Summary
Verstrekken van eencellige gevoeligheid, is real-time stroom cytometry uniek geschikt voor het kwantificeren van multimodale receptor functies van levende culturen. Met behulp van neurale volwassen voorlopercellen, de P2X7 receptor functie evalueerden via calcium toestroom gedetecteerd door calcium indicator kleurstof, transmembraan porie vorming door ethidium bromide opname en fagocytose met behulp van fluorescerende latex kralen.
Abstract
Live-cel stroom cytometry wordt steeds gebruikt onder biologen van de cel te kwantificeren van de biologische processen in een levende cel cultuur. Dit protocol beschrijft een methode waarbij live-cel stroom cytometry wordt uitgebreid op de veelvoudige functies van de P2X7 receptor activering in realtime analyseren. Met behulp van een module van de tijd op een stroom cytometer geïnstalleerd, kan live-cel functionaliteit worden beoordeeld en uitgezet gedurende een bepaalde periode te verkennen de kinetiek van calcium toestroom, transmembraan porie vorming en fagocytose. Deze eenvoudige methode is gunstig als alle drie canonieke functies van de P2X7 receptor kunnen worden beoordeeld met behulp van één machine, en de verzamelde gegevens die zijn uitgezet in de tijd informatie over de gehele bevolking van de live-cel in plaats van eencellige opnames vaak geeft met behulp van de technisch uitdagende patch-clamp methoden verkregen. Calcium toestroom experimenten een calcium indicator kleurstof gebruiken, terwijl P2X7 porie vorming assays afhankelijk van ethidiumbromide wordt mag worden doorgelaten door de transmembrane porie gevormde op hoge agonist concentraties. Geel-groen (YG) latex parels worden gebruikt voor het meten van fagocytose. Specifieke agonisten en antagonisten worden toegepast om de onderzoeken van de effecten van de P2X7 receptor activiteit. Deze methoden kunnen individueel, worden gewijzigd om kwantitatieve gegevens op elk gewenst aantal calcium kanalen en purinergic en scavenger receptoren. Samen genomen, benadrukken ze hoe het gebruik van real-time live-cel stroom cytometry is een snelle, rendabele, reproduceerbare en kwantificeerbare methode te onderzoeken P2X7 receptor functie.
Introduction
De studie van purinergic signalering is breed en veelzijdig, waarbij cellulaire fysiologie, biochemie en farmacologie. Purinergic signalering is betrokken bij een oneindig aantal cellulaire en moleculaire processen, door kanker en celcyclus verordening cel-cel communicatie en stamcelbiologie; Zo bestaat er vaak een potentieel te moduleren purinergic signalering voor een therapeutisch nut hebben. Van de purinergic-receptoren, heeft de P2X7 receptor aanzienlijke aandacht gekregen in de afgelopen jaren als gevolg van haar potentieel als een therapeutisch doel voor talrijke inflammatoire voorwaarden1. Methoden voor het bestuderen van de receptor hebben ontwikkeld en aangepast jaren om dit onderzoek2,3,4,5. Hier beschrijven we een live-cel stroom cytometry methode om te onderzoeken van de veelvoudige functies van P2X7 receptoren in volwassen neurale voorlopercellen, afgeleid van de subventriculaire zone (SVZ) en de hippocampal getand gyrus.
De P2X7 receptor werd voor het eerst beschreven als de P2Z receptor, of de 'de dood van de cel'-receptor, als de activering met hoge concentraties van adenosine trifosfaat (ATP) resulteert in de vorming van een grote transmembraan porie luchtdoorlatend moleculen tot 900 Da6. Dit leidt tot de omlegging van het cytoskeletal, transmembraan porie vorming en, potentieel, apoptosis en/of necrose7. Traditioneel, is deze functie van P2X7 wordt gekwantificeerd door de opname van grote molecuulgewicht kleurstoffen zoals YO-PRO-1 of ethidium bromide (en), die lichten wanneer tussenliggende met DNA3,8. Plaat lezer methoden, die snelle en toestaan voor upscaling, over het algemeen toegestaan niet voor de waarneming van kinetiek. De hier beschreven methode is gebaseerd op ethidium opname en kan de verhoging van fluorescentie in acht worden genomen na verloop van tijd bieden een grotere diepte van informatie met betrekking tot de snelheid van de vorming van de porie. P2X7 receptoren zijn sindsdien gebleken om een aantal nonimmune functies, met verschillende reacties afhankelijk van blootstelling tijd en agonist concentratie9,10. Korte activering door lagere concentraties van ATP resultaten in catie toestroom ten behoeve van de neurotransmitter en signaal transductie11. Met behulp van cytometry van de stroom te meten van calcium toestroom overwint de problemen in verband met omslachtig en technisch uitdagende methoden — met name patch klemmen voor het meten van inkomende stromen die onschatbare nadere bijzonderheden over de wijziging van potentieel over te geven een celmembraan maar laat niet voor bevolking analyse2. De derde functie van P2X7 receptoren treedt op in de afwezigheid van ATP, waar P2X7 receptoren hebben aangetoond dat fagocytose in zowel het immuunsysteem en het zenuwstelsel9,12,13te vergemakkelijken. Vooruitgang in de microscopie technieken hebben toegestaan de visualisatie van cytoskeletal herschikkingen tijdens de opname, hoewel kwantificering en bevolking analyse kan nog steeds een uitdaging voorleggen.
De live-cel stroom cytometry methode gedetailleerde hier zorgt voor het onderzoek van alle drie belangrijkste functies van P2X7 receptoren in real-time. De opname van een tijd module apparaat op de stroom cytometer kan temperatuurcontrole en voortdurend roeren van cellen in suspensie. Agonist en antagonist stimuli kunnen geleverd worden binnen een seconde, waardoor de in de omgeving van ononderbroken meting van de cellulaire respons. Dit biedt een snelle en eenvoudige methode om te kwantificeren reproducibly functie terwijl het vermijden van het gebruik van meerdere assay systemen. Het is belangrijk op te merken dat dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk celtype en kan worden gebruikt om andere subtypen van de receptor gezien de opneming van specifieke agonisten of remmers, afhankelijk van hun eigenschappen onderzoeken.
Protocol
Dieren werden behandeld in overeenstemming met de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en goedgekeurd voor gebruik door de Griffith University dier ethische commissie.
1. Neurosphere cultuur van neurale voorlopercellen van de volwassen SVZ en Hippocampus
Opmerking: Het protocol van de dissectie hier gepresenteerd is gebaseerd op werk van Walker en Kempermann, en een gedetailleerd protocol voor de dissectie van neurale voorlopercellen van volwassen muizen is elders beschikbaar14. Kweekomstandigheden zijn gewijzigd van Babu en collega's15. Volwassen vrouwelijke C57BL/6 muizen leeftijd 8-12 weken werden gebruikt.
- Bereiden in een biologische veiligheid kabinet, het kweekmedium (neurale Basaal medium) aangevuld met neurale stamcellen proliferatie supplement, 2 mM glutamine, 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 10 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF) en 2 µg Mo/mL heparine.
- Twee muizen bij CO2 inademing euthanaseren. Als alternatief, anesthetize van de muizen volgens de richtlijnen van de institutionele en hen onmiddellijk euthanaseren door cervicale dislocatie. Hun hoofden spray met 70% ethanol en onthoofden hen. Elk hoofd overbrengen in een steriele buis met Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) met 1 x penicilline/streptomycine oplossing (P/S).
- Ontledingen in een laminaire flow hood onder een Microscoop dissectie uitvoeren.
- Pincet en dissectie schaar, weefsel en bot bloot van de hersenen te verwijderen en het overbrengen van een steriele schotel met HBSS met P/S.
- De ventrale zijde van de hersenen plaats omhoog en een scalpel blad gebruik te maken van een volledige coronale incisie in de optiek opticum. Houd de hersenen gestage met de pincet en gebruik van een snel, schoon, neerwaartse beweging. Vermijd zagen om te minimaliseren van celdood en voor het behoud van de structuur van het weefsel.
Opmerking: Als niet veilig gesteld, de hersenen vooruit kan kantelen tijdens het knippen, afbreuk te doen aan het aantal voorlopercellen verkregen de SVZ. - Isoleren van de SVZ uit de rostraal helft van de hersenen.
- Zoek beide ventrikels, gescheiden door het septum, met het corpus callosum vormen een witte brug boven hen.
- Gebruik pincet te verwijderen van het tussenschot scheidt de twee ventrikels en isoleren van de laterale muren van de voorste laterale ventrikels. Doe dit door het snijden van weg boven, onder, aan de zijkanten en aan de voorzijde met een fijne dissectie schaar. Er blijft alleen een kleine cup-achtige vorm.
- Bereiden van een schone petrischaal deksel met een paar druppels van HBSS in het midden en de SVZ overbrengen in de vloeistof. Het weefsel te drogen of om te raken van een droog oppervlak niet toegestaan. Staan aan de kant terwijl de ontrafeling van de hippocampi.
- Isoleren van de hippocampi uit de caudal helft van de hersenen.
- Maak een middellijn gesneden tussen de hemisferen te verbreken van het corpus callosum. De laterale ventrikels gebruiken als een gids en zachtjes ontvouwen de cortex om de hippocampus bloot te stellen. Zodra de cortex is afgerold, kan het zeepaardje worden gezien als een dichte, wit, gebogen structuur.
- Gebruik fijn dissectie schaar of pincet te isoleren van de hippocampus uit het naburige weefsel.
- Met een tang, Verwijder overtollige witte stof, bloedvaten en eventuele membraanachtig weefsel die betrekking hebben op de hippocampus.
- Een schone petrischaal deksel voorbereid met een paar druppels van HBSS voor te bereiden en de hippocampus overbrengen in de vloeistof. Herhaal voor de andere hemisfeer.
- Zodra de hippocampus en de SVZ van twee muizen zijn geïsoleerd en overgedragen aan hun respectieve petrischaal deksels, mechanisch dobbelstenen het weefsel met behulp van een scalpel blad. Hak het weefsel in een petrischaal deksel voor ongeveer 1 minuut, roterende elke 10 s totdat het weefsel soepel verschijnt en alleen fijne stukken blijven. Neem een schone scalpel blad en herhaal voor de andere schotel, dobbelen het weefsel voor 1 min.
- Met behulp van een pipet 1 mL, alle het weefsel van elke petrischaal deksel te scheiden van buizen met 1 mL van 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) overbrengen. Gebruik één tube voor de SVZ en één buis voor de hippocampus.
- Dit doen door de eerste pipetteren ongeveer de helft van de trypsine-EDTA aan het weefsel in de schotel om luchtbellen te minimaliseren en te voorkomen dat het weefsel komen in contact met de droge Pipetteer tip als het wordt overgedragen aan de buis. Spoel de schotel en het scalpel blad met de rest van de trypsine-EDTA toe te voegen aan de buis te verzamelen zo veel weefsel mogelijk.
- Incubeer het weefsel met de trypsine in een waterbad 37 ° C gedurende 30 minuten, schudden van de buis om 10 min om het weefsel goed te distantiëren.
- Triturate het gebruik van een brand-gepolijst glas Pipet van Pasteur voor het maken van een enkele celsuspensie weefsel. Wees voorzichtig niet te overtriturate aangezien dit leiden buitensporige cellysis tot zal. Dit is een cruciale stap voor optimale weefsel dissociatie.
- Observeren van de inhoud van de buis tijdens het verpulvering en stoppen bij de vroegste tekenen dat de meerderheid van weefsel klontjes zijn verwijderd. De trypsine oplossing moet worden licht bewolkt wanneer de cellen zijn ingegaan eencellige schorsing, hoewel sommige klontjes kunnen achterblijven.
Opmerking: Als een indicatie is het doorgeven van de schorsing op en neer 10 x-15 x voldoende. - Toevoegen van kweekmedium tot 5 mL te neutraliseren de trypsine, spin bij 300 x g gedurende 3 min. Wash nog eens 2 x met HBSS en pas het medium door een zeef cel 70 µm te verwijderen van elk weefsel samengeklonterd.
- Alle cellen in 15 mL medium overbrengen in een maatkolf van T75 cel cultuur.
Opmerking: Bollen moeten vormen in de passage nul (P0) SVZ cultuur na 7-10 dagen en na 15-20 dagen in de hippocampal cultuur. Onthouden van wassen of voeding de cellen gedurende deze tijd om te maximaliseren van het aantal neurale voorlopercellen in cultuur. Als meer progenitoren nodig zijn, of om te verminderen de incubatietijd P0, is het mogelijk om te verhogen van het aantal muizen opgeofferd. - Handhaven van culturen bij 37 ° C met 5% CO2 , en na de beginfase P0 cultuur, passage elke 7-10 dagen zo nodig met behulp van een biologische veiligheid kabinet en standaard weefselkweek praktijken.
Opmerking: De hippocampal P0-cultuur moet genereren genoeg bollen tot passage in een maatkolf van T25; de cultuur van SVZ zal genereren veel meer terreinen en in een T75 kan worden gepasseerd. Als de hippocampal P0-sferen hebben nageleefd, kunt een 200 µL pipet zachtjes heffen de sfeer. - Passage de bollen wanneer ze 150 tot 200 µm in diameter bereiken. Verzamelen van de bollen en medium in een tube van 15 mL en laat de bollen te regelen door de zwaartekracht als alternatief voor ongeveer 5 min., draaien op een lage snelheid (100 x g) gedurende 2 minuten.
- Verwijder het medium en distantiëren van de cellen met dissociatie reagens voor 7-10 min, afhankelijk van de grootte van de bollen.
Opmerking: De dissociatie reagens gebruikt zal significante effecten hebben op de uitkomst van de cultuur, zo gelieve te verwijzen naar de Tabel van de materialen voor specifieke informatie. - Wash de cellen door toevoeging van 5 mL van HBSS de cell oplossing en centrifugeer bij 300 x g gedurende 3 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen, resuspendeer de cellen in een kweekvloeistof en zaad op ongeveer 150.000 cellen in 5 mL medium in een maatkolf van T25 cel cultuur of een vergelijkbare groep. Het handhaven van de culturen op 37 ° C en 5% CO2.
- Neurale progenitor cel status bevestigen door het identificeren van de expressie van markeringen in een cel van de stam zoals Sox2 en ASCL1 alvorens tot elke stroomafwaartse protocol9.
Opmerking: Dit kan gebeuren door de voorkeur van de onderzoeker (bijvoorbeeld Immunochemie door microscopie, stroom cytometry of westelijke vlek, of met behulp van kwantitatieve polymerase-kettingreactie (qPCR)).
2. voorbereiding van de schorsing van een eencellige analyse door Stroom Cytometry
-
De vereiste media voor te bereiden. Deze omvatten de volgende.
- Bereiden nb+ medium met 145 mM NaCl, 5 mM KOH 10 mM HEPES, 5 mM D-glucose, 0,1% bovien serumalbumine (BSA) en 0.1 mM CaCl2. Dit medium wordt ook gebruikt in een calcium-vrije vorm, met 0,1 mM CaCl2 weggelaten.
- K+ medium met 145 mM KCl, 5 mM KOH 10 mM HEPES, 5 mM D-glucose en 0,1% BSA voor te bereiden.
Opmerking: Deze media werden uitgebreid geoptimaliseerd en worden beschreven in eerdere publicaties4,5. - Bereiden Voorraad ATP door weging voldoende ATP poeder voor ongeveer 20 mL van een voorraad van 100 mM. Los het poeder in 17 mL KCl buffer (145 mM KCl, 5 mM KOH, en 10 mM HEPES, pH 7.5) en langzaam, al roerend, voeg toe 2 mL tetramethylammoniumhydroxide 18% (m/v) (TMA) aan de oplossing om de pH naar 6,8-7.0.
- Het uiteindelijke volume tot 20 mL. Niet meer bedragen dan de pH verleden 7.0. Winkel de voorraad bij-80 ° C; Merk op dat de ATP-aliquots stabiel gedurende ten minste 6 maanden zijn.
Opmerking: De gratis molecuulgewicht van watervrij ATP is 551.14 g/mol, en dit omvat niet het molecuulgewicht van het water en dinatrium moleculen, die kan variëren van charges en voor de berekeningen rekening moet worden gehouden. TMA is giftig en wees voorzichtig bij het verwerken. Lees de veiligheidsgegevens blad en voorbereiden van de voorraden in een zuurkast kast. - Voorraad BzATP voor te bereiden door het oplossen van de BzATP in ultrazuiver H2O voor een voorraad eindconcentratie van 10 mM.
- Maak een suspensie van eencellige zoals beschreven in stappen 1.16 en 1.17. Met behulp van een hemocytometer of automatische cel teller cellen tellen. Resuspendeer de cellen in het vereiste medium (bijvoorbeeld nb+ -medium, kweekmedium) voor het experiment wordt uitgevoerd (zoals hieronder beschreven) en plaats de cellen op ijs in de tussentijd.
- Voor elk experiment, zorgen er genoeg monster besturingselementen voor voorwaartse en zijdelingse scatter, alsmede voor de kalibratie van spanning en compensatie-instellingen. Let op, als een indicatie, dat bollen geteeld in een maatkolf van T75 meestal ongeveer 8 x 106 cellen per kolf opleveren.
-
Stel de stroom cytometer met behulp van de controlemonsters.
- Hiermee kunt u dat voorwaartse en zijdelingse scatter selectief poort de levende cellen.
Opmerking: Forward scatter geeft informatie over de grootte van de cel op basis van lichte diffractie, terwijl kant scatter een zekere mate van interne complexiteit of granulariteit biedt. Stroom events met kleine naar voren en kant scatter kunnen worden beschouwd als dode cellen. - De kruisspanning en winst van de stroom cytometer volgens de instructies van de fabrikant. Een trial monster om ervoor te zorgen het vastleggen van de gegevens op de maximale fluorescentie intensiteit worden uitgevoerd. Geen schadeloosstelling is vereist voor enkellijns acquisities.
- Hiermee kunt u dat voorwaartse en zijdelingse scatter selectief poort de levende cellen.
3. meting van Calcium toestroom door Live-cel Stroom Cytometry
- Na de voorbereiding van een eencellige schorsing, resuspendeer de cellen in 1 mL van calcium-vrije nb+ medium en laad ze met 2 ng/mL van calcium indicator kleurstof volgens protocol van de fabrikant (Zie de Tabel van materialen) met 10 µL van 5% pluronic zuur. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- De cellen door toevoeging van 3 – 5 mL van calcium-vrije nb+ medium en centrifugeren voorzichtig wassen (200 x g voor 4 min). Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in de calcium-vrije nb+ medium, een tweede keer wassen.
- Resuspendeer de cellen in 1 mL van calcium-vrije nb+ medium, plaats ze op het ijs, en laten de esterify voor 30 min.
- Wassen van 1 x meer door toevoeging van 3 – 5 mL van K+ medium en centrifugeren (200 x g voor 4 min); vervolgens resuspendeer de cellen in K+ middellange en aliquoot hen in fluorescentie geassisteerde cell sorting (FACS) bij een concentratie van 1 x 106 cellen per 500 µL per FACS buis buizen.
Opmerking: Het aantal FACS buisjes per monster zal afhangen van het aantal behandelingen en herhaalt worden geleverd. - Plaats de FACS buizen op ijs totdat de cellen zijn klaar om te worden geanalyseerd. Laat niet de cellen op het ijs voor een langere periode maar de test zo spoedig mogelijk beginnen.
- Voor sommige monsters, preincubate de cellen met P2X7 specifieke receptor remmer AZ10606120 (1 µM voor 10 – 15 minuten) of A438079 (10 µM gedurende 30 minuten) bij 37 ° C vóór de analyse.
- Een paar minuten voordat u het eerste monster, voeg CaCl2 (aan een eindconcentratie van 1 mM in de buis FACS) en plaats de buis in een waterbad 37 ° C te herstellen.
- Daling van een schoon, kleine magnetische roerder in de buis FACS en positie de buis in de tijd-module gekoppeld aan een circulerende waterbad 37 ° C te controleren de temperatuur van het monster. Selecteer een laag roeren snelheid verkeer te waarborgen van het monster zonder de invoering van een vortex-effect. Plaats van de adapter van water jas buis op het monster platform en sluit de arm van de hefboom van de FACS machine.
- Monster overname initiëren en uitvoeren van het monster gedurende 3 minuten op ongeveer 1000 evenementen per seconde.
- Op de 40 s merk, snel verwijderen van de buis en het toevoegen van de P2X7-agonist, 1 mM ATP of 300 µM BzATP, en het vervangen van de buis om door te gaan van de overname.
- Terwijl het eerste monster opneemt, het tweede monster met CaCl2 bereiden en plaats deze in 37 ° C aan om voldoende tijd voor de cellen om op te warmen vóór de analyse. Zodra het eerste monster heeft beëindigd, schoon de inname door het uitvoeren van een watermonster, en dan de overname van het tweede monster kan beginnen zoals beschreven in stappen 3.8 en 3.9. Altijd schoon de inname tussen de monsters.
4. meten van de porie vorming door Live-cel Stroom Cytometry
- Maak een suspensie van eencellige zoals beschreven in stappen 1.16 en 1.17. Opslaan van een paar milliliter van het oude medium, gebruiken om resuspendeer de cellen bij een concentratie van 1 x 106 cellen per 100 µL per FACS buis en plaats deze op ijs totdat u.
- Voordat u de test uitvoert, voeg 900 µL van K+ medium voor een eindvolume van 1 mL en plaatsen van de buizen in een waterbad 37 ° C gedurende 10 minuten om te herstellen.
- Indien van toepassing, de cellen met behandelingen, met inbegrip van de P2X7-specifieke remmers AZ10606120 preincubate (1 µM voor 10 – 15 minuten) of A438079 (10 µM voor 30 min).
- Onmiddellijk voorafgaand aan het uitvoeren van de bepaling, 25 µM ethidiumbromide toevoegen aan de FACS buis; Vervolgens voegen de magneetroerder, plaatst u deze op de machine FACS volgens stap 3.7 en beginnen de overname.
Opmerking: Ethidiumbromide is giftig en wees voorzichtig bij het hanteren van het. Beschikken over gebruikte FACS buizen op de juiste manier. - Toevoegen om de vorming van de poriën in de celmembraan, 1 mM ATP of 100 µM BzATP 40 s na de start van de overname.
- De monsters worden uitgevoerd op ongeveer 1000 evenementen per seconde voor 6 min.
- Terwijl in het eerste voorbeeld wordt uitgevoerd, neemt de tweede monster van het ijs en plaats deze in het waterbad 37 ° C aan om voldoende tijd voor de cellen te herstellen voordat de analyse. Zodra het eerste monster heeft afgewerkt met de verwerving, schoon de inname door het uitvoeren van een watermonster; het tweede voorbeeld kan vervolgens worden geplaatst op de machine om te beginnen met opnemen zoals beschreven in stappen 3.8 en 3.9.
5. meten van fagocytose door Live-cel Stroom Cytometry
- Maak een suspensie van eencellige zoals beschreven in stappen 1.16 en 1.17. Resuspendeer de cellen in geconditioneerde medium en aliquot hen in FACS buizen bij een concentratie van ten minste 1 x 106 cellen per 100 µL per FACS buis. Verdun de cellen om een eindconcentratie van 1 x 106 cellen/mL met nb+ medium (bijvoorbeeld het toevoegen van 900 µL van nb+ medium) en plaats de cellen op ijs totdat de analyse wordt uitgevoerd.
- Gebruik 1 µm van YG latex parels (microbolletjes) als fagocytische doelen voor real-time fagocytose testen.
Opmerking: Andere kleuren kunnen ook worden vervangen, maar verschillend formaat kralen bleken te zijn van ontoereikende doelstellingen van fagocytose4. - Voordat u het eerste monster, de cellen overbrengen in een waterbad 37 ° C en incubeer hen voor ongeveer 7-10 min om de cellen te herstellen.
-
Voeg eventuele behandelingen die preincubation hun respectieve buizen, met inbegrip van 1 mM ATP gedurende 15 minuten, 300 µM geoxideerd ATP (oxATP) voor 40 min, 20 µM cytochalasin D voor 20 min en 4% paraformaldehyde (PFA) voor 20 min.
- Geen preincubation is vereist voor 5% menselijk serum. Als behandelingen worden toegevoegd op ongeveer hetzelfde moment, kunnen de monsters worden uitgevoerd in omgekeerde volgorde terwijl de anderen blijven broeden. Bijvoorbeeld, de besturingselementen en uitvoeren serum eerst, vervolgens het ATP-behandelde monster, gevolgd door cytochalasin D en PFA en oxATP laatst.
- Leg het monster op de cytometer met de magneetroerder zoals beschreven in stappen 3.8 en 3.9 en vervolgens starten monster acquisitie.
- Verwijder het monsterbuisje uit de machine 15 – 20 s na de start van de overname, en voeg 5 µL van onverdunde YG parels. Het monsterbuisje FACS terug en de overname. De monsters voor 7-8 min op ongeveer 1000 evenementen/s uitvoeren.
- Terwijl in het eerste voorbeeld wordt uitgevoerd, neemt de tweede monster van het ijs en plaats deze in een waterbad 37 ° C aan om voldoende tijd voor de cellen te herstellen vóór de analyse. Zodra het eerste monster wordt gebeëindigd, schoon de inname door het uitvoeren van een watermonster en vervolgens beginnen acquisitie op het tweede monster zoals beschreven in stappen 3.8 en 3.9.
6. de gegevensanalyse
- De gegevens exporteren naar een werkblad. De data-analyse zal afhangen van de experimentele vraag.
Opmerking: Let erop dat verschillende punten verschillende basislijn intensiteiten, wellicht dus het is belangrijk om het uitvoeren van de bepaling voor een aangewezen tijd aan het begin (ongeveer 40 s) vóór elke agonisten toe te voegen en te normaliseren van de gegevens door het berekenen van de verandering in de fluorescentie (de fluorescentie op een gegeven tijdstip [F] gedeeld door de fluorescentie op tijdstip nul [F0] of F/F0). - Bereken de oppervlakte onder de curve of de som van de trapezoïdes gemaakt onder de kromme voor elke 10 s tijd periode16te kwantificeren het tarief of de kinetiek van de P2X7 functie in kwestie.
- Bepalen van de effecten van de behandelingen, de intensiteit van de fluorescentie gemiddeld over de laatste 10 – 20 s van opname en vergelijken van de behandelingen. Bepalen van de betekenis door t-test of variantie-analyse.
Representative Results
Neurale voorlopercellen celculturen
Neurale voorlopercellen bol culturen afgeleid met behulp van deze methode moeten fase helder en hebben een gladde ronde rand (figuur 1AB). In gezonde culturen, kan kleine microspikes worden waargenomen op de randen (Figuur 1 c). Bij late passages, of als onvoldoende gevoed, bollen kunnen vormen een holle kop (Figuur 1 d) vorm(en) grote langwerpige (figuur 1E, aangegeven door de pijl). Deze culturen mag niet worden gebruikt voor stroom cytometry of andere downstream toepassingen, als deze functies kan zijn indicatief van differentiatie. Controleer de status van de neurale voorlopercellen, de cellen werden verguld op glas coverslips bekleed met poly-L-ornithine en laminin voor immunocytochemie (figuur 1F en hogere confluentie, figuur 1G). Cellen werden gekleurd voor GFAP, nestin, Sox2, vimentin, ASCL1, BLBP, Prox1 en DCX de cellen worden geïdentificeerd als Type 2 voorlopercellen (hippocampus) of Type C voorlopercellen cellen (SVZ)9. Cellen moeten de kern van een welomschreven en uitgebreide processen.
Figuur 1: de cultuur van de cel van de representatieve hippocampal neurale voorlopercellen. (A) Hippocampal neurale stamcellen worden geïsoleerd van volwassen muizen en gekweekt als neurospheres tot ongeveer 100 tot 150 µm in diameter. (B) Neurospheres moeten een soepele periferie, (C) en kleine microspikes kan worden waargenomen op hun oppervlak. Wanneer de bollen zijn te lang in de cultuur, kunnen ze vormen cup (D) of (E) langwerpige vormen. Deze culturen moeten niet worden gebruikt voor experimenten. Controleer de status van de neurale voorlopercellen van de cellen, seed hen als een eencellige schorsing voor poly-L-ornithine (PLO) en laminin-gecoat glas coverslips voor Immunochemie. Cellen moeten een kleine soma en vertakkende processen, (F) bij lage confluentie en (G) klaar voor Immunochemie. Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Calcium toestroom door live-cel stroom cytometry
Dit protocol voorziet in de analyse van de P2X7 receptor functie als een kanaal van de calcium in real-time. De kinetiek van receptor functie, evenals de effecten van verschillende agonisten en antagonisten, kunnen ook worden beoordeeld. Wanneer uitgezet tijd, calcium toestroom in de hippocampal en SVZ neurale voorlopercellen was over het algemeen vergelijkbaar (figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk). Agonisten (ATP of BzATP) werden toegevoegd op de 40 s merk, zoals aangegeven door de rode pijl. Voor een kort moment, wordt de buis verwijderd uit het punt van de opname toe te voegen van de agonist, resulterend in de gegevenspunten van nul. Dit zal zorgen voor de identificatie van de tijd waarop de agonist werd toegevoegd. BzATP activeert snel P2X7 receptoren, de ionkanaal opent en calcium toestroom, die bindt aan Fluo-8 en licht toe te staan. ATP toepassing in het algemeen resulteert in een meer geleidelijke toestroom van calcium. Het heeft een lagere affiniteit met P2X7 in vergelijking met BzATP en zal ook leiden tot G-eiwit-gekoppelde receptor activering, een langzamer signalering traject die releases van calcium uit het endoplasmatisch reticulum. De opneming van antagonisten van de P2X7 A438079 en AZ10606120 (gegevens niet worden weergegeven) de toestroom van de calcium in reactie op agonist toepassing verminderd.
Figuur 2: Live-cel calcium toestroom in neurale voorlopercellen van de hippocampus en SVZ. P2X7 receptor calcium kanaal functie werd aangetoond in (A) hippocampal en (B) SVZ afkomstige voorlopercellen door veranderingen in Fluo-8 fluorescentie. Toepassing van de algemene P2X-agonist ATP en de P2X7-agonist BzATP leiden tot P2X7 ionenkanalen openen, waardoor calcium toestroom. De toestroom is geblokkeerd met de P2X7-specifieke remmers A438079 of AZ10606120 (gegevens niet worden weergegeven). F = fluorescentie; F0 = fluorescentie op tijdstip nul. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Porie vorming door live-cel stroom cytometry
Transmembraan porie vorming is een canonieke functie van P2X7-receptoren, resultaten in macromolecule uitwisseling, en kan leiden tot celdood. Ethidium+ is een grote molecule (314 Da) uitgesloten van gezonde cellen; de opname- en de daaropvolgende bekomt met DNA resulteert in fluorescerende uitstoot en kan worden gebruikt voor het beoordelen van het vermogen van P2X7 receptoren te vormen van transmembraan poriën. Na de toepassing van de agonisten ATP (1 mM ATP) en BzATP (100 μM) op de 40 s (aangegeven door de pijl), time-resolved stroom cytometry vangt de ethidiumbromide invoeren van de cellen in real-time (figuur 3A). Dit effect werd verzwakt door de P2X7-specifieke remmer AZ10606120. De bepaling van ethidium bromide opname toont een functionele P2X7 receptor C-terminus17 en is goed bewijs voor full-length P2X7 receptor expressie. ATP concentratie-reactie testen illustreren de gevolgen van de concentratie van de agonist op de vorming van de porie van het P2X7, met behulp van verandering in ethidium bromide fluorescentie na verloop van tijd (figuur 3B). Agonist dosis concentratie curven samen met receptor-specifieke remmers zijn er sterke bewijzen voor receptor activering.
Figuur 3: P2X7 transmembraan porie vorming gemeten door ethidium opname. De toevoeging van ethidium bromide momenten vóór het begin van de acquisitie wordt gebruikt voor het meten van de vorming van P2X7 transmembraan poriën. Hoge concentraties van ATP en BzATP resultaat in (A) P2X7 receptor porie vorming, waardoor ethidiumbromide in te voeren van de cel. De P2X7-remmer AZ10606120 verzwakt dit fenomeen en levert het bewijs voor functionele P2X7 receptoren. (B) ATP concentratie-reactie testen aangetoond aanzienlijke porie vorming op 500 μM en 1 mM maar niet bij lagere concentraties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Fagocytose door live-cel stroom cytometry
Onze fractie heeft eerder aangetoond dat extracellulaire ATP remt de P2X7 gemedieerde fagocytose door distantiëren van de P2X7 C-terminus van het cytoskelet, in het bijzonder nonmuscle myosin IIA18,19. Deze methode breidt op deze bevindingen om aan te tonen van de P2X7 receptor betrokkenheid bij fagocytose door hippocampal en SVZ neurale progenitor cells in real-time (Figuur 4, een voorbeeld van hippocampal fagocytose). Ongeremd fagocytose (control) niveaus van 1 µm YG latex parels werden opgericht als positieve controle. ATP geremd de fagocytose van YG kralen in dezelfde mate als de niet-specifieke remmers, namelijk PFA fixatie en de actine polymerisatie remmer cytochalasin D, terwijl 5% serum alle aangeboren fagocytose20 afgeschaft.
Figuur 4: YG kraal opname demonstreren de fagocytische capaciteit van neurale progenitoren via P2X7 receptoren. YG kraal ICT door neurale voorlopercellen is waarneembaar met behulp van live-cel stroom cytometry in real-time. Controle niveaus van fagocytose worden in eerste instantie vastgesteld, en als het aantal cellen dat toelaat, bevestigde aan het einde van de termijn. Betrokkenheid van P2X7-receptoren wordt aangegeven door de remming van fagocytose in aanwezigheid van ATP, zoals dit de C-terminus van het cytoskelet van de membraan distantieert, P2X7-gemedieerde cytoskeletal herschikkingen te voorkomen. De toepassing van ATP geblokkeerd fagocytose in dezelfde mate als bij het gebruik van niet-specifieke remmers van fagocytose, met inbegrip van paraformaldehyde (PFA) en cytochalasin D (CytD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit document stelt een gedetailleerd protocol voor de analyse van de P2X7 receptor functie in neurale voorlopercellen celculturen afgeleid van de volwassen neurogene niches. De mogelijke toepassingen voor volwassen neurale progenitor cells variëren van onderzoek voor therapeutische doeleinden, en dus de methode van cultuur moet robuust en reproduceerbaar. Er zijn een aantal belangrijke aspecten bij dit protocol die mogelijk van invloed op de kwaliteit van de cultuur van het eindpunt. Zodra van de schedel verwijderd, de hersenen mogen niet te drogen en de dissectie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd. Met name met de hippocampus, zal extra zorgvuldigheid alle bloedvaten of membraanachtig weefsel te verwijderen resulteren in superieure progenitor cel opbrengsten. Het proces van dissociatie en verpulvering kan sterk invloed hebben op het aantal bollen verkregen in een cultuur; schudden van het weefsel tijdens de incubatie met trypsine-EDTA zal resulteren in een meer homogene oplossing. Het gebruik van een brand-gepolijst glas pasture pipet over een P1000 plastic pipet tip wordt sterk aanbevolen om het verminderen van de dood van de cel en de resulterende cultuur te verbeteren. Vermijd overtriturating. Ondanks deze voorzorgsmaatregelen de procedure een heleboel puin kunt maken in de P0-cultuur, en om te voorkomen dat verliezen van voorlopercellen, wassen of voeding van de cultuur moeten worden vermeden tot bollen hebben gevormd.
Een aantal verschillen tussen de hippocampal en SVZ culturen duidelijk op P0 zullen worden. Hippocampal culturen opbrengst minder bollen, en dit over het algemeen houden. Hiermee kunt u dat een uiteinde van de pipet zachtjes til van de bollen voor de eerste passage. Aanhangend sferen werden niet vastgesteld bij volgende passages. Verschillende merken van weefselkweek kolven kan de bollen, met name hippocampal bollen, te houden en te groeien als kolonies op de bodem van de schotel. Dit bleek niet te wijzigen geen downstream resultaten voor dit protocol maar moet worden gecontroleerd, en consistentie moet worden gehandhaafd indien mogelijk.
Vorige methoden gebruikt voor het meten van de P2X7 receptor functie, zoals patch klemmen om op te nemen van calcium toestroom, zijn tijdrovend en moeizaam en kunnen alleen informatie verschaffen over een enkele cel. Dit protocol biedt een snelle en reproduceerbare methode voor het analyseren van alle drie hoofdfuncties van P2X7 receptoren met behulp van één machine. Time-resolved live-cel stroom cytometry zorgt voor analyse van de hele bevolking en geeft informatie over de kinetiek van calcium toestroom, porie vorming en/of fagocytische functie de onderzoeker. Naast dit, kan stroom cytometry gemakkelijk worden gebruikt als een methode voor de beoordeling van de marker-expressiepatronen en analyse van de bevolking op basis van de cel grootte of eiwit expressie niveaus.
Bij het uitvoeren van deze experimenten, kunnen verschillen in maximale calcium toestroom, ethidium opname of fagocytose tarieven tussen herhalingen worden waargenomen. Om te minimaliseren dit, de grootte van het gebied, worden kweekomstandigheden en voeding regime moet consistent, zoals de gezondheid van de cellen een aanzienlijke invloed op de resultaten hebben zal. De tijd op het ijs kan ook invloed hebben op de gegevens, dus zorgen alles tevoren is voorbereid, zodat de tijd op ijs minimaal is. Erop toe dat de calcium indicator kleurstof laadtijd aansluit. Een andere factor die tot grote inconsistenties in de maximale calcium opnamen leiden kan is de variatie tussen ATP batches. De voorbereiding van ATP voorraden is cruciaal, en het gebruik van verschillende batches instellen voor de dezelfde experimenten moet worden vermeden. Vergelijking van oude en nieuwe partijen om ervoor te zorgen dat het ATP strookt wordt ook aangeraden. De effectiviteit van P2X7 antagonisten kan ook zo cel-lijn - en batch-afhankelijk, optimalisatie van incubatie tijden en concentraties kan worden verlangd.
Het is vermeldenswaard dat calcium toestroom/efflux is een van de meest fundamentele en complexe cellulaire functies en kan worden bemiddeld door veel receptoren. De toestroom van de ATP-geïnduceerde calcium, zoals een klassieke meting voor P2X7 kanaal/porie functie, kan niet nauwkeurig overeen met de functie waar van P2X7-receptoren, als ATP kan ook activeren P2Y receptoren vrijgeven van intracellulair calcium. In dit geval, wellicht barium een betere catie te gebruiken in plaats van calcium als de instroom unidirectioneel16 is. Zodat u kunt onderscheiden van de bijdrage van P2Y receptoren in calcium toestroom, mogen waar 1 mM EDTA of ethyleenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-Dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuuroplossing (EGTA) wordt toegevoegd aan het medium K+ in plaats van CaCl2 voorwaarden worden gebruikt in dit assay.
Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast om aan te passen andere celtypes en kan nuttig zijn voor het onderzoeken van de functionaliteit van alternatieve ion kanaal receptoren of receptoren die deel van fagocytose uitmaken. Deze methode kan ook worden aangepast aan een stroom cytometry machine zonder een tijd-module. Als voorbeeld kunnen fagocytose testen worden uitgevoerd waar YG kralen 7 – 8 min vóór de analyse door conventionele stroom cytometry worden toegevoegd. Houden van de cellen bij 37 ° C en continu swirl hen. Dit zal niet het bieden van real-time informatie maar verschillen in de gemiddelde laatste fluorescentie zal nog steeds de onderzoeker met betrekking tot de functionaliteit van P2X7-receptoren in kennis.
Belangstelling voor P2X7 receptoren als een drug target21,22 of zelfs als een drug delivery route23,24 groeit snel, en dus methoden om te studeren van deze raadselachtige receptor moet voortdurend aangepast en verbeterd om te deze studies te vergemakkelijken. Dit protocol beschrijft methodologieën die kunnen worden gebruikt voor het verkennen van de P2X7 functie in volwassen neurale voorlopercellen, en gehoopt wordt dat de verwezenlijking van een beter begrip van P2X7-receptoren in de neurogene nissen tot vooruitgang in de behandeling van een beroerte leiden kan en andere ischemische verwondingen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil Maria Kasherman en Xin Huang bedanken voor hun bijdragen aan dit onderzoek. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation te M.W., T.C.L., M.L., en T.C.L. van de nationale gezondheids- en medische onderzoek Raad (NHMRC) van Australië (571100 en 1048082) en de Baxter Charitable Foundation ( Sydney, Australië). B.G. werd gesteund door de Australian Research Raad (ARC) toekomst Fellowship (FT120100581), NHMRC Project Grants (1048082, 1061419 en 1120095) en de Victoriaanse regering operationele infrastructuur ondersteuning subsidie aan het Instituut Florey. M.L. werd gesteund door een Charles D. Kelman, M.D. postdoctorale Award (2010) van de internationale Retinal Research Foundation (USA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A438079 | Tocris | 2972/10 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
| bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
| Cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
| FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
| Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
| Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
| NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
| NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
| Oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
| Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
| Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
| Tetramethylammonium Hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
| Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
| Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
| TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
| UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |
References
- Sperlagh, B., Illes, P. P2X7 receptor: an emerging target in central nervous system diseases. Trends in Pharmacological Sciences. 35 (10), 537-547 (2014).
- Liang, X., et al. Quantifying Ca2+ current and permeability in ATP-gated P2X7 receptors. Journal of Biological Chemistry. 290 (12), 7930-7942 (2015).
- Rat, P., Olivier, E., Tanter, C., Wakx, A., Dutot, M. A fast and reproducible cell- and 96-well plate-based method for the evaluation of P2X7 receptor activation using YO-PRO-1 fluorescent dye. Journal of Biological Methods. 4 (1), 64 (2017).
- Gu, B. J., et al. A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry. Journal of Quantitative Cell Science: Cytometry Part A. 85 (4), 313-321 (2014).
- Jursik, C., et al. A quantitative method for routine measurement of cell surface P2X7 receptor function in leucocyte subsets by two-colour time-resolved flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 67-77 (2007).
- Surprenant, A., Rassendren, F., Kawashima, E., North, R. A., Buell, G. The cytolytic P2Z receptor for extracellular ATP identified as a P2X receptor (P2X7). Science. 272 (5262), 735-738 (1996).
- Delarasse, C., et al. Neural progenitor cell death is induced by extracellular ATP via ligation of P2X7 receptor. Journal of Neurochemistry. 109 (3), 846-857 (2009).
- North, R. A. Molecular physiology of P2X receptors. Physiological Reviews. 82 (4), 1013-1067 (2002).
- Leeson, H. C., et al. P2X7 Receptors Regulate Phagocytosis and Proliferation in Adult Hippocampal and SVZ Neural Progenitor Cells: Implications for Inflammation in Neurogenesis. Stem Cells. , (2018).
- Glaser, T., et al. Modulation of mouse embryonic stem cell proliferation and neural differentiation by the P2X7 receptor. PLoS One. 9 (5), e96281 (2014).
- Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
- Wiley, J. S., Gu, B. J. A new role for the P2X7 receptor: a scavenger receptor for bacteria and apoptotic cells in the absence of serum and extracellular ATP. Purinergic Signalling. 8 (3), 579-586 (2012).
- Lovelace, M. D., et al. P2X7 receptors mediate innate phagocytosis by human neural precursor cells and neuroblasts. Stem Cells. 33 (2), 526-541 (2015).
- Walker, T. L., Kempermann, G. One mouse, two cultures: isolation and culture of adult neural stem cells from the two neurogenic zones of individual mice. Journal of Visualized Experiments. (84), e51225 (2014).
- Babu, H., et al. A protocol for isolation and enriched monolayer cultivation of neural precursor cells from mouse dentate gyrus. Frontiers in Neuroscience. 5, 89 (2011).
- Gu, B. J., Wiley, J. S. Broad applications of mulit-colour time-resolved flow cytometry. Flow Cytometry - Recent Perspectives. , (2012).
- Cheewatrakoolpong, B., Gilchrest, H., Anthes, J. C., Greenfeder, S. Identification and characterization of splice variants of the human P2X7 ATP channel. Biochemical and Biophysical Research Communications. 332 (1), 17-27 (2005).
- Gu, B. J., Saunders, B. M., Jursik, C., Wiley, J. S. The P2X7-nonmuscle myosin membrane complex regulates phagocytosis of nonopsonized particles and bacteria by a pathway attenuated by extracellular ATP. Blood. 115 (8), 1621-1631 (2010).
- Gu, B. J., Rathsam, C., Stokes, L., McGeachie, A. B., Wiley, J. S. Extracellular ATP dissociates nonmuscle myosin from P2X(7) complex: this dissociation regulates P2X(7) pore formation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 297 (2), C430-C439 (2009).
- Gu, B. J., et al. P2X7 receptor-mediated scavenger activity of mononuclear phagocytes toward non-opsonized particles and apoptotic cells is inhibited by serum glycoproteins but remains active in cerebrospinal fluid. Journal of Biological Chemistry. 287 (21), 17318-17330 (2012).
- Bhattacharya, A. Recent Advances in CNS P2X7 Physiology and Pharmacology: Focus on Neuropsychiatric Disorders. Frontiers in Pharmacology. 9 (30), (2018).
- Burnstock, G., Knight, G. E. The potential of P2X7 receptors as a therapeutic target, including inflammation and tumour progression. Purinergic Signalling. 14 (1), 1-18 (2018).
- Alves, L. A., et al. Pore forming channels as a drug delivery system for photodynamic therapy in cancer associated with nanoscintillators. Oncotarget. 9 (38), 25342-25354 (2018).
- Pacheco, P. A., et al. P2X7 receptor as a novel drug delivery system to increase the entrance of hydrophilic drugs into cells during photodynamic therapy. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 48 (4), 397-411 (2016).
