Summary
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है। वे बाह्य रूप से विकसित होते हैं और रसायनों के प्रति संवेदनशील होते हैं, जिससे सूक्ष्म लक्षणीय परिवर्तनों का पता लगाया जा सकता है। प्रयोग केवल यौगिक की एक छोटी राशि की आवश्यकता है, जो सीधे भ्रूण युक्त प्लेट में जोड़ा जाता है, परीक्षण प्रणाली कुशल और लागत प्रभावी बनाने.
Abstract
जेब्राफ़िश रोग और phenotype आधारित दवा की खोज के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया कशेरुकी मॉडल जीव है। जेब्राफ़िश कई संतानों को उत्पन्न करता है, पारदर्शी भ्रूण और तेजी से बाहरी विकास होता है। ज़ेब्राफ़िश भ्रूण, इसलिए भी दवाओं है कि कीमती और छोटी मात्रा में उपलब्ध हैं की विषाक्तता के तेजी से मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. वर्तमान लेख में, 1-5 दिन के बाद निषेचन भ्रूण का उपयोग कर रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता के कुशल स्क्रीनिंग के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। यौगिकों के विभिन्न सांद्रता के संपर्क में आने के कारण फेनोटाइपिक दोषों की जांच करने के लिए भ्रूणों की निगरानी स्टीरियोमाइक्रोस्कोप द्वारा की जाती है। यौगिकों की अर्ध-अधिकतम घातक सांद्रता (एलसी50)भी निर्धारित की जाती है। वर्तमान अध्ययन के लिए 3-6 मिलीग्राम एक अवरोधक यौगिक की आवश्यकता होती है, और पूरे प्रयोग के बारे में लेता है 8-10 एच बुनियादी सुविधाओं वाले एक प्रयोगशाला में एक व्यक्ति द्वारा पूरा किया जा करने के लिए. वर्तमान प्रोटोकॉल किसी भी यौगिक परीक्षण के लिए दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में यौगिक के असहनीय विषाक्त या बंद लक्ष्य प्रभाव की पहचान करने के लिए और सूक्ष्म विषाक्त प्रभाव है कि सेल संस्कृति या अन्य पशु मॉडल में याद किया जा सकता है का पता लगाने के लिए उपयुक्त है. विधि प्रक्रियात्मक देरी और दवा के विकास की लागत कम कर देता है.
Introduction
औषधि विकास एक महंगी प्रक्रिया है। इससे पहले कि एक भी रासायनिक यौगिक खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) और यूरोपीय दवा एजेंसी (EMA) द्वारा अनुमोदित है कई हजार यौगिकों एक अरब डॉलर से अधिक की लागत से जांच कर रहे हैं1. पूर्व नैदानिक विकास के दौरान, इस लागत का सबसे बड़ा हिस्सा पशु परीक्षण2के लिए आवश्यक है। लागत को सीमित करने के लिए, दवा विकास के क्षेत्र में शोधकर्ताओं रासायनिक यौगिकों की सुरक्षा स्क्रीनिंग के लिए वैकल्पिक मॉडल की जरूरत3. इसलिए, दवा के विकास के प्रारंभिक चरण में, यह एक विधि है कि तेजी से सुरक्षा और एक उपयुक्त मॉडल में यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन कर सकते हैं का उपयोग करने के लिए बहुत फायदेमंद होगा. ऐसे कई प्रोटोकॉल हैं जो पशु और कोशिका संवर्धन मॉडलों से जुड़े रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता जांच के लिए उपयोग किए गए हैं लेकिन ऐसा एक भी प्रोटोकॉल नहीं है जिसे मान्य किया गया हो और इसका सामान्य उपयोग4,5है . जेब्राफ़िश का उपयोग करने वाले मौजूदा प्रोटोकॉल की लंबाई अलग-अलग होती है और इसका उपयोग अलग-अलग शोधकर्ताओं द्वारा किया जाता है जिन्होंने अपनी सुविधा की आवश्यकता के अनुसार विषाक्तता का मूल्यांकन कियाहै 6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
हाल के दिनों में भ्रूणीय विकास6,7 के दौरान रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए जेब्राफिश एक सुविधाजनक मॉडल के रूप में उभराहै। जेब्राफ़िश रासायनिक यौगिकों13के मूल्यांकन के लिए कई इन-बिल्ट फायदे हैं। यहां तक कि बड़े पैमाने पर प्रयोगों मिलनसार हैं, के रूप में एक ज़ेब्राफ़िश महिला 200-300 अंडे, जो तेजी से पूर्व vivoविकसित के बैचों रखना कर सकते हैं, एक सप्ताह तक के लिए बाहरी खिलाने की जरूरत नहीं है और पारदर्शी हैं. यौगिकों सीधे पानी में जोड़ा जा सकता है, जहां वे कर सकते हैं (कंपाउंड की प्रकृति पर निर्भर करता है) chorion के माध्यम से फैलाना, और hatching के बाद, त्वचा के माध्यम से, gills और लार्वा के मुंह. प्रयोगों में भ्रूण के छोटे आकार के कारण14 रासायनिक यौगिकों की प्रचुर मात्रा की आवश्यकता नहीं होती है। जेब्राफ़िश भ्रूणों का विकास सामान्य विकासात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक प्रोटीनका अधिकांश व्यक्त करता है। इसलिए, एक ज़ेब्राफ़िश भ्रूण एक संवेदनशील मॉडल का आकलन करने के लिए कि क्या एक संभावित दवा एक प्रोटीन या संकेत अणु है कि विकास महत्वपूर्ण है के समारोह को परेशान कर सकते हैं. जेब्राफ़िश के अंग 2-5 डीपीएफ15के बीच कार्यात्मक हो जाते हैं, और भ्रूण विकास की इस संवेदनशील अवधि के दौरान विषाक्त यौगिक ों के बीच जेब्राफिश लार्वा में फेनोटाइपिक दोष पैदा करते हैं। इन फीनोटाइपिक परिवर्तनों का आसानी से आक्रामक तकनीक11के बिना एक सरल सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है . ज़ेब्राफ़िश भ्रूणों का व्यापक रूप से विषाक् त अनुसंधान में उपयोग किया जाता है , जो कोशिका संस् कृति मॉडल16,17का उपयोग करते हुए इन विट्रो औषध जांच की तुलना में अधिक जैविक जटिलता के कारण विषाक् त अनुसंधान में किया जाता है . कशेरुकी होने के कारण जेब्राफिश का आनुवंशिक और शारीरिक संबंध मनुष्यों से तुलनीय होता है और इसलिए रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता जेब्राफिश और मनुष्योंकेबीच समान होती है8 ,18,19, 20 , 21 , 22. इस प्रकार, रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता और सुरक्षा के मूल्यांकन के लिए दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में ज़ेब्राफ़िश एक महत्वपूर्ण उपकरण है।
वर्तमान लेख में, हम एक ही शोधकर्ता द्वारा 1-5 दिन के बाद निषेचन (dpf) ज़ेबराफ़िश भ्रूण का उपयोग कर कार्बनिक एनहाइड्रेज (सीए) अवरोधक यौगिकों की सुरक्षा और विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया विधि का एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल रासायनिक अवरोधक यौगिकों के विभिन्न सांद्रता के लिए ज़ेब्राफ़िश भ्रूण को उजागर करने और भ्रूण के विकास के दौरान मृत्यु दर और phenotypic परिवर्तन का अध्ययन शामिल है. रासायनिक यौगिकों के लिए जोखिम के अंत में, रासायनिक के LC50 खुराक निर्धारित किया जाता है. विधि एक व्यक्ति को 1-5 परीक्षण यौगिकों की कुशल स्क्रीनिंग करने की अनुमति देती है और विधि के साथ व्यक्ति के अनुभव के आधार पर लगभग 8-10 एच लेता है (चित्र 1)। यौगिकों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए आवश्यक प्रत्येक कदम चित्र 2में रेखांकित किया गया है। सीए inhibitors की विषाक्तता के मूल्यांकन 8 दिनों की आवश्यकता है, और संभोग जोड़े की स्थापना भी शामिल है (दिन 1); प्रजनन टैंक से भ्रूण का संग्रह, सफाई और उन्हें 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (दिन 2) में स्थानांतरित; एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के कुओं में भ्रूण का वितरण और पतला सीए अवरोधक यौगिकों के अलावा (दिन 3); phenotypic विश्लेषण और लार्वा की इमेजिंग (दिन 4-8), और LC के निर्धारण50 खुराक (दिन8). इस विधि तेजी से और कुशल है, रासायनिक यौगिक और प्रयोगशाला के केवल बुनियादी सुविधाओं की एक छोटी राशि की आवश्यकता है.
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Protocol
Tampere विश्वविद्यालय में ज़ेब्राफ़िश कोर सुविधा राष्ट्रीय पशु प्रयोग बोर्ड द्वारा दी गई एक स्थापना प्राधिकरण है (ESAVI/7975/04.10.05/2016). जेब्राफ़िश भ्रूणों का उपयोग करने वाले सभी प्रयोग पूर्वी फिनलैंड की प्रांतीय सरकार, सामाजिक और स्वास्थ्य विभाग के टम्पे रीजनल सर्विस यूनिट प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे - LSLH-2007-7254/
1. रात भर ज़ेब्राफ़िश मैटिंग टैंक की स्थापना
- रात भर संभोग टैंक में 2-5 वयस्क पुरुष जेब्राफ़िश और 3-5 वयस्क महिला जेब्राफ़िश रखें। (प्रजनन सुबह में स्वत: अंधेरे और प्रकाश चक्र रात भर द्वारा प्रेरित किया जाता है).
- दो से अधिक रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता का आकलन करने के लिए पर्याप्त भ्रूण प्राप्त करने के लिए कई पार सेट. विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए, प्रत्येक एकाग्रता की जरूरत है कम से कम 20 भ्रूण23.
- जानवरों के लिए तनाव से निपटने से बचने के लिए, जानवरों प्रजनन के लिए एक ही व्यक्तियों का उपयोग करने से पहले 2 सप्ताह के लिए आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
2. भ्रूण का संग्रह और रासायनिक यौगिकों के लिए एक्सपोजर के लिए प्लेट्स की तैयारी
- भ्रूण ले लीजिए, अगले दिन दोपहर से पहले, एक ठीक-मेश छलनी का उपयोग करके और उन्हें एक पेट्री डिश पर स्थानांतरित करें जिसमें E3 भ्रूण माध्यम [5.0 m NaCl, 0.17 m M KCl, 0.33 m CaCl2, 0.33 m MM MgSO4, और 0.1% w/v Methylene Blue]।
- एक प्लास्टिक पास्चर पिपेट (उदा., भोजन और ठोस अपशिष्ट) का उपयोग कर मलबे को निकालें। अनिषेचित/मृत भ्रूणों को हटाने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के नीचे भ्रूणों के प्रत्येक बैच की जांच करें (उनके अपारदर्शी रूप से पहचाने गए)।
- भ्रूणको इनक्यूबेटर में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें। भ्रूण की जांच, अगली सुबह, एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत और किसी भी अस्वास्थ्यकर या मृत भ्रूण को हटा दें। इसके अलावा, ताजा E3 माध्यम के साथ पुराने E3 माध्यम की जगह.
नोट:ज़ेब्राफ़िश भ्रूण हमेशा प्रयोगशाला परिस्थितियों में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। - ध्यान से भ्रूण को कवर करने के लिए पर्याप्त E3 माध्यम युक्त एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से 1 भ्रूण हस्तांतरण.
3. रासायनिक यौगिकों के स्टॉक समाधान और कुओं में कम यौगिक के वितरण की तैयारी
- 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अवरोधक यौगिकों वाली शीशियों को बाहर निकालिए।
नोट:यौगिक के गुणों के आधार पर, इन विभिन्न तापमान पर जमा हो जाती है. - यौगिक वजन (ओं) एक विश्लेषणात्मक संतुलन है कि कुछ मिलीग्राम वजन कर सकते हैं का उपयोग कर (mg) यौगिक के सही.
- यौगिकों के घुलनशील गुणों के आधार पर प्रत्येक यौगिक के लिए स्टॉक समाधान के कम से कम 250 डिग्री सेल्सियल (100 एमएम) तैयार कीजिए।
नोट:उपरोक्त चरणों को प्रयोग के प्रारंभ होने से एक दिन पहले एक सुविधाजनक समय पर किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है। - 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में E3 पानी का उपयोग करके स्टॉक समाधानों (उदा., 10 $M, 20 $M, 50 $M, 100 $M, 150 $M, 300 $M, 300 $M, 300 $M) के सीरियल कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।
नोट:सांद्रता और सीरियल कमजोर पड़ने की संख्या उनके विषाक्तता के स्तर के आधार पर एक यौगिक से दूसरे यौगिक में भिन्न. - भ्रूण युक्त 24 अच्छी तरह से प्लेट से, एक समय में एक पंक्ति एक पाश्चर पिपेट और एक 1 एमएल पिपेट (एक dpf भ्रूण युक्त) का उपयोग कर कुओं से E3 पानी निकालें।
- 24-वेल प्लेट के कुओं में प्रत्येक कुएं में 1 एमएल वितरित करें (कम से कम और उच्च एकाग्रता में जाने से) प्रत्येक में diluent की।
- भ्रूण के एक ही बैच से एक नियंत्रण समूह की स्थापना और diluent की इसी राशि जोड़ें.
- परिसर के नाम और एकाग्रता के साथ 24-वेल प्लेट्स लेबल करें और प्लेटों को एक इनक्यूबेटर में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
4. एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग भ्रूण के Phenotypic विश्लेषण और इमेजिंग
- रासायनिक यौगिकों के संपर्क में आने के बाद पैरामीटर 24 ज के लिए एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण की जांच करें।
- मृत्यु दर, बच्चे की धड़कन, जर्दी बोरी का उपयोग, तैरना मूत्राशय विकास, मछली के आंदोलन, पेरिकार्डियल एडीमा, और शरीर के आकार23जैसे मापदंडों को नोट करें।
- यौगिक की प्रत्येक एकाग्रता के संपर्क में लार्वा ले लो और उन्हें एक धातु की जांच का उपयोग कर 3% उच्च आणविक वजन मिथाइल सेलूलोज़ युक्त एक छोटे पेट्री डिश में बग़ल में रखना।
नोट:3% मिथाइल सेलूलोज़ (उच्च आणविक के साथ) सूक्ष्म परीक्षा के लिए एक आवश्यक अभिविन्यास के साथ मछली embedding के लिए आवश्यक एक चिपचिपा तरल है. इस तरल में मछली उन्मुख करने के लिए, एक धातु की जांच की जरूरत है. - एक कैमरे से जुड़ी स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवियों को ले लो. प्रयोग के अंत तक प्रत्येक दिन एक अलग फ़ोल्डर में छवियों को सहेजें.
- प्रत्येक दिन किसी तालिका में सभी प्रेक्षण ों को ऑनलाइन तालिका में या किसी मुद्रित पत्रक पर दर्ज करें.
- यदि यौगिकों neurotoxic हैं, 4 से 5 dpf लार्वा बदल तैरना पैटर्न दिखा सकते हैं, या तो असामान्य आंदोलन पैटर्न का प्रदर्शन लार्वा की एक छोटी (30 s से 1 मिनट) वीडियो पर कब्जा करके इस तरह के परिवर्तन का एक रिकॉर्ड बना.
- रासायनिक यौगिकों के संपर्क में आने के 5 दिनों के बाद, उस सांद्रता को नोट कीजिए जिस पर प्रत्येक रसायन के आधे भ्रूण अर्ध-अधिकतम घातक सांद्रता 50 (एलसी50)की गणना के लिए मर जाते हैं।
नोट:LC50 एकाग्रता जिस पर भ्रूण के 50% एक रासायनिक यौगिक के लिए जोखिम के 5 दिनों के अंत में मर जाते हैं. 23 यौगिक की प्रत्येक सांद्रता की विषाक्तता का परीक्षणकरने के लिए कम से कम 20 भ्रूणों का प्रयोग कीजिए . - एक उपयुक्त कार्यक्रम का उपयोग कर सभी सांद्रता के लिए भ्रूण की मृत्यु के लिए एक वक्र का निर्माण.
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Representative Results
विषाक्तता के मूल्यांकन का महत्वपूर्ण हिस्सा एक ही प्रयोग में एक या एकाधिक रासायनिक यौगिकों के विभिन्न सांद्रता का परीक्षण है. आरंभ में, विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए यौगिकों का चयन करें, प्रत्येक यौगिक के लिए परीक्षण करने के लिए सांद्रता की संख्या, और तदनुसार, एक चार्ट बनाएं (चित्र 3)। हमने नमूनों को व्यवस्थित करने के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए एक अद्वितीय रंग का उपयोग किया (चित्र 3)। प्लेटों के नीचे या पक्षों पर विलायक प्रतिरोधी मार्कर और लेबलिंग का उपयोग बाद में मिश्रण से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। यदि यौगिक इनहिबिटरों की विभिन्न सांद्रताओं के संपर्क में आने वाले लार्वा में किसी भी फीनोटाइपिक दोषों को प्रेरित करते हैं, तो दोष 1-5 डीपीएफ की अवधि में प्रत्येक 24 ज दर्ज किए जाते हैं (चित्र 4क, बी, सी, डी)। 500 उउ की सांद्रता में ज्ञात CA IX अवरोधक के साथ उपचारित भ्रूणों ने रासायनिक यौगिक के संपर्क में आने के 1-5 दिनों में कोई स्पष्ट लक्षणीय परिवर्तन नहीं दिखाया (चित्र 4ख) चित्रा 4C और चित्रा 4D से पता चलता है कि जेड-सीए अवरोधकों के साथ इलाज किया भ्रूण है कि विभिन्न phenotypic दोष unhatched भ्रूण भी दिन 3 (तीर सिर), घुमावदार शरीर संरचना (तीर), अप्रयुक्त जर्दी बोरी और pericardial edema (तीर सिर) प्रेरित के साथ इलाज किया और रासायनिक यौगिक (तीर) के साथ उपचार के बाद 5 दिनों में लार्वा में ओटोलिथ कोश की अनुपस्थिति। एक अन्य अध्ययन में, सीए अवरोधक के साथ उपचारित भ्रूण (चित्र 4E) ओटोलिथ थैली और तैरने वाले मूत्राशय (तीर सिर) की अनुपस्थिति को दर्शाता है। हमारे अध्ययन में, (चित्र 4C, डी), हम phenotypic दोष प्रलेखित (अखंड भ्रूण और pigmentation की अनुपस्थिति) सीए अवरोधकों के लिए जोखिम के 1 दिन के बाद भी. फीनोटाइपिक विश्लेषणों से पता चला है कि कुछ अवरोधक यौगिक घातक होते हैं और उन्हें मानव उपयोग के लिए औषधियों के रूप में विकसित नहीं किया जा सकता (चित्र 4 ब्,D और सारणी 1)।
प्रयोगों ने एक प्रतिनिधि यौगिक की पहचान की जो भ्रूण के विकास के दौरान न्यूनतम या कोई फेनोटाइपिक परिवर्तनों को प्रेरित करता है और एक उच्च एलसी50 खुराक दिखाता है (चित्र 5), यह सुझाव देते हैं कि यौगिक आगे की विशेषता के लिए सुरक्षित है और संभावित मानव उपयोग के लिए एक दवा उम्मीदवार के रूप में विकसित किया जा सकताहै 16. यौगिक के संपर्क में आने वाले लार्वा की अभी भी छवियों को देखते हुए कोई फीनोटाइपिक दोष नहीं दिखाई दिए (चित्र 4ठ) तथापि, इसी यौगिक को न्यूरोटॉक्सिक पाया गया और सीए अवरोधक के संपर्क में आने के 5 दिनों के बाद लार्वा में गतिहीन ताक्षर पाए गए (चित्र 6)। इस phenotype केवल सीधे माइक्रोस्कोप के तहत ज़ेब्राफ़िश लार्वा के तैराकी व्यवहार को देख कर पता लगाया जा सकता है. इन अध्ययनों से पता चला है कि जेब्राफिश लार्वा का तंत्रिका विकास 16,17के यौगिक के प्रति संवेदनशील होता है .
चित्रा 1: जेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग कर रासायनिक यौगिकों की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए आवश्यक घंटे में समय: प्रयोगों के एक सेट में, हाथ पर अनुभव के साथ एक व्यक्ति के बारे में स्क्रीन कर सकते हैं 5 रासायनिक यौगिकों (प्रत्येक यौगिक की एक न्यूनतम की आवश्यकता होती है 6 कमजोर पड़ने) 24 अच्छी प्लेटों में ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग कर. कुल में, यह 8 दिनों की अवधि में एलसी50 दृढ़ संकल्प प्रदर्शन करने के लिए पार की स्थापना से 8-10 एच के बारे में लेता है।
चित्र 2: रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता मूल्यांकन के टूटने दिखा चार्ट. रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता स्क्रीनिंग 8 दिनों की आवश्यकता है और पांच चरणों में नीचे टूट सकता है. (दिन 1) टैंक में ज़ेब्राफ़िश संभोग जोड़े की स्थापना के होते हैं। (2 दिन) संभोग टैंक से पेट्री व्यंजन में भ्रूण इकट्ठा करने के बाद उन्हें रात भर के लिए एक 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखने के शामिल है। (दिन 3) स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके भ्रूणों की जांच करना और भ्रूणों की सफाई करना. भ्रूणों का 24-वेल प्लेटों में वितरण और परीक्षण यौगिकों के कमजोर पड़ने को जोड़ना। (दिन 4-8) विकासात्मक दोषों के लिए लार्वा का फेनोटाइपिक विश्लेषण. तैरना पैटर्न अध्ययन और एलसी50 दृढ़ संकल्प यौगिकों के लिए जोखिम के अंतिम दिन पर किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: विषाक्तता मूल्यांकन में शामिल प्रयोगों की Schematic प्रस्तुति. विषाक्तता मूल्यांकन रासायनिक यौगिकों के बारे में जानकारी युक्त सारणीबद्ध चार्ट तैयार करने के होते हैं, यौगिकों और मानकों के कमजोर पड़ने का मूल्यांकन किया जाना है. 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में वांछित सांद्रता के लिए स्टॉक समाधान के कमजोर पड़ने बनाना (एक ट्यूब से कमजोर पड़ने 24 अच्छी थाली की प्रत्येक पंक्ति में जोड़ा जा करने के लिए). एक 24 अच्छी तरह से परीक्षण परिसर के नाम के साथ एक पानी के सबूत मार्कर के साथ चिह्नित प्लेट, प्रत्येक पंक्ति में एकाग्रता, और जोखिम की तारीख. 3% उच्च आणविक वजन मिथाइल सेलूलोज़ युक्त एक छोटे पेट्री डिश पर लार्वा स्थानांतरित करके भ्रूण की जांच और इमेजिंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: नियंत्रण और परीक्षण यौगिक उपचारित समूहों में लार्वा के फीनोटाइपिक विश्लेषण का उदाहरण। (ं) नियंत्रण समूह के लार्वा का फेनोटाइपिक विश्लेषण, जिसका किसी यौगिक में उपचार नहीं किया जाता है, सूक्ष्मदर्शी के नीचे कोई लक्षणीय दोष नहीं दिखाया गया है। (ख) 500 डिग्री सेल्सियस सीए अवरोधक के साथ इलाज किए जाने वाले लार्वा (कार्बनिक एनहाइड्रस IX के ज्ञात अवरोधक) में कोई प्रेक्षणीय फीनोटाइपिक दोष नहीं दिखाई देते हैं। (सी, डी) विकासशील लार्वा क्रमशः 250 डिग्री और 125 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता के साथ जेड-सीए अवरोधक के साथ इलाज किया। यौगिकों ने फिनोटाइपिक दोषों जैसे घुमावदार शरीर, हृदयावरदियल एडीमा, और अप्रयुक्त जर्दी थैली (तीर और तीर सिर) को प्रेरित किया। पैनल ए और बी को असपतवार एट अल16से संशोधित किया गया है . पैनल सी, डी और ई पहले अप्रकाशित छवियों, जो एक अलग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया गया दिखा. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: घातक सांद्रता का निर्धारण 50 (एलसी50) 1-5 dpf ज़ेब्राफ़िश लार्वा का उपयोग कर. ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग विषाक्तता मूल्यांकन शोधकर्ताओं प्रयोग के अंत में रासायनिक यौगिक की न्यूनतम घातक एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. LC50 यौगिक की एकाग्रता (एक ज्ञात CA IX अवरोध करनेवाला) 3.5 m था. उच्च LC50 एकाग्रता यौगिक के आगे लक्षण की अनुमति देता है. यह आंकड़ा असपतवार एट अल16से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: अनुपचारित (ए) और अवरोधक उपचारित (बी) लार्वा के समूहों दोनों में तैरना पैटर्न विश्लेषण का एक उदाहरण। 300 डिग्री सेल्सियस परीक्षण अवरोध करनेवाला यौगिक (मानव कार्बोनिक एनहाइड्रस IX का एक ज्ञात अवरोधक) के साथ पैनल बी में इलाज किए गए जेब्राफ़िश लार्वा ने एक असामान्य (एटैक्सिक) आंदोलन पैटर्न (एरो सिर) दिखाया, यह सुझाव देता है कि यौगिक विकासशील भ्रूण ों में न्यूरोटॉक्सिसिटी पैदा करता है . ऐरोहेड्स तैराकी के दौरान पूंछ की सामान्य वक्रता की ओर इशारा करते हैं। पैनल में एक तीर तैराकी के दौरान पूंछ की सामान्य वक्रता को इंगित करते हैं। यह आंकड़ा असपतवार एट अल16से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| सीए अवरोधक | विषाक्तता स्क्रीनिंग | एलसी50 | विवो में | विषाक्त CAIs | संदर्भ |
| कार्बामेट्स | 24 | सभी | 1क | 3ख | 24, अप्रकाशित |
| कूमारिन्स | 10 | सभी | - | 2 | अप्रकाशित |
| नाइटोइमिडाज़ोल्स | 2 | सभी | 2 | 2ग | 16 |
| सल्फोनामिडीज | 5 | सभी | - | 3 | 25 |
| कुल | 41 | सभी | 3 | 10 | - |
| एक विषाक्तता स्क्रीनिंग के आधार पर, अवरोध करनेवाला जेब्राफ़िश मॉडल में माइकोबैक्टीरियम मैरिनम के निषेध के लिए इस्तेमाल किया गया था। ख घातक अवरोधक, 300 डिग्री सेल्सियस एकाग्रता से ऊपर cneurotoxic | |||||
तालिका 1: सुरक्षा और यौगिकों की विषाक्तता का एक सारांश जांच की. विषाक्तता मूल्यांकन प्रयोग शोधकर्ता परीक्षण रासायनिक यौगिकों की सुरक्षा के बारे में एक निष्कर्ष तक पहुँचने में मदद करता है. LC50 एकाग्रता आगे विशेषता के लिए सुरक्षित एकाग्रता को परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है. एक शोधकर्ता यह तय कर सकता है कि जांच के तहत परिसर में भ्रूणों के 24 एच के संपर्क के बाद भी यौगिक घातक है या नहीं। हमारे उदाहरण में, neurotoxicity के कारण तैराकी पर एक सूक्ष्म प्रभाव महत्वपूर्ण जानकारी है, जो आगे के प्रयोगों की स्थापना के लिए उपयोगी है. तदनुसार, विषाक्तता स्क्रीनिंग के आधार पर, हम vivo24में आगे विशेषता के लिए सीए अवरोध करनेवाला के सुरक्षित सांद्रता का उपयोग करने में सक्षम थे.
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Discussion
सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग कर इन विट्रो विषाक्तता परीक्षण परीक्षण यौगिक द्वारा प्रेरित विषाक्तता के बारे में सीमित जानकारी प्रदान करने वाली कोशिकाओं के अस्तित्व और रूपात्मक अध्ययन का पता लगा सकते हैं। जेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग कर रासायनिक यौगिकों की विषाक्तता स्क्रीनिंग का लाभ एक प्रासंगिक मॉडल जीव में भ्रूण विकास के दौरान एक पूरे जानवर में रासायनिक प्रेरित phenotypic परिवर्तन का तेजी से पता लगाने है. लगभग 70% प्रोटीन-कोडिंग मानव जीनों में जेब्राफिश जीनोम25में ऑर्थोलॉग होते हैं. आनुवंशिक मार्ग जो संकेत परिवर्तन और विकास को नियंत्रित करते हैं , मानव और जेब्राफिश26के बीचअत्यधिक संरक्षित होते हैं और इसलिए रासायनिक यौगिकों के मनुष्यों में समान विषाक्त प्रभाव होने की संभावना है 25 .
ज़ेब्राफ़िश विषविज्ञानीय अनुसंधान के मामले में सबसे आगे हैं और पहले से ही पानी के नमूनों में विषाक्त पदार्थों का पता लगाने और पर्यावरण संबंधी विषाक्त पदार्थों की कार्रवाई के तंत्र और पशु27पर उनके प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है . इस लेख में, हम दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में संभावित यौगिकों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए ज़ेब्राफ़िश भ्रूण विकसित करने का उपयोग दिखाते हैं। हमारा तेजी से और बहुमुखी विषाक्तता मूल्यांकन 1) भ्रूण के दौरान जीव के फीनोटाइप में परिवर्तन (हैचिंग, ओटोलिथ सैक, पेरिकार्डियल एडीमा, जर्दी थैली उपयोग, नोटोकॉर्ड विकास, दिल की धड़कन, तैरना मूत्राशय विकास, आंदोलन) में परिवर्तन पर आधारित है 5 दिनों की अवधि में विकास, और 2) घातक एकाग्रता का निर्धारण (एलसी50)। हाथ पर काम के उचित घंटे (8-10 एच 8 दिनों से अधिक विभाजित) इस प्रक्रिया का उपयोग कर एक यौगिक की विषाक्तता प्रोफ़ाइल निर्धारित करने के लिए पर्याप्त है. सीमित मात्रा में उपलब्ध हैं कि नए संश्लेषित यौगिकों के लिए, विषाक्तता की एक न्यूनतम का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता 3 यौगिक की मिलीग्राम. कोई विशेष उपकरण की आवश्यकता है. प्रक्रिया है, इस प्रकार, एक तेजी से और कम लागत तरीका है कि संभावित मानव उपयोग के लिए दवा में विकसित किया जा सकता है किसी भी यौगिक के विषाक्त प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए.
भ्रूण के बैच की गुणवत्ता प्रयोग के परिणाम पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है. अंडे की गुणवत्ता (निषेचन की दर सहित) प्रजनन टैंक (0-4 hpf) से संग्रह के तुरंत बाद स्पष्ट नहीं है। प्रयोगों के लिए केवल सामान्य रूप से विकसित भ्रूण प्राप्त करने के लिए, यौगिकों को जोड़ने से पहले, हम भ्रूण प्रजनन टैंक से संग्रह के बाद 24 एच के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर रहने के लिए अनुमति देते हैं। 24 hpf के बाद, किसी भी मृत या अस्वस्थ दिखने भ्रूण त्याग रहे हैं. इसके अतिरिक्त, प्रयोग में प्रयुक्त अंडों के बैच की गुणवत्ता को और नियंत्रित करने के साथ-साथ एलसी 50 का सही निर्धारण करने के लिए आधारभूत मृत्यु दर को देखने के लिए प्रत्येक प्रयोग में भ्रूणों का एक नकली-उपचारित समूह रखने की सलाह दी जातीहै।
एक नकली इलाज समूह भी पसंद के वाहन की विषाक्तता के लिए नियंत्रित करने की जरूरत है. कई रसायनों पानी में अघुलनशील हैं और DMSO अक्सर परीक्षण यौगिकों की डिलीवरी के लिए वाहन के रूप में प्रयोग किया जाता है. DMSO आम तौर पर अच्छी तरह से कम में भ्रूण द्वारा सहन किया जाता है (0.1%) सांद्रता28| कभी कभी, यौगिकों DMSO में भी पूरी तरह से घुलनशील नहीं हैं और समाधान यह विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए मुश्किल बना बादल प्रकट होता है. ऐसे मामलों में, परिसर के शेयर समाधान पूरी तरह से घुलनशील और स्पष्ट पाने के लिए, 0.1% NaOH की एक बूंद जोड़ने समस्या का समाधान होगा. परिसर की विषाक्तता का सही आकलन करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण समूहों की स्थापना की आवश्यकता है। यदि अन्य वाहनों का उपयोग किया जाता है, उनके निहित विषाक्तता प्रयोग को प्रभावित कर सकता है.
24-वेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में 1-10 भ्रूण होते हैं जो 1 एमएल की कुल मात्रा में डूब जाते हैं। यदि परीक्षण यौगिक केवल छोटी मात्रा में उपलब्ध है, यह अपनी विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए अच्छी तरह से प्रति 10 भ्रूण अप करने के लिए उपयोग करने के लिए आवश्यक हो सकता है. यह अत्यधिक सुझाया जाता है कि प्रत्येक विश्लेषण16,24,29के लिए प्रति कुएं में केवल 1 भ्रूण का प्रयोग किया जाना चाहिए . प्लेट 5 दिनों के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संग्रहीत की जाती है। कभी - कभी महत्वपूर्ण वाष्पन देखा जाता है जिसके कारण किसी कुएं में यौगिक की सांद्रता में उल्लेखनीय परिवर्तन होता है. सभी पक्षों से पैराफिन फिल्मों के साथ 24-वेल प्लेटों को सील करके, केवल मध्य कुओं में भ्रूण रखने और रिम्स के साथ अन्य कुओं को पानी से भरने से बचा जा सकता है, वाष्पीकरण के कारण होने वाली समस्याओं से बचा जा सकता है। हमारे पहले के अध्ययनों में, हमने 24 अच्छी प्लेटों24,29से रसायनों के विदारकों के वाष्पन का कोई वाष्पन नहीं देखा था . इसके अलावा, अगर प्रश्न में यौगिक परिवेश के तापमान के तहत अस्थिर होने के लिए जाना जाता है, ताजा यौगिक के साथ पानी के दैनिक परिवर्तन विश्वसनीय परिणामों के लिए आवश्यक हो जाएगा.
परिसर के संपर्क में आने के 5 दिनों के बाद जेब्राफिश लार्वा के तैरना पैटर्न का विश्लेषण किया जाता है। कुएं के सीमित आकार के कारण 5 डीपीएफ लार्वा युक्त 24-वेल प्लेट के कुएं इस उद्देश्य के लिए आदर्श नहीं हैं। इसलिए, तैरना पैटर्न का सटीक विश्लेषण के लिए, लार्वा को एक पेट्री डिश में स्थानांतरित करने की आवश्यकता होती है जिसमें 50 एमएल का ई3 पानी होता है और विश्लेषण से पहले 2 मिनट के लिए व्यवस्थित किया जा सकता है। हमारे अध्ययन में, केवल दो अवरोधकों ने सुरक्षा और विषाक्तता के लिए जांचे गए 52 जेड-सीए और जेड-सीए अवरोधकों के बीच तैरना पैटर्न16 पर प्रभाव दिखाया, हमारे अनुभव के आधार पर यह परीक्षण लार्वा के हल्के ataxic आंदोलन सहित सूक्ष्म परिवर्तनों का पता लगा सकता है।
इस अध्ययन से पता चला है कि वर्तमान विधि के लिए केवल सीमा भौतिक निपुणता है. इस चिंता को पुनरावृत्ति के माध्यम से दूर किया जा सकता है, के रूप में एक व्यक्ति के कौशल अभ्यास के साथ सुधार. एक बार विशेषज्ञता ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग यौगिकों का मूल्यांकन हासिल किया है नैतिक, आसान, कुशल और जानकारीपूर्ण है. इसलिए, हम उम्मीद करते हैं कि इस तरह के एक तेजी से परख ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग कर दवा के विकास के प्रारंभिक चरण में vivo विषाक्तता स्क्रीनिंग के लिए एक लोकप्रिय उपकरण बन जाएगा.
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Disclosures
लेखकों द्वारा हितों के कोई संभावित संघर्ष की सूचना नहीं दी गई थी।
Acknowledgments
इस कार्य को सिग्रिड जुसेलियस फाउंडेशन (एसपी, एमपी), फिनिश कल्चरल फाउंडेशन (एए, महाराष्ट्र), फिनलैंड की अकादमी (एसपी, एमपी), ओरियन फरमोस फाउंडेशन (एमएच), टैम्पल क्षय रोग फाउंडेशन (एसपी, महाराष्ट्र और एमपी) और जेन और एटोस एर्कको फाउंडेशन (एसपी और एमपी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। ). हम अपने इतालवी और फ्रेंच सहयोगियों, प्रो Supuran, और प्रो Winum, विरोधी टीबी और विरोधी कैंसर दवा विकास प्रयोजनों के लिए सुरक्षा और विषाक्तता मूल्यांकन के लिए कार्बोनिक anhydrase inhibitors प्रदान करने के लिए धन्यवाद. हम तकनीकी सहायता के लिए Aulikki Lehmus और Marianne Kuuslahti धन्यवाद. हम भी जेब्राफ़िश प्रजनन और भ्रूण के संग्रह के साथ उनकी मदद के लिए लीना मकीन और Hannaleena Piippo धन्यवाद. हम ईमानदारी से पांडुलिपि और व्यावहारिक टिप्पणी के महत्वपूर्ण मूल्यांकन के लिए Harlan बार्कर धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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