Summary
Эмбрионы зебры используются для оценки токсичности химических соединений. Они развиваются внешне и чувствительны к химическим веществам, что позволяет обнаруживать тонкие фенотипические изменения. Эксперимент требует лишь небольшого количества соединения, которое непосредственно добавляется в пластину, содержащую эмбрионы, что делает систему тестирования эффективной и рентабельной.
Abstract
Зебрафиш является широко используемой позвоночной модели организма для болезни и фенотипа основе открытия наркотиков. Зебрафиш генерирует много потомства, имеет прозрачные эмбрионы и быстрое внешнее развитие. Таким образом, эмбрионы зебры могут также использоваться для быстрой оценки токсичности препаратов, которые являются ценными и доступны в небольших количествах. В настоящей статье описан метод эффективного скрининга токсичности химических соединений с использованием 1-5-дневных эмбрионов после оплодотворения. Эмбрионы контролируются стереомикроскопом для исследования фенотипических дефектов, вызванных воздействием различных концентраций соединений. Половина максимальных концентраций летальных (LC50) соединений также определены. Настоящее исследование требует 3-6 мг ингибиторного соединения, и весь эксперимент занимает около 8-10 ч, чтобы быть завершена человеком в лаборатории, имеющей основные средства. Текущий протокол подходит для тестирования любого соединения для выявления невыносимых токсичных или вне целевых эффектов соединения на ранней стадии обнаружения наркотиков и для обнаружения тонких токсических эффектов, которые могут быть пропущены в культуре клеток или других животных моделей. Метод сокращает процедурные задержки и затраты на разработку лекарств.
Introduction
Разработка лекарств является дорогостоящим процессом. Прежде чем одно химическое соединение одобрено Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) и Европейского агентства по лекарственным средствам (EMA) несколько тысяч соединений проверяются на сумму более одного миллиарда долларов1. Во время доклинической разработки, большая часть этой стоимости требуется для тестирования на животных2. Чтобы ограничить затраты, исследователям в области разработки лекарств необходимы альтернативныемодели для скрининга безопасности химических соединений 3. Поэтому на ранней стадии разработки препарата было бы очень полезно использовать метод, который может быстро оценить безопасность и токсичность соединений в подходящей модели. Есть несколько протоколов, которые были использованы для скрининга токсичности химических соединений с участием животных и клеточных моделей культуры, но нет ни одного протокола, который проверяется и является общим использованием4,5. Существующие протоколы с использованием зебры различаются по длине и былииспользованы отдельными исследователями, которые оценили токсичность в соответствии с их требованиями удобства 6,7,8,9, 10 Лет , 11 Год , 12.
В недавнем прошлом, зебрафиш стала удобной моделью для оценки токсичностихимических соединений во время эмбрионального развития 6,7. Зебрафиш имеет много встроенных преимуществ для оценки химических соединений13. Даже крупномасштабные эксперименты поддаются, так как самка зебры может откладывать партии по 200-300 яиц, которые быстро развиваются ex vivo,не нуждаются во внешнем кормлении до недели и прозрачны. Соединения могут быть добавлены непосредственно в воду, где они могут (в зависимости от характера соединения) диффундировать через хорион, и после вылупления, через кожу, жабры и рот личинок. Эксперименты не требуют большого количества химических соединений14 из-за небольшого размера эмбриона. Развитие эмбрионов зебры выражает большинство белков, необходимых для достижения нормального результата развития. Таким образом, эмбрион зебры является чувствительной моделью для оценки того, может ли потенциальный препарат нарушить функцию белка или сигнальной молекулы, которая имеет важное значение для развития. Органы зебры становятся функциональными между 2-5 dpf15, и соединения, которые являются токсичными в этот чувствительный период эмбрионального развития вызывают фенотипические дефекты в личинки зебры. Эти фенотипические изменения могут быть легко обнаружены с помощью простого микроскопа без инвазивных методов11. Эмбрионы зебрафиш широко используются в токсикологических исследованиях из-за их гораздо большей биологической сложности по сравнению с скринингом наркотиков in vitro с использованием моделей клеточной культуры16,17. Как позвоночных, генетический и физиологический состав зебры сопоставим с человеком и, следовательно, токсичность химических соединений похожи между зебрафиши и людей8,18,19, 20 , 21 год , 22. Зебрафиш, таким образом, является ценным инструментом на ранней стадии открытия наркотиков для оценки токсичности и безопасности химических соединений.
В настоящей статье мы предоставляем подробное описание метода, используемого для оценки безопасности и токсичности соединений ингибитора углеродной анигидразы (CA) с использованием 1-5-дневного послеоплодного оплодотворения (dpf) эмбрионов зебры одним исследователем. Протокол включает в себя подвергая эмбрионы зебры различным концентрациям химических ингибиторных соединений и изучая смертность и фенотипические изменения во время эмбрионального развития. В конце воздействия химических соединений, LC50 доза химического вещества определяется. Метод позволяет человеку проводить эффективный скрининг 1-5 испытательных соединений и занимает около 8-10 ч в зависимости от опыта человека с методом(рисунок 1). Каждый из шагов, необходимых для оценки токсичности соединений, изложен на рисунке 2. Оценка токсичности ингибиторов ЦА требует 8 дней и включает в себя настройку спаривающихпар (день 1); сбор эмбрионов из резервуаров для размножения, очистка и перенос их в инкубатор 28,5 градуса по Цельсию (день 2); распределение эмбрионов в колодцы 24-колодца пластины и добавление разбавленных ингибиторных соединений CA (день 3); фенотипический анализ и визуализация личинок (день 4-8), а также определение дозы LC50 (день8). Этот метод является быстрым и эффективным, требует небольшого количества химического соединения и только основные средства лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Основной объект "Зебрафиш" в Университете Тампере имеет разрешение на создание, выдаваемый Национальным советом по эксперименту на животных (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Все эксперименты с использованием эмбрионов зебры проводились в соответствии с провинциальным правительством Восточной Финляндии, Департаментом социального и медицинского департамента Тампере регионального обслуживания протокола LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Настройка Ночь Зебрафиш спаривания танков
- Поместите 2-5 взрослых самцов зебры и 3-5 взрослых самок зебры в брачных резервуарах на ночь. (Разведение индуцируется утром автоматическим темным и светлым циклом на ночь).
- Установите несколько крестов, чтобы получить достаточно эмбрионов для оценки токсичности более чем двух химических соединений. Для оценки токсичности, каждой концентрации необходимо как минимум 20 эмбрионов23.
- Чтобы избежать стресса для животных, дайте животным отдохнуть в течение 2 недель, прежде чем использовать те же лица для размножения.
2. Сбор эмбрионов и подготовка пластин для воздействия химических соединений
- Соберите эмбрионы, на следующий день до полудня, используя тонкой сетки ситечко и передать их на чашку Петри, содержащую E3 эмбриона среднего 5,0 мм NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мм CaCl2, 0,33 мМ MgSO4, и 0,1% w/v Метилене Blue "
- Удалите мусор с помощью пластиковой пипетки Pasteur (например, продуктов питания и твердых отходов). Изучите каждую партию эмбрионов под стереомикроскопом, чтобы удалить неоплодотворенные/мертвые эмбрионы (идентифицированные по их непрозрачному внешнему виду).
- Храните эмбрионы при 28,5 градуса цельсия в инкубаторе. Изучите эмбрионы на следующее утро под стереомикроскопом и удалите любые нездоровые или мертвые эмбрионы. Кроме того, заменить старый E3 среды со свежим E3 среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы зебрафиш всегда поддерживаются при 28,5 градуса х в лабораторных условиях. - Тщательно перенесите 1 эмбрион в каждый колодец из 24-колодца пластины, содержащей достаточно E3 среды для покрытия эмбрионов.
3. Подготовка стокового раствора химических соединений и распределение разбавленного соединения в скважинах
- Вынизить флаконы, содержащие ингибиторные соединения, хранящиеся при 4 градусах Цельсия.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от свойств соединения, они хранятся при различных температурах. - Взвесьте соединение (ы) с помощью аналитического баланса, который может весить несколько миллиграммов (мг) соединения точно.
- Подготовьте не менее 250 кЛ (100 мМ) запасного раствора для каждого соединения в соответствующем растворителе (например, вода Е3 или диметилсульксид (ДМСО), основываясь на свойствах растворимости соединений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные шаги могут быть сделаны за день до начала эксперимента в удобное время и хранятся при 4 градусах Цельсия). - Сделать серийное разбавление стоковых растворов (например, 10 мкм, 20 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 150 мкм, 300 мкм и 500 мкм) с помощью воды E3 в 15 мл центрифуговых труб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации и количество серийных разбавлений варьируются от одного соединения к другому в зависимости от их уровня токсичности. - Из 24 хорошо пластины, содержащей эмбрионы, удалить E3 воды из колодцев с помощью пастера пипетка и 1 мл пипетка (содержащая 1 dpf эмбрионов) один ряд за один раз.
- Распределите по 1 мл каждого разбавителя в каждом колодце (начиная от нижней и переходной к более высокой концентрации) в колодцы 24-хорошей пластины.
- Настройте контрольную группу из той же партии эмбрионов и добавьте соответствующее количество разбавив.
- Наклейте 24-колодные пластины с названием и концентрацией соединения и держите пластины на уровне 28,5 градусов по Цельсию в инкубаторе.
4. Фенотипический анализ и визуализация эмбрионов с помощью стереомикроскопа
- Изучить эмбрионы под стереомикроскопом по параметрам 24 ч после контакта с химическими соединениями.
- Обратите внимание на такие параметры, как смертность, вылупление, сердцебиение, использование желточного мешка, развитие плавательного пузыря, движение рыбы, отек перикардиала, и форма тела23.
- Возьмите личинки подвергаются каждой концентрации соединения и положить их боком в небольшой чашке Петри, содержащей 3% высокий молекулярный вес метилцеллюлозы с помощью металлического зонда.
ПРИМЕЧАНИЕ: 3% метилцеллюлозы (высокий молекулярный с) является вязкой жидкости, необходимой для встраивания рыбы с необходимой ориентацией для микроскопического исследования. Для ориентации рыбы в этой жидкости необходим металлический зонд. - Возьмите изображения с помощью стереомикроскопа, прикрепленного к камере. До конца эксперимента сохраняя изображения в отдельной папке каждый день.
- Введите все наблюдения в таблице каждый день либо в онлайн-стол или на печатном листе.
- Если соединения являются нейротоксическими, 4 до 5 dpf личинки могут показать измененный шаблон плавания, сделать запись таких изменений либо путем захвата короткий (30 с до 1 мин) видео личинок, демонстрирующих ненормальные движения картины.
- После 5 дней воздействия химических соединений, обратите внимание на концентрацию, при которой половина эмбрионов умирают для расчета половины максимальной смертельной концентрации 50 (LC50) каждого химического вещества.
ПРИМЕЧАНИЕ: LC50 является концентрация, при которой 50% эмбрионов умирают в конце 5 дней воздействия химического соединения. Используйте минимум 20 эмбрионов для проверки токсичности каждой концентрации соединения23. - Постройте кривую смертности эмбрионов для всех концентраций с помощью подходящей программы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Важнейшей частью оценки токсичности является тестирование различных концентраций одного или нескольких химических соединений в рамках одного эксперимента. В начале, выберите соединения для оценки токсичности, количество концентраций для проверки для каждого соединения, и, соответственно, сделать диаграмму(рисунок 3). Мы использовали уникальный цвет для каждого соединения для организации образцов(Рисунок 3). Использование растворителя устойчивый маркер и маркировки в нижней или боковой части пластин важно, чтобы избежать путаницы позже. Если соединения вызывают какие-либо фенотипические дефекты в личинках, подверженных различным концентрациям ингибиторов, дефекты регистрируются каждые 24 ч в течение 1-5 dpf(Рисунок 4A,B, C, D). Эмбрионы, обработанные известным ингибитором CA IX в концентрации 500 мкм, не показали каких-либо явных фенотипических изменений в течение 1-5 дней воздействия химического соединения(рисунок 4B). Рисунок 4C и Рисунок 4D показывает эмбрионы, обработанные ингибиторами К-К, которые индуцировали различные фенотипические дефекты, невылупившиеся эмбрионы даже на 3-й день (стрелка), изогнутую структуру тела (стрелка), неиспользованный мешок желтка и перикардиальный отек (стрелка) и отсутствие отолитных мешков в личинках через 5 дней после обработки химическим соединением (стрелкой). В другом исследовании, эмбрионы, обработанные ингибитором CA(Рисунок 4E) показывает отсутствие отолита мешки и плавательный пузырь (стрелки головы). В нашем исследовании,(Рисунок 4C, D), мы документально фенотипические дефекты (хрупкие эмбрионы и отсутствие пигментации) даже после первого дня воздействия ингибиторов CA. Фенотипические анализы показали, что некоторые из ингибиторных соединений являются смертельными и не могут быть разработаны как препараты для использования человеком(Рисунок 4C,D и Таблица 1).
Эксперименты определили репрезентативное соединение, которое индуцировало минимальные или не фенотипические изменения во время эмбрионального развития и показало высокую дозу LC50 (рисунок5), предполагая, что соединение является безопасным для дальнейшей характеристики и может быть потенциально разработан в наркотиков кандидата для использования человеком16. Глядя на неподвижные изображения личинок, подвергшихся воздействию соединения показали никаких фенотипических дефектов(Рисунок 4B). Однако, то же соединение было установлено, что нейротоксические и индуцированной атаксии в личинках после 5 дней воздействия ингибитора CA (Рисунок 6). Этот фенотип может быть обнаружен только путем непосредственного наблюдения за плавательным поведением личинок зебры под микроскопом. Эти исследования показали, что нервное развитие личинок зебры чувствительно к соединению16,17.
Рисунок 1: Время в часах, необходимых для быстрого скрининга химических соединений с использованием эмбрионов зебры: В одном наборе экспериментов, человек с практическим опытом может экран около 5 химических соединений (каждое соединение, требующее как минимум 6 разбавления) с использованием эмбрионов зебры в 24-колодцевых пластин. В общей сложности, это занимает около 8-10 ч от создания крестов для выполнения LC50 определение в течение 8 дней.
Рисунок 2: Диаграмма, показывающая разбивку оценки токсичности химических соединений. Токсичность скрининга химических соединений занимает 8 дней и может быть разбита на пять этапов. (День1) Состоит из создания пары спаривания зебры в цистернах. (День2) Включает в себя сбор эмбрионов из спаривания танков в петри блюда следуют, сохраняя их на 28,5 градусов по Цельсию инкубатор на ночь. (День3) Обследование эмбрионов с помощью стереомикроскопа и очистка эмбрионов. Распределение эмбрионов на 24-ну колодцы и добавление разбавления испытательных соединений. (День4-8) Фенотипический анализ личинок на дефекты развития. Исследование шаблона плавания и определение LC50 было выполнено в последний день воздействия соединений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Схематическое представление экспериментов, связанных с оценкой токсичности. Оценка токсичности состоит в подготовке табеляционной диаграммы, содержащей информацию о химических соединениях, разбавлениях соединений и параметрах, которые необходимо оценить. Создание разбавления стоковых растворов до желаемых концентраций в 15 мл центрифуговых труб (разбавление из одной трубки, которые будут добавлены в каждый ряд 24-хорошей пластины). 24-хорошая пластина, отмеченная маркером воды с названием испытательного соединения, концентрацией в каждом ряду и датой воздействия. Изучение и визуализация эмбрионов путем переноса личинок на небольшое блюдо Петри, содержащее 3% высокий молекулярный вес метиловой целлюлозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Пример фенотипического анализа личинок в контрольных и испытательных составных группах. (A) Фенотипические анализы личинок контрольной группы, не обработанные каким-либо соединением, не показали фенотипического дефекта под микроскопом. (B) Larvae, обработанные ингибитором 500 мкм CA (известный ингибитор углеродной ангидразы IX не показал наблюдаемых фенотипических дефектов. (C, D) Развивающиеся личинки, обработанные ингибитором К-К, с концентрациями 250 и 125 мкм соответственно. Соединения индуцированных фенотипических дефектов, таких как изогнутое тело, перикардиальный отек, и неиспользованные желтковый мешок (стрелки и стрелки головы). Панели A и B были изменены из Aspatwar et al16. Панели C, D и E показывают ранее неопубликованные изображения, которые были получены с помощью другого микроскопа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Определение смертельной концентрации 50 (LC50)с использованием 1-5 dpf личинки зебры. Оценка токсичности с использованием эмбрионов зебры позволяет исследователям определить минимальную летальную концентрацию химического соединения в конце эксперимента. Концентрация LC50 соединения (известный ингибитор CA IX) составила 3,5 мМ. Высокая концентрация LC50 позволяет дальнейшую характеристику соединения. Эта цифра была изменена из Aspatwar и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Пример анализа схемплавания плавания как в необработанных (A) и ингибиторах обработанных (B) группах личинок. Личинки зебры, обработанные в панели B с составом ингибитора 300 мкм (известный ингибитор углеродной ангидразы IX) показали ненормальный (атаксический) двигатель (стрелка головы), предполагая, что соединение индуцирует нейротоксичность в развивающихся эмбрионах . Наконечники стрел указывают на нормальную кривизну хвоста во время плавания. В панели А стрелки указывают на нормальную кривизну хвоста во время плавания. Эта цифра была изменена из Aspatwar и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Ингибитор CA | Скрининг токсичности | LC50 | In vivo | Токсичные CAIs | Ссылки |
| Карбаматы | 24 | Все | 1a | 3b | 24, Неопубликованные |
| Кумаринс | 10 | Все | - | 2 | Неопубликованные |
| Нитроимидазолы | 2 | Все | 2 | 2c | 16 |
| Сульфаниламиды | 5 | Все | - | 3 | 25 |
| Общая | 41 | Все | 3 | 10 | - |
| a На основе скрининга токсичности ингибитор был использован для ингибирования Mycobacterium marinum в модели зебры. b Смертельный ингибитор, cНейротоксическая свыше 300 мкм концентрации | |||||
Таблица 1: Резюме безопасности и токсичности инссосматриваемых соединений. Эксперимент по оценке токсичности помогает исследователю сделать вывод о безопасности проверенных химических соединений. Концентрация LC50 позволяет определить безопасную концентрацию для дальнейшей характеристики. Исследователь может решить, если соединение является смертельным даже после 24 ч воздействия эмбрионов на исследуемое соединение. В нашем примере, тонкий эффект на плавание из-за нейротоксичности является важной информацией, которая полезна для создания дальнейших экспериментов. Соответственно, на основе скрининга токсичности, мы смогли использовать безопасные концентрации ингибитора CA для дальнейшей характеристики in vivo24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тест на токсичность in vitro с использованием культивированных клеток может обнаружить выживаемость и морфологические исследования клеток, предоставляющих ограниченную информацию о токсичности, индуцированной испытательным соединением. Преимуществом скрининга токсичности химических соединений с использованием эмбрионов зебры является быстрое обнаружение химически индуцированных фенотипических изменений у целого животного во время эмбрионального развития в соответствующем модельном организме. Приблизительно 70% генов человека, кодирующих белок, имеют аналоги ортологов в геноме зебры25. Генетические пути контроля трансдукции сигнала и развития очень сохраняются между человеком и зебрафиш26, и, следовательно, химические соединения, вероятно, имеют аналогичные токсические эффекты у людей25.
Зебрафиш находятся на переднем крае токсикологических исследований и уже широко используются для обнаружения токсинов в пробах воды и для изучения механизма действия экологических токсинов и их воздействия на животное27. В этой статье мы показываем использование развивающихся эмбрионов зебры для оценки токсичности потенциальных соединений на ранней стадии открытия препарата. Наша быстрая и многогранная оценка токсичности основана на 1) изменениях в фенотипе организма (хэтчбек, отолитные мешки, перикардиальный отек, использование желточного мешка, развитие нотохорда, сердцебиение, развитие плавательного пузыря, движение) во время эмбрионального развития в течение 5 дней, и 2) определение смертельной концентрации (LC50). Разумных часов практической работы (8-10 ч разделенных на 8 дней) достаточно, чтобы определить профиль токсичности соединения с помощью этой процедуры. Для вновь синтезированных соединений, которые доступны в ограниченном количестве, токсичность может быть оценена с помощью как минимум 3 мг соединения. Специальное оборудование не требуется. Таким образом, эта процедура представляет собой быстрый и недорогой способ оценки токсического воздействия любого соединения, которое потенциально может быть разработано в препарат для использования человеком.
Качество партии эмбрионов оказывает большое влияние на исход эксперимента. Качество яйцеклеток (включая скорость оплодотворения) не очевидно сразу после сбора из племенных резервуаров (0-4 л.с.). Для получения только обычно развивающихся эмбрионов для экспериментов, прежде чем добавлять соединения, мы позволяем эмбрионам оставаться на уровне 28,5 градусов по Цельсию в течение 24 ч после сбора из резервуаров для размножения. После 24 л.с., любые мертвые или нездоровый вид эмбрионов отбрасываются. В дополнение к этому, желательно иметь макет-обработанной группы эмбрионов в каждом эксперименте для дальнейшего контроля за качеством партии яиц, используемых в эксперименте, а также увидеть базовую смертность, чтобы точно определить LC50.
Для контроля токсичности автомобиля по выбору также необходима группа, обработанная макетами. Многие химические вещества нерастворяются в воде, и ДМСО часто используется в качестве средства доставки испытательных соединений. DMSO, как правило, хорошо переносится эмбрионов в нижней (0,1%) концентрации28. Иногда соединения не полностью растворяются даже в DMSO и раствор кажется облачным, что затрудняет оценку токсичности. В таких случаях, чтобы получить запас решение соединения полностью растворимым и ясным, добавив падение на 0,1% NaOH решит проблему. Для точной оценки токсичности соединения необходимо создать соответствующие контрольные группы. Если использовать другие транспортные средства, то их присущая токсичность может повлиять на эксперимент.
Каждая скважина из 24-колодца содержит от 1-10 эмбрионов, погруженных в общий объем 1 мл. Если испытательное соединение доступно только в небольших количествах, может потребоваться использовать до 10 эмбрионов на скважину для оценки его токсичности. Настоятельно рекомендуется, чтобы только 1 эмбрион на хорошо должны быть использованы для каждого анализа16,24,29. Пластина хранится в инкубаторе 28,5 градусов по Цельсию в течение 5 дней. Иногда наблюдается значительное испарение, вызывающее заметное изменение концентрации соединения в данной скважине16. Путем герметизации 24-коловидной пластины парафинапленками со всех сторон, размещение эмбрионов только в средних колодцах и заполнение других колодцев вдоль ободков водой, проблем, вызванных испарением, можно избежать. В наших предыдущих исследованиях мы не наблюдали никакого испарения разбавителей химических веществ из 24-ну колодцев24,29. Кроме того, если соединение, о котором идет речь, как известно, нестабильно при температуре окружающей среды, для получения надежных результатов потребуются ежедневные изменения воды со свежим составом.
Схема плавания личинок зебры анализируется после 5 дней воздействия соединения. Скважины из 24-колодца, содержащего 5 личинок dpf, не идеальны для этой цели из-за ограниченного размера скважины. Таким образом, для точного анализа плавательный узор, личинки должны быть переданы в чашку Петри, содержащий 50 мл воды E3 и может поселиться в течение 2 минут до анализа. В нашем исследовании, только два ингибитора показали влияние на плавание шаблон16 среди 52 q-CA и q-CA ингибиторов скрининг на безопасность и токсичность, на основе нашего опыта этот тест может обнаружить тонкие изменения, включая мягкий атаксическое движение личинок.
Это исследование показало, что единственным ограничением для нынешнего метода является физическая ловкость. Эта забота может быть преодолена путем повторения, так как мастерство человека улучшается с практикой. Как только экспертиза достигается оценка соединений с использованием эмбрионов зебры является этичным, легким, эффективным и информативным. Поэтому мы ожидаем, что такой быстрый анализ с использованием эмбрионов зебры станет популярным инструментом для скрининга токсичности in vivo на ранней стадии разработки препарата.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
О каком-либо потенциальном конфликте интересов авторы не сообщали.
Acknowledgments
Работа была поддержана грантами Фонда Сигрида Джузелиуса (SP, MP), Финского культурного фонда (AA, MH), Академии Финляндии (SP, MP), Фонда Ориона Фармоса (MH), Фонда тампере туберкулеза (SP, MH и MP) и Фонда Джейн и Аатоса Эркко (SP and MP ). Мы благодарим наших итальянских и французских коллег, профессора Супурана и профессора Винама, за предоставление ингибиторов углеродной анигидраззы для оценки безопасности и токсичности для целей разработки противотуберкулезных и противораковых препаратов. Мы благодарим Ауликки Лемуса и Марианну Кууслахти за техническую помощь. Мы также благодарим Лину Мякинен и Ханналину Пииппо за помощь в разведении зебры и сборе эмбрионов. Мы искренне благодарим Харлана Баркера за критическую оценку рукописи и глубокие комментарии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
