Summary
Gli embrioni di pesce zebra vengono utilizzati per valutare la tossicità dei composti chimici. Si sviluppano esternamente e sono sensibili alle sostanze chimiche, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti fenotipici. L'esperimento richiede solo una piccola quantità di composto, che viene aggiunto direttamente alla piastra contenente embrioni, rendendo il sistema di test efficiente e conveniente.
Abstract
Il pesce zebra è un organismo modello di vertebrato ampiamente utilizzato per la malattia e la scoperta di farmaci basati sul fenotipo. Il pesce zebra genera molti figli, ha embrioni trasparenti e rapido sviluppo esterno. Gli embrioni di pesce zebra possono quindi essere utilizzati anche per la rapida valutazione della tossicità dei farmaci preziosi e disponibili in piccole quantità. Nel presente articolo, viene descritto un metodo per lo screening efficiente della tossicità dei composti chimici utilizzando embrioni post-fecondazione di 1-5 giorni. Gli embrioni sono monitorati da stereomicroscopiper per studiare i difetti fenotipici causati dall'esposizione a diverse concentrazioni di composti. Vengono inoltre determinate concentrazioni letali semimassi (LC50) dei composti. Il presente studio ha richiesto 3-6 mg di un composto inibitore, e l'intero esperimento richiede circa 8-10 h per essere completato da un individuo in un laboratorio con strutture di base. Il protocollo attuale è adatto per testare qualsiasi composto per identificare effetti tossici o fuori bersaglio intollerabili del composto nella fase iniziale della scoperta di farmaci e per rilevare sottili effetti tossici che possono essere persi nella coltura cellulare o in altri modelli animali. Il metodo riduce i ritardi procedurali e i costi dello sviluppo di farmaci.
Introduction
Lo sviluppo di farmaci è un processo costoso. Prima che un singolo composto chimico è approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) e L'Agenzia europea dei medicinali (EMA) diverse migliaia di composti sono sottoposti a un costo di oltre un miliardo di dollari1. Durante lo sviluppo preclinico, la maggior parte di questo costo è necessaria per la sperimentazione animale2. Per limitare i costi, i ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci hanno bisogno di modelli alternativi per lo screening di sicurezza dei composti chimici3. Pertanto, nella fase iniziale dello sviluppo del farmaco, sarebbe molto utile utilizzare un metodo in grado di valutare rapidamente la sicurezza e la tossicità dei composti in un modello adatto. Ci sono diversi protocolli che sono stati utilizzati per lo screening della tossicità di composti chimici che coinvolgono modelli di coltura animale e cellulare, ma non c'è un unico protocollo che viene convalidato ed è in uso comune4,5. I protocolli esistenti che utilizzano il pesce zebra variano in lunghezza e sono stati utilizzati da singoli ricercatori che hanno valutato la tossicità in base al loro requisito di convenienza6,7,8,9, 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12.
Nel recente passato, il pesce zebra è emerso come un modello conveniente per la valutazione della tossicità dei composti chimici durante lo sviluppo embrionale6,7. Il pesce zebra ha molti vantaggi integrati per la valutazione dei composti chimici13. Anche gli esperimenti su larga scala sono suscettibili, in quanto una femmina di pesce zebra può deporre lotti di 200-300 uova, che si sviluppano rapidamente ex vivo, non hanno bisogno di alimentazione esterna fino a una settimana e sono trasparenti. I composti possono essere aggiunti direttamente nell'acqua, dove possono (a seconda della natura del composto) diffuso attraverso il chorion, e dopo la schiusa, attraverso la pelle, branchie e bocca delle larve. Gli esperimenti non richiedono abbondanti quantità di composti chimici14 a causa delle piccole dimensioni dell'embrione. Lo sviluppo di embrioni di pesce zebra esprimono la maggior parte delle proteine necessarie per ottenere il normale risultato dello sviluppo. Pertanto, un embrione di pesce zebra è un modello sensibile per valutare se un potenziale farmaco può disturbare la funzione di una proteina o di una molecola di segnalazione che è significativa dal punto di vista dello sviluppo. Gli organi del pesce zebra diventano funzionali tra 2-5 dpf15, e composti tossici durante questo periodo delicato di sviluppo embrionale inducono difetti fenotipici nelle larve di pesce zebra. Questi cambiamenti fenotipici possono essere facilmente rilevati utilizzando un semplice microscopio senza tecniche invasive11. Gli embrioni di pesce zebra sono ampiamente utilizzati nella ricerca tossicologica a causa della loro complessità biologica molto maggiore rispetto allo screening farmacologico in vitro utilizzando modelli di coltura cellulare16,17. Come vertebrato, la composizione genetica e fisiologica del pesce zebra è paragonabile agli esseri umani e quindi le tossicità dei composti chimici sono simili tra il pesce zebra e gli esseri umani8,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22. Il pesce zebra è quindi uno strumento prezioso nella fase iniziale della scoperta di farmaci per la valutazione della tossicità e della sicurezza dei composti chimici.
Nel presente articolo, forniamo una descrizione dettagliata del metodo utilizzato per valutare la sicurezza e la tossicità dei composti inibitori dell'andrasi (CA) carbonico utilizzando embrioni di pesce zebra post-5 giorni (dpf) da un singolo ricercatore. Il protocollo prevede l'esposizione degli embrioni di pesce zebra a diverse concentrazioni di composti inibitori chimici e lo studio della mortalità e dei cambiamenti fenotipici durante lo sviluppo embrionale. Alla fine dell'esposizione ai composti chimici, viene determinata la dose LC50 della sostanza chimica. Il metodo consente a un individuo di effettuare uno screening efficiente di 1-5 composti di prova e richiede circa 8-10 h a seconda dell'esperienza della persona con il metodo (Figura 1). Ciascuno dei passaggi necessari per valutare la tossicità dei composti è descritto nella Figura 2. La valutazione della tossicità degli inibitori della CA richiede 8 giorni e include l'impostazione di coppie di accoppiamento (giorno 1); raccolta di embrioni da serbatoi di riproduzione, pulizia e trasferimento a 28,5 gradi centigradi (giorno 2); distribuzione degli embrioni nei pozzi di una piastra di 24 pozze e aggiunta di composti inibitori CA diluiti (giorno 3); l'analisi fenotipica e l'imaging delle larve (giorno 4-8) e la determinazione della dose di LC50 (giorno8). Questo metodo è rapido ed efficiente, richiede una piccola quantità del composto chimico e solo strutture di base del laboratorio.
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Protocol
La struttura centrale del pesce zebra della Tampere University ha un'autorizzazione di stabilimento concessa dal National Animal Experiment Board (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Tutti gli esperimenti che utilizzano embrioni di pesce zebra sono stati effettuati secondo il governo provinciale della Finlandia orientale, il Dipartimento sociale e sanitario del protocollo di unità di servizio regionale di Tampere - LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. Impostazione dei serbatoi di accoppiamento per il pesce zebra durante la notte
- Mettere 2-5 pesci zebra maschi adulti e 3-5 pesci zebra femminile adulti in serbatoi di accoppiamento durante la notte. (L'allevamento è indotto al mattino dal ciclo automatico del buio e della luce durante la notte).
- Impostare diverse croci per ottenere abbastanza embrioni per valutare la tossicità di più di due composti chimici. Per la valutazione della tossicità, ogni concentrazione ha bisogno di un minimo di 20 embrioni23.
- Per evitare di maneggiare lo stress per gli animali, lasciare riposare gli animali per 2 settimane prima di utilizzare gli stessi individui per l'allevamento.
2. Raccolta di embrioni e preparazione di piastre per l'esposizione ai composti chimici
- Raccogliere gli embrioni, il giorno successivo prima di mezzogiorno, utilizzando un colino a maglie fini e trasferirli su un piatto Petri contenente mezzo embrionale E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4e 0,1% w/v Metilene Blue].
- Rimuovere i detriti utilizzando una pipetta Pasteur di plastica (ad esempio, cibo e rifiuti solidi). Esaminare ogni lotto di embrioni sotto lo stereoscopio per rimuovere gli embrioni non fecondati/morti (identificati dal loro aspetto opaco).
- Conservare gli embrioni a 28,5 gradi centigradi in un'incubatrice. Esaminare gli embrioni, la mattina successiva, sotto uno stereomicroscopio e rimuovere eventuali embrioni malsani o morti. Inoltre, sostituire il vecchio supporto E3 con un supporto E3 fresco.
N.B.:Gli embrioni di pesce zebra sono sempre mantenuti a 28,5 gradi centigradi in condizioni di laboratorio. - Trasferire con attenzione 1 embrione in ogni pozzetto di una piastra di 24 pozze contenente abbastanza mezzo E3 per coprire gli embrioni.
3. Preparazioni della soluzione di riserva di composti chimici e distribuzione di composti diluiti nei pozzi
- Estrarre le fiale contenenti composti inibitori immagazzinati a 4 gradi centigradi.
NOTA: A seconda delle proprietà del composto, questi vengono memorizzati a temperature diverse. - Pesare i composti utilizzando un equilibrio analitico che può pesare alcuni milligrammi (mg) del composto con precisione.
- Preparare almeno 250 l (100 mM) di soluzione di riserva per ogni composto in un solvente appropriato (ad esempio, acqua E3 o solfuro dimetilo (DMSO), in base alle proprietà di solubilità dei composti.
NOTA: I passaggi precedenti possono essere eseguiti un giorno prima dell'inizio dell'esperimento in un momento conveniente e memorizzati a 4 gradi centigradi). - Effettuare diluizioni seriali delle soluzioni di stock (ad es., 10 M, 20 M, 50 M, 100 M, 150 M, 300 m e 500 M) utilizzando l'acqua E3 in tubi di centrifuga da 15 mL.
NOTA: Le concentrazioni e il numero di diluizioni seriali variano da un composto all'altro a seconda dei loro livelli di tossicità. - Dalla 24 piastra contenente embrioni, rimuovere l'acqua E3 dai pozzi utilizzando una pipetta Pasteur e una pipetta da 1 mL (contenente 1 dpf embrioni) una riga alla volta.
- Distribuire 1 mL di ogni diluente in ogni pozzo (a partire da una concentrazione più bassa e da quella più alta) nei pozze di 24 pozze.
- Impostare un gruppo di controllo dallo stesso lotto di embrioni e aggiungere la quantità corrispondente di diluente.
- Etichettare le piastre di 24 pozze con il nome e la concentrazione del composto e mantenere le piastre a 28,5 gradi centigradi in un'incubatrice.
4. Analisi fenotipica e imaging degli embrioni utilizzando uno stereomicroscopio
- Esaminare gli embrioni sotto uno stereomicroscopio per i parametri 24 h dopo l'esposizione ai composti chimici.
- Si notino i parametri come la mortalità, la schiusa, il battito cardiaco, l'utilizzo del sacco del tuorlo, lo sviluppo della vescica, il movimento del pesce, l'edema pericardio e la forma del corpo23.
- Prendi le larve esposte a ogni concentrazione del composto e deporrele lateralmente in una piccola piastra Petri contenente il 3% di cellulosa metilico ad alto peso molecolare utilizzando una sonda metallica.
NOTA: Il 3% di cellulosa metilica (alta molecolare con) è un liquido viscoso necessario per incorporare il pesce con un orientamento richiesto per l'esame microscopico. Per orientare il pesce in questo liquido, è necessaria una sonda metallica. - Scattare le immagini utilizzando lo stereomicroscopio collegato a una fotocamera. Salva le immagini in una cartella separata ogni giorno fino alla fine dell'esperimento.
- Inserisci tutte le osservazioni in una tabella ogni giorno in una tabella online o su un foglio stampato.
- Se i composti sono neurotossici, le larve da 4 a 5 dpf possono mostrare un modello di nuoto alterato, fare una registrazione di tali modifiche catturando un breve video (30 s a 1 min) delle larve che presentano un modello di movimento anormale.
- Dopo 5 giorni di esposizione ai composti chimici, notare la concentrazione alla quale la metà degli embrioni muore per calcolare la concentrazione letale massima 50 (LC50) di ciascuna sostanza chimica.
NOTA: L'LC50 è la concentrazione alla quale il 50% degli embrioni muore alla fine di 5 giorni di esposizione a un composto chimico. Utilizzare un minimo di 20 embrioni per testare la tossicità di ogni concentrazione di un composto23. - Costruire una curva per la mortalità degli embrioni per tutte le concentrazioni utilizzando un programma adatto.
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Representative Results
La parte critica della valutazione della tossicità è la sperimentazione di diverse concentrazioni di uno o più composti chimici in un singolo esperimento. All'inizio, selezionare i composti per la valutazione della tossicità, il numero di concentrazioni da testare per ogni composto e, di conseguenza, creare un grafico (Figura 3). Abbiamo usato un colore univoco per ogni composto per organizzare gli esempi (Figura 3). L'uso di marcatore resistente al solvente e l'etichettatura nella parte inferiore o ai lati delle piastre è importante per evitare la confusione in un secondo momento. Se i composti inducono difetti fenotipici nelle larve esposte a diverse concentrazioni di inibitori, idifetti vengono registrati ogni 24 h nel periodo 1-5 dpf (Figura 4A,B,C,D ). Gli embrioni trattati con un noto inibitore della CA IX con una concentrazione di 500 m non hanno mostrato cambiamenti fenotipici apparenti negli 1-5 giorni di esposizione al composto chimico (Figura 4B). La figura 4C e la figura 4D mostrano gli embrioni trattati con inibitori di z-CA che hanno indotto vari difetti fenotipici embrioni non tratteggiati anche al terzo giorno (testa di freccia), struttura del corpo curva (freccia), sacco di tuorlo non utilizzato edema pericardio (testa di freccia) e l'assenza di sacche di otolito nelle larve a 5 giorni dopo il trattamento con composto chimico (freccia). In un altro studio, gli embrioni trattati con l'inibitore della CA (Figura 4E) mostrano l'assenza di sacche di otolito e vescica da bagno (teste di freccia). Nel nostro studio, (Figura 4C,D), abbiamo documentato i difetti fenotipici (embrioni fragili e assenza di pigmentazione) anche dopo il primo giorno di esposizione agli inibitori della CA. Le analisi fenotipiche hanno mostrato che alcuni composti inibitori sono letali e non possono essere sviluppati come farmaci per uso umano (Figura 4C, D e Tabella 1).
Gli esperimenti hanno identificato un composto rappresentativo che ha indotto cambiamenti minimi o no fenotipici durante lo sviluppo embrionale e ha mostrato un'alta dose di LC50 (Figura 5), suggerendo che il composto è sicuro per un'ulteriore caratterizzazione e può essere potenzialmente sviluppato in un farmaco candidato per uso umano16. Guardando immagini fisse di larve esposte al composto non ha mostrato difetti fenotipici (Figura 4B). Tuttavia, lo stesso composto è stato trovato per essere neurotossico e atassia indotta nelle larve dopo 5 giorni di esposizione all'inibitore CA (Figura 6). Questo fenotipo poteva essere rilevato solo osservando direttamente il comportamento di nuoto delle larve di pesce zebra al microscopio. Questi studi hanno suggerito che lo sviluppo neurale delle larve di pesce zebra è sensibile al composto16,17.
Figura 1: Tempo in ore necessario per lo screening rapido di composti chimici che utilizzano embrioni di pesce zebra: In una serie di esperimenti, una persona con esperienza pratica può vagliare circa 5 composti chimici (ogni composto che richiede un minimo di 6 diluizioni) utilizzando embrioni di pesce zebra in piastre di 24 pozze. In totale, ci vogliono circa 8-10 h dalla creazione di croci per eseguire l'LC50 determinazione in un periodo di 8 giorni.
Figura 2: Grafico che mostra la ripartizione della valutazione della tossicità dei composti chimici. Lo screening della tossicità dei composti chimici richiede 8 giorni e può essere suddiviso in cinque fasi. (Giorno 1) Consiste nell'impostazione di coppie di accoppiamento di pesci zebra in vasche. (Giorno 2) Coinvolge la raccolta di embrioni dai serbatoi di accoppiamento nei piatti Petri, seguita dal tenerli in un incubatore di 28,5 gradi centigradi per una notte. (Giorno 3) Esame degli embrioni utilizzando uno stereoscopio e pulizia degli embrioni. Distribuzione degli embrioni in piastre di 24 pozze e aggiunta delle diluizioni dei composti di prova. (Giorno 4-8) Analisi fenotipiche delle larve per difetti dello sviluppo. Lo studio del modello di nuoto e la determinazione di LC50 sono stati eseguiti l'ultimo giorno di esposizione a composti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Presentazione schematica degli esperimenti coinvolti nella valutazione della tossicità. La valutazione della tossicità consiste nella preparazione di un grafico tabulato contenente informazioni sui composti chimici, sulle diluizioni dei composti e sui parametri da valutare. Rendere la diluizione delle soluzioni di riserva alle concentrazioni desiderate in tubi di centrifuga da 15 mL (la diluizione da un tubo da aggiungere ad ogni fila della piastra di 24 pozze). Una piastra di 24 pozzetto contrassegnata con un indicatore di prova dell'acqua con il nome del composto di prova, concentrazione in ogni riga e data di esposizione. Esame e imaging degli embrioni trasferendo le larve su una piccola piastra Petri contenente cellulosa metilica ad alto peso molecolare del 3%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Esempio di analisi fenotipica delle larve nel composto di controllo e di testo dei gruppi trattati in composti. (A) Le analisi fenotipiche delle larve del gruppo di controllo non trattate con alcun composto non hanno mostrato alcun difetto fenotipico al microscopio. (B) Le larve trattate con un inibitore di CA di 500 m (inibitore noto dell'andradica carbonica IX non hanno mostrato difetti fenotipici osservabili. (C, D) Le larve in via di sviluppo trattate con inibitore di z-CA con concentrazioni rispettivamente di 250 e 125 M. I composti hanno indotto difetti fenotipici come il corpo curvo, l'edema pericardico e il sacco del tuorlo inutilizzato (frecce e punte di freccia). I pannelli A e B sono stati modificati da Aspatwar et al16. I pannelli C, D ed E mostrano immagini inedite, ottenute utilizzando un microscopio diverso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Determinazione della concentrazione letale 50 (LC50) utilizzando larve di pesce zebra 1-5 dpf. La valutazione della tossicità mediante embrioni di pesce zebra consente ai ricercatori di determinare la concentrazione letale minima del composto chimico alla fine dell'esperimento. La concentrazione di LC50 del composto (un inibitore CA IX noto) era di 3,5 mM. L'alta concentrazione di LC50 permette un'ulteriore caratterizzazione del composto. Questa cifra è stata modificata da Aspatwar etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Un esempio di analisi del modello di nuoto in entrambi i gruppi di larve non trattati (A) e inibitori trattati (B). Le larve di pesce zebra trattate nel pannello B con composto inibitore di prova di 300 m (un inibitore noto dell'andrasione carbonica umana IX) hanno mostrato un modello di movimento anormale (atassico) (teste di freccia), suggerendo che il composto induce neurotossicità negli embrioni in via di sviluppo . Le punte di freccia indicano la curvatura normale della coda durante il nuoto. Nel pannello A le frecce indicano la normale curvatura della coda durante il nuoto. Questa cifra è stata modificata da Aspatwar etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Inibitore CA | Screening della tossicità | LC50 | In vivo | CAI tossici | referenza |
| Carbamates | 24 | tutti | 1a | 3b | 24, Inedito |
| Cumarina | 10 | tutti | - | 2 | Inediti |
| Nitroimidazoli | 2 | tutti | 2 | 2c | 16 |
| Sulfonamidi | 5 | tutti | - | 3 | 25 |
| totale | 41 | tutti | 3 | 10 | - |
| un Sulla base dello screening di tossicità, l'inibitore è stato utilizzato per l'inibizione del marinum Mycobacterium nel modello di pesce zebra. b Inibitore letale, cNeurotossico sopra la concentrazione di 300 m | |||||
Tabella 1: Una sintesi della sicurezza e tossicità dei composti sottoposti a screening. L'esperimento di valutazione della tossicità aiuta il ricercatore a giungere a una conclusione sulla sicurezza dei composti chimici testati. La concentrazione di LC50 permette di definire una concentrazione sicura per un'ulteriore caratterizzazione. Un ricercatore può decidere se il composto è letale anche dopo 24 h di esposizione degli embrioni al composto in esame. Nel nostro esempio, un sottile effetto sul nuoto a causa della neurotossicità sono le informazioni significative, che sono utili per la creazione di ulteriori esperimenti. Di conseguenza, sulla base dello screening di tossicità, siamo stati in grado di utilizzare concentrazioni sicure dell'inibitore CA per un'ulteriore caratterizzazione in vivo24.
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Discussion
Il test di tossicità in vitro con cellule coltivate è in grado di rilevare la sopravvivenza e gli studi morfologici delle cellule fornendo informazioni limitate sulla tossicità indotta dal composto di prova. Il vantaggio dello screening della tossicità dei composti chimici che utilizzano embrioni di pesce zebra è la rapida individuazione di cambiamenti fenotipici indotti chimicamente in un intero animale durante lo sviluppo embrionale in un organismo modello pertinente. Circa il 70% dei geni umani che codificano proteine hanno omologhi ortologhi nel genoma del pesce zebra25. Le vie genetiche che controllano la trasduzione e lo sviluppo del segnale sono altamente conservate tra l'uomo e il pesce zebra26e, pertanto, i composti chimici possono avere effetti tossici simili nell'uomo25.
I pesci zebra sono in prima linea nella ricerca tossicologica e sono già stati ampiamente utilizzati per rilevare le tossine nei campioni d'acqua e per studiare il meccanismo di azione delle tossine ambientali e i loro effetti sull'animale27. In questo articolo, mostriamo l'uso di embrioni di pesce zebra in via di sviluppo per valutare la tossicità di potenziali composti nella fase iniziale della scoperta dei farmaci. La nostra valutazione rapida e sfaccettata della tossicità si basa su 1) cambiamenti nel fenotipo dell'organismo (tratteggio, sacche di otolito, edema pericardiale, utilizzo del sacco del tuorlo, sviluppo di notocordo, battito cardiaco, sviluppo della vescica da bagno, movimento) durante l'embrione sviluppo in un periodo di 5 giorni, e 2) determinazione della concentrazione letale (LC50). Ore ragionevoli di lavoro pratico (8-10 h diviso in 8 giorni) è sufficiente per determinare il profilo di tossicità di un composto utilizzando questa procedura. Per i composti appena sintetizzati che sono disponibili in quantità limitate, tossicità può essere valutata utilizzando un minimo di 3 mg del composto. Non è richiesta alcuna attrezzatura speciale. La procedura è, quindi, un modo rapido e a basso costo per valutare gli effetti tossici di qualsiasi composto che può potenzialmente essere sviluppato nel farmaco per uso umano.
La qualità del lotto di embrioni ha un grande impatto sull'esito dell'esperimento. La qualità delle uova (compreso il tasso di fecondazione) non è evidente immediatamente dopo la raccolta dai serbatoi di allevamento (0-4 hpf). Per ottenere solo embrioni normalmente in via di sviluppo per gli esperimenti, prima di aggiungere composti, permettiamo agli embrioni di rimanere a 28,5 gradi centigradi per 24 ore dopo la raccolta dai serbatoi di riproduzione. Dopo 24 hpf, tutti gli embrioni morti o malsani vengono scartati. In aggiunta a questo, si consiglia di avere un gruppo di embrioni trattati in modo fittizio in ogni esperimento per un ulteriore controllo della qualità del lotto di ovuli utilizzati nell'esperimento e per vedere la mortalità di base per determinare con precisione LC50.
Un gruppo trattato in modo fittizio è necessario anche per controllare la tossicità del veicolo preferito. Molte sostanze chimiche sono insolubili in acqua e DMSO è spesso utilizzato come veicolo per la consegna dei composti di prova. Il DMSO è generalmente ben tollerato dagli embrioni in concentrazioni28. A volte, i composti non sono completamente solubili anche in DMSO e la soluzione appare nuvolosa rendendo difficile per la valutazione della tossicità. In questi casi, per ottenere la soluzione di stock del composto completamente solubile e chiaro, l'aggiunta di una goccia di 0.1% NaOH risolverà il problema. È necessario istituire gruppi di controllo adeguati per valutare con precisione la tossicità del composto. Se vengono utilizzati altri veicoli, la loro tossicità intrinseca potrebbe influenzare l'esperimento.
Ogni pozzo di una piastra di 24 pozze contiene da 1-10 embrioni sommersi in un volume totale di 1 mL. Se il composto di prova è disponibile solo in piccole quantità, potrebbe essere necessario utilizzare fino a 10 embrioni per pozzo per valutare la sua tossicità. Si raccomanda vivamente di utilizzare solo 1 embrione per pozzo per ogni analisi16,24,29. La piastra viene conservata a 28,5 gradi centigradi per 5 giorni. A volte si osserva un'evaporazione significativa che causa un netto cambiamento nella concentrazione del composto in un dato pozzo16. Sigillando le lastre di 24 pozzetti con pellicole di paraffina da tutti i lati, posizionando gli embrioni solo nei pozzi centrali e riempiendo gli altri pozzi lungo i cerchi con acqua, è possibile evitare i problemi causati dall'evaporazione. Nei nostri studi precedenti, non abbiamo osservato alcuna evaporazione dei diluenti delle sostanze chimiche da piastre 24 bene24,29. Inoltre, se il composto in questione è noto per essere instabile sotto temperature ambientali, cambiamenti giornalieri di acqua con composto fresco sarà necessario per risultati affidabili.
Il modello di nuoto delle larve di pesce zebra viene analizzato dopo 5 giorni di esposizione al composto. I pozze di una piastra di 24 pozze contenenti 5 larve dpf non sono ideali per lo scopo a causa delle dimensioni limitate del pozzo. Pertanto, per un'analisi accurata del modello di nuoto, le larve devono essere trasferite in una piastra Petri contenente 50 mL di acqua E3 e possono stabilirsi per 2 min prima dell'analisi. Nel nostro studio, solo due inibitori hanno mostrato l'effetto sul modello di nuoto16 tra i 52 inibitori di z-CA e z-CA sottoposti a screening per la sicurezza e la tossicità, in base alla nostra esperienza questo test può rilevare lievi cambiamenti tra cui il lieve movimento atassico delle larve.
Questo studio ha dimostrato che l'unica limitazione al metodo attuale è la destrezza fisica. Questa preoccupazione può essere superata attraverso la ripetizione, come l'abilità di una persona migliora con la pratica. Una volta ottenuta l'esperienza, la valutazione dei composti che utilizzano embrioni di pesce zebra è etica, facile, efficiente e informativa. Ci aspettiamo pertanto che un test così rapido con embrioni di pesce zebra diventi uno strumento popolare per lo screening della tossicità in vivo nella fase iniziale dello sviluppo del farmaco.
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Disclosures
Gli autori non hanno segnalato un potenziale conflitto di interessi.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), della Finnish Cultural Foundation (AA, MH), dell'Accademia della Finlandia (SP, MP), della Orion Farmos Foundation (MH), della Fondazione Tampere Tuberculosis (SP, MH e MP) e della Fondazione Jane e Aatos Erkko (SP e MP) ). Ringraziamo i nostri collaboratori italiani e francesi, il professor Supuran, e il professor Winum, per aver fornito inibitori all'andradica carbonica per la valutazione della sicurezza e della tossicità per scopi di sviluppo di farmaci anti-TB e anti-cancro. Ringraziamo Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti per l'assistenza tecnica. Ringraziamo anche Leena Makinen e Hannaleena Piippo per il loro aiuto con l'allevamento dei pesci zebra e la raccolta degli embrioni. Ringraziamo sinceramente Harlan Barker per la valutazione critica del manoscritto e commenti approfonditi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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