione. Questo lungo tempo di differenziazione può essere incompatibile con le condizioni di coltura ottimali utilizzate per piattaforme HCS di piccole dimensioni e multi-pozzo. Tra le molte sfide vi sono la necessità di cellule ben aderenti e distribuite uniformemente con un clustering cellulare minimo e procedure di coltura che favoriscano la vitalità a lungo termine e la maturazione funzionale delle sinapsi. Un approccio è quello di differenziare i neuroni in un formato di grande volume, quindi rilassarli in un secondo momento in multi-pozzi compatibili con HCS. Alcune delle principali sfide nell'utilizzo di questo approccio di replating riguardano la riproducibilità e la vitalità cellulare, a causa della stressante interruzione della rete dendritica e assonale. Qui dimostriamo una procedura dettagliata e affidabile per riutilizzare ennzimaticamente i neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti (hiPSC) indotte dall'uomo dopo la loro differenziazione per 4-8 settimane in un formato di grande volume, trasferendoli a microtiter 384-well piastre, e coltura per un ulteriore 1-3 settimane con eccellente sopravvivenza cellulare. Questa rappresaglia dei neuroni umani non solo consente lo studio dell'assemblaggio e della maturazione delle sinapsi entro due settimane dalla riplaccatura, ma consente anche studi sulla rigenerazione dei neuriti e sulle caratteristiche del cono di crescita. Forniamo esempi di saggi scalabili per neuritogenesi e sinaptogenesi utilizzando una piattaforma a 384 pozzetto.
Introduction
I neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hiPSC) sono sempre più rilevanti nei settori della ricerca di base, dello sviluppo di farmaci e della medicina rigenerativa. I flussi di lavoro e le procedure per ottimizzare la loro cultura e manutenzione, e migliorare l'efficienza della differenziazione in specifici sottotipi neuronali, si stanno evolvendo rapidamente1,2. Per migliorare l'utilità e l'efficacia in termini di costi dei neuroni derivati dalle cellule staminali umane come sistemi modello suscettibili di analisi ad alto contenuto nella scoperta di farmaci e nella convalida degli obiettivi, è utile ridurre il tempo di coltura necessario per generare maturi e funzionali valori in genere, pur mantenendo la massima robustezza, riproducibilità e pertinenza del fenotipo. Anche se le colture organoidi a 3 dimensioni stanno guidando le innovazioni nella ricerca sul neurosviluppo3, le colture monostrato bidimensionali sono particolarmente compatibili con applicazioni automatizzate basate sull'imaging a causa del loro spessore minimo dei tessuti.
Tuttavia, l'adattamento dei metodi di screening basati sull'imaging ai modelli della malattia neurologica e neurosviluppo umana deve affrontare una grande sfida. Il lasso di tempo prolungato durante il quale il sistema nervoso umano matura in vivo richiede un tempo prolungato nella coltura per accogliere programmi naturali di espressione genica e raggiungere la maturazione neuronale.
Una conseguenza pratica del lungo programma di differenziazione neuronale è che il mantenimento delle colture monostrato derivate da hiPSC deve essere sostenuto per molte settimane per ottenere un'adeguata maturità sinapsi. Durante questo periodo, i progenitori neurali che rimangono indifferenziati continuano a dividersi. Questi possono rapidamente crescere eccessivamente la coltura e usurpare il contenuto nutritivo necessario per mantenere i neuroni postmitotici vitali. Le cellule progenitrici neurali (NPC) che dividono vigorosamente possono anche competere con i neuroni per il substrato di crescita. Questo può rendere tali culture soggette a problemi di scarsa adesione, una condizione inadatta per i saggi basati sull'imaging. Inoltre, molti ricercatori trovano che più piccolo è il volume di coltura, maggiore è la difficoltà nel mantenere popolazioni sane di neuroni differenziati abbastanza a lungo per osservare le ultime fasi della differenziazione neuronale. In altre parole, i saggi di maturazione delle sinapsi utilizzando approcci di screening ad alto contenuto (HCS) possono essere molto impegnativi per i neuroni derivati dall'uomo.
Per aggirare alcuni di questi problemi, è stata utilizzata una procedura di resumfare e repunatura in precedenza differenziati neuroni hiPSC-derivati. In primo luogo, permette lo studio della escrescenza neurite (o, più precisamente, la rigenerazione dei neuriti) in una popolazione di neuroni pienamente impegnati. In secondo luogo, la ripettezza di neuroni precedentemente differenziati da un formato di grande volume (come piastre di 10 cm o più grandi), fino a formati di piccoli volumi (come piastre di microtiteri compatibili con HCS) consente una significativa riduzione del tempo totale di la condizione di piccolo volume. Questo facilita lo studio dell'assemblaggio e della maturazione delle sinapsi nelle settimane successive in vitro.
Tuttavia, la rifacimento di neuroni maturi che hanno già stabilito lunghi neuriti e una complessa rete di connettività presenta diverse sfide, una delle quali è il tasso a volte alto e variabile di morte cellulare. Qui, descriviamo una procedura di repsiamento che si traduce in un'eccellente sopravvivenza cellulare e riproducibilità. Comunemente, i neuroni sono esposti a enzimi proteolitici per brevi periodi di incubazione (tipicamente 3-10 min) al fine di staccare le cellule dal substrato prima della triturazione. Questo breve tempo proteolisi è abitualmente utilizzato per resudare e passare molti tipi di cellule divisorie, tra cui le cellule non-neuronali e progenitori indifferenziati4,5,6. Tuttavia, per i neuroni differenziati che portano a lungo, neuriti interconnessi, è essenziale non solo per staccare le cellule dal substrato, ma anche per interrompere la rete dendritica e assonale al fine di isolare le singole cellule riducendo al minimo i danni. Infatti, una spessa rete di neuroni di solito tende a staccarsi dal substrato come un singolo foglio, piuttosto che come singole cellule. Se non si fa attenzione ad allentare la fitta rete di neuriti, i neuroni non solo diventano irreversibilmente danneggiati durante la triturazione, ma molti di loro non riescono a passare attraverso il filtro utilizzato per rimuovere i grumi, con conseguente scarsa resa cellulare. Qui di seguito descriviamo una semplice modifica a una procedura di incubazione proteasi ampiamente utilizzata per contrastare queste difficoltà.
Nel protocollo descritto di seguito, i neuroni vengono incubati per 40-45 min con una proteasi lieve, come l'enzima proteolitico (ad esempio, Accutase). Durante i primi 5-10 min dopo l'aggiunta dell'enzima, la rete neuronale si solleva dal substrato come un foglio. L'incubazione con la proteasi procede per altri 30-40 min prima di procedere con triturazione e filtraggio delicati. Questo tempo di incubazione supplementare aiuta a garantire che la digestione del materiale rilassi la rete intercellulare, garantendo così che la successiva triturazione produca una sospensione delle singole cellule. Questa procedura massimizza l'uniformità della distribuzione cellulare durante la replaccatura riducendo al minimo la morte delle cellule. Abbiamo applicato con successo questo metodo di replating alle colture neuronali derivate da hiPSC generate da vari protocolli di differenziazione7,8 e da varie linee di hiPSC. La procedura è nominalmente adatta per l'uso con la maggior parte o tutte le linee di neuroni derivati dalle cellule staminali. Abbiamo osservato che un tempo prolungato di incubazione della proteasi non è assolutamente essenziale per la riplaccatura delle colture da piastre di piccolo formato (ad esempio, diametro di 35 mm); tuttavia, come si mostra qui, fornisce un vantaggio significativo quando si replata da piastre di grande diametro (ad esempio, 10 cm di diametro o più grandi), probabilmente perché i neuriti in tali piastre possono estendere processi molto lunghi e formare un array densamente interconnesso.
Qui dimostriamo questo metodo e illustriamo brevemente la sua applicazione nei saggi per la neuritogenesi precoce e per la maturazione delle sinapsi, che comporta il raggruppamento di proteine pre e post-sinaptiche lungo i dendriti e gli assoni, seguiti dai loro successivi co-localizzazione nei siti sinaptici. Gli esempi evidenziano i vantaggi offerti da questo protocollo per preservare la vitalità e la riproducibilità delle cellule. In primo luogo, permette ai ricercatori di studiare i primi passi nella neuritogenesi umana. L'ambientazione sperimentale è simile alle colture primarie comunemente utilizzate dei neuroni corticali o ippocampali del roditore, dove le cellule vengono estratte dal cervello tardo fetale o postnatale precoce, dissociate dalla triturazione dopo un delicato trattamento della proteasi, e avviare neuriti o rigenerare neuriti che sono stati recisi nella procedura9,10. Simile a tali neuroni primari roditori, i neuroni derivati da hiPSC iniziano a formarsi o rigenerare i loro neuriti poche ore dopo la riplaccatura, consentendo l'imaging dei coni di crescita e della morfologia dei neuriti in un ambiente ottimale per l'imaging spatiotemporale elevato con meno che circondano cellule indifferenziate. Abbiamo osservato che l'escrescenza di neurite è più sincronizzata rispetto ai ritardi variabili e ai diversi tassi di escrescenza osservati quando i neuroni iniziano a differenziarsi da una popolazione progenitrice. Inoltre, la riatcrolatura consente alle analisi dei neuroni che esprimono marcatori di sottotipi neuronali che in genere appaiono più tardi nello sviluppo neurale, come il fattore di trascrizione 5/6 dello strato corticale CTIP2 (Trascrizione promotrice promotrice a monte dell'ovalbumina proteina che interagisce con il fattore 2), o il marcatore pan-neuronale NeuN11. Una caratteristica particolarmente utile dell'approccio replating è che la sinaptogenesi procede entro un lasso di tempo compatibile con HCS.
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Protocol
1. Periodo di differenziazione prima della riplaccatura
- Differenziare i neuroni su piatti da 10 cm, utilizzando un protocollo di scelta7,8 fino a quando i neuroni hanno formato una rete spessa con i loro processi ed esprimere non solo i primi marcatori neuronali come MAP2 o TuJ1, ma anche marcatori tardivi come NeuN.
-
Cambiare la metà del mezzo di scelta ogni 4 giorni durante il processo di differenziazione neuronale.
NOTA: Cambiamenti medi più estesi o frequenti diluiscono fattori trofici essenziali e potrebbero sfavorire la maturazione.- Per i neuroni WT126 derivati da iPSC, utilizzare i seguenti supporti di coltura post-differenziazione: 5 mL 100x supplemento N2, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL GDNF, 1 lamina di g/mL, 200m acido ascorbico, 1 dibutyryl-cAMP e 10 mL SM1 per il mezzo aquila modificato di 500 mL miscela nutritiva F-12 (DMEM/F12). A poco a poco, utilizzando le modifiche semi-media, sostituire con mezzo basale neurale (Tabella dei materiali) e gli stessi integratori.
- Per i neuroni CVB WT di iPSC, utilizzare il seguente supporto di coltura post-differenziazione: 500 mL neural basal basal a media (Tabella dei materiali) e mezzo DMEM/F12 da 500 mL con 2 g/mL di lamina, supplemento di glutammina da 10 mL ( Tabella deimateriali), 0,75 mg/mL di bicarbonato di sodio, 5 mL minimo medio essenziale (MEM) aminoacidi non essenziali, 0,2 mM di acido ascorbico, 10 ng/mL BDNF, 20 mL 50x B27 e 10 mL 100x Supplemento N2.
2. Rivestimento Multiwells
- Il giorno prima della sradicamento, ricoprire con poli-L-ornitina (PLO). Sciogliere l'OLP in acqua sterile per creare una soluzione di riserva (10 mg/mL). Conservare questo stock a -20 gradi centigradi. Diluire LLO 1:100 in acqua per produrre una concentrazione di 50 g/mL durante il rivestimento del vetro e 1:1.000 rapporto (10 g/mL) durante il rivestimento di plastica.
- Applicare il rivestimento direttamente alle piastre di destinazione. Utilizzare il volume di rivestimento appropriato per la dimensione della piastra (cioè, per una piastra di 24 pozzetti applicare 500 -L di soluzione PLO per bene).
- Lasciare che le piastre si siedano al buio durante la notte a temperatura ambiente.
- Recuperare le piastre rivestite il giorno della replizione e il trasferimento in un armadio sterile di biosicurezza.
- Aspirare la soluzione OLP e risciacquare due volte con acqua sterile.
- Lamininina diluita (1,15 mg/mL) in salina tampone fosfata (PBS) a 1:400 diluizione.
NOT: Scongelare la lamino a 4 gradi centigradi e aggiungerla rapidamente alla PBS per evitare l'aggregazione di laminina e rivestimento irregolare. - Aspirare acqua sterile e applicare 500 l di rivestimento di laminina a pozzi precedentemente rivestiti con OLP.
- Posizionare le piastre in un'incubatrice di 37 gradi centigradi per un minimo di 4-6 h. Utilizzare incubazioni più lunghe, fino a 16 h, per superfici di vetro. Utilizzare tempi di incubazione coerenti.
3. Repsiare i neuroni differenziati
- Sciacquare la piastra di neuroni differenziati con PBS una volta delicatamente. Disperdere la PBS delicatamente lungo la parete della piastra, e non direttamente sulle cellule, per evitare di interromperle.
- Aspirare delicatamente PBS, facendo attenzione a non toccare direttamente le cellule, ma ad aspirare dal bordo del piatto mentre si ribalta verso il ricercatore.
- Applicare almeno 1 mL dell'enzima proteolitico (Tabella dei materiali) per piastra da 10 cm e riportare le cellule all'incubatrice. Aggiungere volumi leggermente più elevati se la sala di coltura dei tessuti presenta un alto tasso di evaporazione a causa della bassa umidità.
- Incubare cellule con enzima proteolitico per 40-45 min al fine di staccarle dalla piastra e staccarle da altri neuroni all'interno della rete neuronale.
NOT: La tempistica in questo passaggio è fondamentale. L'incitamento troppo precoce alla proteasi può portare ad un aumento della morte cellulare dopo la riplaccatura. Il produttore di enzimi proteolitici raccomanda di utilizzare temperature molto più basse di 37 gradi centigradi con periodi di incubazione più lunghi per passare le linee cellulari (ad esempio, durante la notte a 4 gradi centigradi). Tuttavia, la manipolazione dei neuroni a 4 gradi centigradi dovrebbe essere evitata, in quanto spesso mostrano una scarsa sopravvivenza dopo l'esposizione al freddo. Il produttore afferma anche che un'incubazione di 60 min con l'enzima a 37 gradi centigradi porta alla sua inattivazione enzimatica. Tuttavia, nell'esperienza degli autori, un'incubazione di 40-45 min di colture neuronali derivate da hiPSC a 37 gradi centigradi è sufficiente per una dissociazione efficiente e un'eccellente sopravvivenza neuronale dopo la repsiatura. - Controllare i neuroni su un microscopio a contrasto di fase durante il periodo di incubazione e consentire il proteasi trattamento di continuare fino a quando la rete neurale si stacca completamente dalla piastra e inizia a rompersi in fogli più piccoli agitando brevemente la piastra sotto la microscopio.
- Quench l'attività proteasi utilizzando 5 mL di supporti DMEM freschi per 1 mL di proteasi nella piastra di 10 cm per fermare la digestione. Triturare delicatamente le cellule contro la piastra 5-8 volte per interrompere la rete, utilizzando pipette sierologiche. Fare attenzione a non applicare troppa pressione durante la tritura, come neuroni differenziati sono fragili. Non utilizzare una punta P1000, come la fine è troppo tagliente e stretta, e quindi può pura o danneggiare i neuroni.
- Applicare la soluzione con le cellule attraverso un colino cellulare con una maglia di 100 m di diametro in una fresca tubetta conica da 50 ml goccia a goccia.
- Risciacquare il colino con altri 5 mL di supporti DMEM freschi, dopo che le cellule hanno filtrato attraverso.
- Ruotare le cellule nella centrifuga della panca a 1.000 x g per 5 min.
- Restituire il tubo conico all'armadio della biosicurezza e aspirare la maggior parte dei supporti, lasciando circa 250 s L per garantire che le cellule trattengano l'umidità.
- Risospendere delicatamente le cellule in 2 mL di supporti DMEM freschi. Non pipette il pellet contro il lato del tubo. Invece, ritornare delicatamente conical 2-3 volte e passare le cellule attraverso la fine di un pipet sierologico 5 mL per spostarli.
- Applicare 10 - L di neuroni risospesi sul bordo di un emocitometro.
- Aggiungere 8-10 l di trypan blu a gocciolina di cellule per valutare la vitalità cellulare durante questa fase di sospensione. Applicare 10 l di questa miscela all'emocitometro o ad altri contatori cellulari automatici. Valutare come vitali quelle cellule che sono fase luminosa ed escludere il colorante blu trypan.
- Determinare la quantità di cellule/mL vitali e prepararsi a diluire il contenuto del tubo conico in base alla densità di cellule desiderata.
- Piastra 10.000 cellule per pozzo per una piastra di 384 pozzetti; piatto 150.000-200.000 cellule per pozzo per una piastra di 24 pozzetti.
- Aggiungere dMEM fresco al tubo conico delle celle risospese per ottenere una diluizione appropriata e aggiungere ulteriori supplementi appropriati come B27 e/o BDNF, a seconda dei requisiti della linea cellulare specifica.
- Piegare delicatamente il tubo conico per mescolare 2-3 volte.
- Rivestimento di lamina aspirata dalla piastra 24-well, o dalla piastra multiwell 384-well utilizzando un pipet a 16 canali e risciacquare una volta con PBS.
- Aspirate PBS utilizzando un P1000 per la piastra a 24 pozzetti, o la pipetta a 16 canali per piastre 384 pozze.
- Applicare la soluzione cellulare a ogni pozzo in un movimento figura otto per evitare di agglomerarsi. L'uniformità della placcatura potrebbe anche essere ottimizzata utilizzando dispositivi di movimentazione automatica dei liquidi.
NOT: L'aggiunta di laminina ai media a partire da 2-4 giorni dopo la repporazione aiuta anche a mantenere una distribuzione omogenea delle cellule. - Ripetere i passaggi 3.19 e 3.20 per ogni pozzetto.
- Riportare la piastra all'incubatrice impostata a 37 gradi centigradi e al 5% di CO2.
- Dopo 2 giorni, iniziare a cambiare metà del mezzo ogni 4 giorni utilizzando i supporti di coltura post-differenziazione descritti nella sezione 1.2. Dopo il tempo di maturazione desiderato, correggere le colture utilizzando 3,7% formaldeide a 37 gradi centigradi e macchiare le cellule secondo i requisiti sperimentali.
4. Cell Viability Afferma post-replating
- Aggiungete il reporter della morte per cella prima (VivaFix: 0,5 l dell'unità di stock 50 per ogni pozzo di 500 supporti di coltura luna) dopo aver brevemente vortice la soluzione di stock.
- Immagina le cellule vive e morte coltivate su multiwell con fondo di vetro, dopo 20 min, senza alcuna fase di lavaggio, poiché il colorante fluoresce solo una volta all'interno delle cellule, o fissa e co-macchia con 4',6-diamidino-2-fenilitine (DAPI) e/o altri anticorpi prima dell'imaging utilizzando un microscopio confocale.
5. Immunostaining
- Correggere le colture con 3,7% di formaldeide in PBS più 120 mM di saccarosio per 20 min a 37 gradi centigradi.
- Risciacquare e permeabilizzare con 0,2% Triton X-100 per 5 min a temperatura ambiente, quindi bloccare per 30 min con 2% di albumina di siero bovino (BSA).
- Aspirare la BSA senza risciacquo e incubare per 1 h a temperatura ambiente con anticorpo coniglio anti-MAP2 1:1,000, topo anti-tubulina (TuJ1) anticorpo 1:2,000, pollo anti-NeuN anti-1:100 e anti-CTIP2 ratto (1:500), o con topo anti-PSD95 ( 1:200), coniglio anti-sinappsina 1 (1:200) e pollo anti-MAP2 anticorpo per la colorazione sinaptica.
- Risciacquare con PBS e incubare con anticorpi secondari coniugati da Alexa Fluor più DAPI per 45 minuti a 37 gradi centigradi.
- Infine, lavare due volte con PBS prima dell'imaging.
6. Immagini di calcio
- Infetta le cellule coltivate con AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE (The Salk Institute for Biological Studies, GT3 Core Facility) a 10 giorni dopo la soppiattia e l'immagine per valutare i transitori spontanei di calcio a 3-4 settimane dopo la replastica.
7. Acquisizione e analisi delle immagini
NOT: Per i dettagli sul sistema di acquisizione si prega di fare riferimento a Calabrese etal.
- Utilizzare un modulo di imaging per l'acquisizione manuale o automatica di immagini e un modulo software di analisi delle immagini, ad esempio CellProfiler13, per le misurazioni morfometriche.
- Calcolare la lunghezza media dei neuriti positivi TuJ1 e dei dendriti positivi MAP2 misurando la lunghezza totale per campo visivo diviso per il numero di neuroni (cellule positive DAPI - MAP2 o TuJ1) all'interno dello stesso campo.
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Representative Results
La rifacimento di hiPSCs-derivati neuroni che sono stati differenziati per più settimane offre diversi vantaggi. Tuttavia, lo scollegamento e la riclassificazione di neuroni differenziati che hanno dendriti e assoni lunghi e interconnessi (Figura 1A) possono comportare un'elevata frazione di neuroni danneggiati in modo irreversibile.
Come descritto nella sezione del protocollo, abbiamo usato l'incubazione con un enzima proteolitico per staccare i neuroni dal substrato. In genere, a causa della loro spessa meshwork di neuriti (Figura 1A), le celle tendono a staccarsi tutte in una volta come un singolo strato di tipo sinciziale, che spesso inizia a fluttuare nel pozzo (Figura 1C). Questo accade abbastanza rapidamente, ed è forse il motivo per cui la maggior parte dei laboratori tendono a raccogliere le cellule dopo solo 5 min di incubazione con il loro enzima proteolitico di scelta, e di rompere immediatamente il foglio di cellule per triturazione (pipetting su e giù). Tuttavia, Questa manipolazione meccanica sembra provocare un alto stress per i neuroni. Crediamo che il grado di stress possa essere proporzionale all'area coperta dalla rete neuronale, perché troviamo che l'apparente danno da incubazione inadeguata della proteasi è maggiore per 10 cm o piastre più grandi che per piastre di 35 mm o più piccole. Così, in modo controintuitivo, abbiamo scoperto che prolungare l'incubazione enzimatica a 40-45 min riduce la morte cellulare al momento della dissociazione cellulare (Figura 1C) e permette un recupero più efficiente delle cellule vive e sane che emettono processi nel corso di ore ai giorni successivi alla sopposizione (Figura 1B). Presumibilmente, il tempo di incubazione prolungato con un lieve enzima proteolitico consente la digestione parziale delle proteine che aderiscono fortemente le cellule e i loro processi l'uno all'altro e alla matrice extracellulare. Questo permette al processo di sospensione di lavorare in modo efficiente per separare le singole cellule senza la necessità di triturazione eccessivamente vigorosa.
Per quantificare l'efficacia della procedura di incubazione enzimatica estesa, abbiamo valutato la vitalità delle cellule sospese subito dopo la triturazione utilizzando trypan blue (Figura 1C), e più tardi a 1, 3 e 7 giorni dopo la repsiatura utilizzando una cella precoce indicatore di morte (Figura 2). Immediatamente dopo la triturazione, la colorazione blu trypan ha indicato che c'era una morte cellulare sostanzialmente maggiore dopo un'incubazione di 5 min rispetto a un'incubazione di 45 min con l'enzima proteolitico (Figura 1C). Le due linee iPSC che abbiamo usato per illustrare questa osservazione sono state differenziate nei neuroni dallo stadio del progenitore neurale utilizzando protocolli diversi, e hanno mostrato una sensibilità sostanzialmente diversa alla procedura di replating. Le colture della linea WT126 differenziate in PNG utilizzando il "metodo di selezione delle rosette"7 erano più sensibili ai danni rispetto alle colture differenziate dalla linea CVB WT24 utilizzando un metodo di differenziazione rapida8. Tuttavia, per entrambe le righe il grado di morte immediata delle cellule è stato circa dimezzato utilizzando la procedura di incubazione enzimatica estesa.
Dopo la replatrice, le colture hanno mostrato un raddoppio approssimativo della vitalità cellulare nei giorni successivi utilizzando la procedura di incubazione enzimatica estesa, come determinato dalla densità delle cellule DAPI-positive (Figura 2B, grafico a sinistra). Inoltre, l'incubazione enzimatica estesa ha provocato una minore densità di cellule morte o morenti rilevate utilizzando un kit di vitalità coloranti (Figura2B, grafico a destra). La frazione di cellule morte rilevata usando il saggio di fattibilità dopo 24 h post-replating era superiore a quella vista usando il trippan blu immediatamente dopo la triturazione. Questo probabilmente riflette l'accumulo di cellule morte e morenti su queste prime 24 h, anche se è anche possibile che l'esaggio di fattibilità rilevi la morte delle cellule in modo più sensibile rispetto al saggio blu trypan. Le cellule morte hanno continuato a essere rilevate per 1-7 giorni dopo la sopposizione (Figura 2B). La densità di placcatura iniziale per entrambi i gruppi sperimentali (5 min e 45 min) era identica e basata sui conteggi delle cellule vive emocitometridella sospensione delle cellule post-triturazione. È importante sottolineare che, in tutti i momenti in cui il numero di cellule vive e sane è stato circa raddoppiato a seguito dell'incubazione degli enzimi di 45 min rispetto all'incubazione di 5 min. Queste osservazioni sono state confermate qualitativamente utilizzando la microscopia a contrasto di fase per monitorare la morfologia cellulare in ogni fase: prima della riplaccatura, durante la riplaccatura e dopo la repposizione (Figura 1 e Figura 2).
Uno dei vantaggi della replating hiPSC-derivati neuroni dopo che sono stati differenziazione per diverse settimane è che la maggior parte delle cellule saranno usciti dallo stadio progenitore e si sono impegnati in un fenotipo neuronale al momento della riplaccatura. La fase di transizione della differenziazione neuronale dai progenitori neurali avviene per diversi giorni, con un maggior numero di cellule che esprimono gradualmente marcatori neuronali in fase iniziale, come la tubulina beta-III (rilevata dall'anticorpo TuJ1) o MAP2. L'espressione genica si evolve nel corso di diverse settimane, portando infine all'espressione di marcatori panneuronali in fase avanzata, come NeuN, o marcatori specifici di tipo cellulare per neuroni corticali come CTIP2. Pertanto, la ritorsione di neuroni derivati da hiPSC precedentemente differenziati consente di studiare eventi neuronali precoci e transitori, come l'iniziazione dei neuriti, in sottotipi identificati di neuroni. La figura 3 illustra l'immediata presenza di marcatori neuronali precoci nelle colture che sono state ricostituite dopo 4 settimane di predifferenziazione in un piatto di coltura più ampio. Si noti che i neuroni che esprimono NeuN e CTIP2 sono facilmente identificabili entro pochi giorni dopo la riplaccatura (Figura 3). Caratteristiche e tempi di differenziazione neuronale possono variare tra le linee hiPSC. Per la linea WT 126 e le linee CVB WT24 che descriviamo qui, 85 x 12% (n - 2) e 52 x 11% (n - 5) delle cellule, rispettivamente, hanno espresso l'immunoreattività per il marcatore di zIII-tubulina TuJ1 a 4 giorni dopo la replaccatura utilizzando la procedura di incubazione prolungata della proteasi. Per entrambe le linee, 30-40% delle cellule, e 80-90% dei neuroni esprimono anche lo strato 5/6 marcatore neocorticale CTIP2. Oltre a migliorare la vitalità, il protocollo proteasi estesa anche moderatamente migliorato escrescenza neurite (lunghezza media neurite per neurone), come mostrato Figura 4. Sia la lunghezza totale dei neuriti (quantificata con anticorpo Tuj1, che macchia sia gli assoni che i dendriti; Figura 4 B, grafico sinistro) e crescita dendrite (quantificata utilizzando MAP2, che macchia solo dendriti; Figura 4 B, grafico centrale) sono stati favoriti quando si utilizza la procedura di incubazione proteasi estesa. Si noti che il grafico per i conteggi di celle DAPI-positivi (DAPI()) nella Figura 2 si basano sugli stessi esempi di immagini del grafico del numero di celle in Figura 4, ma nella Figura 2 sono stati quantificati utilizzando un metodo non automatizzato assistito dal software Fiji, mentre in Figura 4 sono stati quantificati utilizzando la piattaforma software di analisi automatica delle immagini CellProfiler. Questi due approcci di analisi dell'immagine hanno prodotto risultati simili.
La ritorsione è utile non solo per studiare la crescita dei neuriti, ma anche per studiare le sinapsi o altre caratteristiche biologiche successive dei neuroni. Infatti, dopo appena una settimana dopo la riclassificazione osserviamo i marcatori per molte proteine pressinaptiche e post-sinaptiche che decorano i dendriti neuronali in un modello di puncinato (Figura 5A). Dopo 4 settimane iniziamo anche a rilevare la loro colocalizzazione, che è un indicatore della formazione di sinapsi funzionali (Figura 5A). Inoltre, l'attività elettrica derivante dalla depolarizzazione spontanea e dalle correnti guidate sintatticamente è rilevabile utilizzando l'imaging di calcio (Figura 5B) o gli array multielettrodi (MEA).
Figura 1 : Conservazione superiore della vitalità neuronale dopo incubazione prolungata con l'enzima proteolitico per la dissociazione cellulare. (A) Immagine a contrasto di fase dei neuroni derivati da NPC differenziati per 3 settimane. L'area boxed nell'immagine a sinistra viene ingrandita a destra. In questa fase i neuroni hanno lunghi processi, che formano una lavorazione a maglia spessa. Barre della scala: 80 m (sinistra); 35 m (a destra). (B) Immagini di neuroni derivati da hiPSC a 1 e 5 giorni dopo la riplaccatura. Barra di scala : 100 m. (C) Sinistra: le cellule si staccano come un singolo foglio pochi minuti dopo l'incaricamento del trattamento della proteasi. Barra della scala: 200 m. A destra: dopo la triturazione le cellule vengono contate sull'emocitometro prima della rappresaglia. I grafici mostrano la quantificazione delle cellule positive non- blu non praticabili dopo l'incubazione di 5 min o 45 min con l'enzima proteolitico per due diverse linee CVB WT24 (sezione p < 0.0003, t-test non accoppiato) e WT 126 (Sezione ) e WT 126. I valori rappresentano la media : S.E.M di 4 repliche individuali. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Vitalità neuronale dopo diversi giorni dopo la riplaccatura. (A) Immagini di neuroni Derivati da NPC WT126 a 1 e 3 giorni dopo la ritorsione utilizzando 5 min e 45 min incubazione della proteasi. Le cellule morenti sono etichettate con il sensibile reporter della morte a cellule precoci. Le immagini di campo luminoso corrispondenti vengono visualizzate a sinistra. Alcuni detriti cellulari (freccia blu) viene in genere rilevato dopo la replating, soprattutto nel gruppo di 5 min. Barre di scala - 150 m.(B) Immagini di colture CVB WPc derivate da NPC a 1, 3 e 7 giorni dopo la ritorsione utilizzando 5 min e 45 min incubazione della proteasi. Le cellule morenti sono etichettate con il sensibile reporter della morte a cellule precoci (rosso). Tutti i nuclei delle cellule viventi e morenti sono etichettati con DAPI (ciano). Il segnale bianco unito rappresenta le celle DAPI e VivaFix-positive. Alcune celle mostrano VivaFix colorazione ma manca la colorazione DAPI (celle rosse nell'immagine combinata a destra); queste sono probabilmente cellule che sono morte per molte ore. Barre della scala: 25 m. Il grafico a destra mostra la quantificazione della frazione di cellule morte (VivaFix/DAPI) dopo un diverso tempo di incubazione con l'enzima proteolitico (5 min vs 45 min: . p < 0.05 1 d e sz .p < 0.001, 3 d; ANOVA bidirezionale, seguito da multiconfronto BonFerroni post hoc test). Il grafico a sinistra mostra le modifiche apportate alla densità complessiva delle celle (sezione DAPI() per 5 min vs 45 min: "p < 0.0001" per tutti i punti temporali; ANOVA bidirezionale, seguito dal multiconfronto Bonferroni post hoc test). Tutti i valori sono indicati come media : S.E.M di 3 repliche, con un minimo di 1.500 celle segnate per condizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : espressione rilevabile dei marcatori neuronaliin fase avanzata subito dopo la riplaccatura . Le colture di cellule derivate da CVB WT24 derivate da hiPSC hanno avuto un'immagine di 4 giorni dopo la repporazione, utilizzando un'incubazione della proteasi di 45 min, da un piatto di 10 cm che si era differenziato dallo stadio NPC per 4 settimane. Gli esempi mostrati sono stati macchiati per i marcatori pan-neuronali TuJ1, MAP2 o NeuN; o il marcatore del neurone piramidale corticale CTIP2. Si noti la presenza di neuriti estensivi e la robusta espressione di TuJ1 e MAP2. Si noti in particolare che una frazione sostanziale dei neuroni esprime anche marcatori in fase avanzata NeuN e CTIP2. Barra di scala : 16 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : crescita di Neurite e dendrite nel tempo a seguito di un'incubazione enzimatica più breve e più lunga durante la riplaccatura. (A) I neuroni replated CVB WT24 derivati dall'hiPSC estendono rapidamente i neuriti, come rilevato con l'anticorpo Tuj1. Si noti che il tempo di incubazione proteasi estesa promuove la neuritogenesi. Barra della scala ( 25 m. (B) Quantificazione della lunghezza di neurite e dendrite, oltre 1, 3 e 7 giorni dopo la riplaccatura utilizzando una proteasi di 5 min o 45 min. La lunghezza totale dei neuriti è stata quantificata dalla colorazione di TuJ1 (zIII-tubulina); la colorazione specifica del dendrite è stata quantificata da snf di colorazione MAP2 corretta per la densità complessiva delle cellule (grafico a destra). Tutti i valori sono indicati come la media : S.E.M di 3 repliche. Neurite length 5 min vs 45 min: : p < 0,05 a 1 giorno e 7 giorni, p < 0,01 a 3 giorni; lunghezza dendrite 5 min vs 45 min: s p < 0.01 a 1 giorno e 3 giorni, non significativo (ns) a 7 giorni; DAPI(') 5 min vs 45 min: s.c., p < 0.0001 per tutti i punti temporali; due vie ANOVA, seguita dal multiconfronto Bonferroni post hoc test. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : sinaptogenesi e transitori spontanei di calcio in neuroni differenziati derivati da hiPSC dopo la riplaccatura. (A) Sinistra: a 4 settimane dopo la ripporazione utilizzando il protocollo di incubazione della proteasi estesa, la sinapsi del marcatore presilratico 1 è rilevabile in cluster puntiti lungo i dendriti positivi MAP2. Barre della scala: 5 m. A destra: regione dendritica selezionata che mostra la colocalizzazione tra cluster pressinaptici e post-sinaptici (freccia gialla), un'indicazione di sinapsi potenzialmente attive. Le barre di scala - 1,5 m. (B) Sinistra: neuroni derivati da hiPSC infettati da AAV8-syn-jGCaMP7f-WPRE sono stati utilizzati per monitorare transitori spontanei di calcio guidati dall'attività di rete. L'immagine del campo luminoso viene mostrata accanto al rendering pseudocolore della fluorescenza GCaMP7 in un singolo punto temporale della serie time-lapse. Barra di scala- 25 m. I numeri colorati indicano le 4 celle selezionate in cui è stata misurata la fluorescenza GCaMP7 nel tempo, come mostrato nelle tracce a destra. Ogni traccia colorata corrisponde a una cella. L'asterisco indica il tempo durante la registrazione dal vivo a cui corrisponde l'immagine a sinistra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Flusso di lavoro delle procedure di repuntazione agli hiPSC di coltura per lo screening dei contenuti ad alto contenuto e/o studi dettagliati sulla differenziazione e la disoccupazione dei neurite o le registrazioni MEA. Partendo da una coltura differenziata di neuroni coltivati per 4 o più settimane in un formato più grande (ad esempio, un piatto di coltura di 10 cm), i neuroni vengono incubati con una proteasi per 40-45 min, triturati delicatamente a dissociato e resuspend. Le celle vengono poi distribuite in multi-pozzi compatibili con HCS, riinserite su substrati compatibili con coni di crescita di imaging (freccia gialla) o altre strutture, o su multi-pozzi adatti per registrazioni di array multielettrodi. Barre di scala: 27 m, 5 m, 2,5 m, 130 m (da sinistra a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo dimostrato una procedura semplice per la sospensione e la ritorsione delle colture neuronali umane che ottimizza la vitalità, il successo della differenziazione e l'imaging subcellulare in modo compatibile con piattaforme di screening ad alto contenuto, e altri saggi rilevanti per la scoperta di farmaci. Nella Figura 6 vengono illustrati il flusso di lavoro complessivo e gli esempi di tali applicazioni.
Anche se qui ci siamo concentrati sui neuroni derivati da hiPSC che sono diretti verso un destino di neuroni corticali, ci aspettiamo che questo metodo dovrebbe essere ugualmente applicabile ai neuroni derivati da cellule staminali embrionali umane, e ai neuroni derivati dalle cellule staminali dirette verso altri fenotipi neuronali14,15,16,17,18. Inoltre, postulamo che questa procedura proteasi estesa potrebbe essere vantaggiosa per altre situazioni che richiedono la sospensione delle cellule che hanno una lavorazione in maglia neurite stabilita, ad esempio per lo smistamento FACS o l'analisi a cella singola dei neuroni primari19 , 20.
La riplaccatura dei neuroni derivati da hiPSC fornisce un sistema modello praticabile in cui studiare i meccanismi cellulari e molecolari di molti eventi biologici chiave. Ad esempio, questa procedura può facilitare studi dettagliati sulle caratteristiche di escrescenza e di crescita dei neuriti umani e il confronto dei risultati con l'ampia base di conoscenze costruita da decenni di studio di altre specie, sia vertebrate che invertebrate. Troviamo che la procedura di replating ha reso più facile ottimizzare le condizioni per generare coni di crescita più grandi che sono adatti per la valutazione ottica della struttura e della funzione subcellulare (Figura 6). In confronto, i coni di crescita più tipicamente osservati durante la differenziazione iniziale dei neuroni dagli hiPSC tendono ad essere piccoli e compatti, e la densa gamma di cellule non neuronali in tali colture rende difficile sia regolare le condizioni del substrato per promuovere la diffusione del cono di crescita e immaginare coni di crescita individuali all'interno dell'ambiente tissutale complesso. Così, ristrutturare i neuroni su un piatto fresco fornisce una "ardesia più pulita" su cui visualizzare i coni di crescita in buone condizioni di imaging.
La riplaccatura è particolarmente vantaggiosa quando si utilizzano piattaforme di coltura cellulare adatte per HCS perché riduce notevolmente il tempo totale in cui le colture vengono coltivate in piccoli volumi. I piccoli volumi di lavoro dei singoli pozzi di 96, 384 o 1536-pozzi multi-pozzi (circa 100, 50 e 5 microlitri volume di lavoro, rispettivamente) di solito richiede frequenti (cioè, ogni giorno) cambiamenti dei media per contrastare l'evaporazione e l'esaurimento dei nutrienti. I frequenti cambiamenti dei media sono costosi, non solo in termini di reagenti e manodopera, ma possono compromettere la vitalità delle culture diluindo i media condizionati e aumentando le probabilità che le cellule si stacchino dal substrato a causa di turbolenze meccaniche. La placcatura di hiPSC può anche facilitare la registrazione dell'attività fisiologica utilizzando array multielettrodi21,22, o l'imaging live di colture nei saggi di fenotipi neuronali dinamici23.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è un componente del National Cooperative Reprogrammed Cell Research Groups (NCRCRG) per studiare le malattie mentali ed è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH U19MH1 2015-0644. Il lavoro iniziale è stato sostenuto anche dalla sovvenzione NIH NS070297. Ringraziamo i dottori Carol Marchetto e Fred Gage, The Salk Institute, per aver fornito la linea WT 126 di cellule progenitrici neurali, e i dottori Eugene Yeo e Lawrence Goldstein, UC San Diego per aver fornito la linea CVB WT24 di cellule progenitrici neurali. Ringraziamo Deborah Pre nel laboratorio della dott.ssa Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, per le discussioni utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1 mL of 200 mM stock to 1 L of N2B27 media |
| Dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50x) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 mL to 1 L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/mL final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1 L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µL to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5 mL to 1 L N2B27 media |
| N2 (100x) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5 mL to 500 mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10 mL to 1 L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10 cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1,000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100 mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1 mL/10 cm plate for 30-45 min; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 mL of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| Mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| Rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| Chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| Chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| Rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| Mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| Rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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