Summary
Sebrafisk embryo brukes for å evaluere toksisitet av kjemiske forbindelser. De utvikler seg eksternt og er følsomme for kjemikalier, slik at påvisning av subtile fenotypiske endringer. Eksperimentet krever bare en liten mengde sammensatte, som er direkte lagt til platen som inneholder embryo, noe som gjør testingen systemet effektiv og kostnadseffektiv.
Abstract
Sebrafisk er en mye brukt virveldyr modell organisme for sykdommen og fenotype-baserte narkotika funn. Sebrafisk genererer mange avkom, har transparent embryo og rask ekstern utvikling. Sebrafisk embryo kan derfor også brukes til rask evaluering av toksisitet av legemidler som er dyrebare og tilgjengelige i små mengder. I denne artikkelen er en metode for effektiv screening av toksisitet av kjemiske forbindelser med 1-5-dagers post befruktning embryo beskrevet. Embryo overvåkes av stereomikroskopet å undersøke fenotypiske defekter forårsaket av eksponering for ulike konsentrasjoner av forbindelser. Halv-maksimal dødelige konsentrasjoner (LC50) av forbindelsene er også bestemt. Den nåværende studien krevde 3-6 mg av en inhibitor sammensatt, og hele eksperimentet tar ca 8-10 h skal fylles ut av en person i et laboratorium har grunnleggende fasiliteter. Den nåværende protokollen er egnet for å teste alle sammensatte å identifisere uutholdelig giftig eller off-Target effekter av sammensatt i den tidlige fasen av stoffet funnet og å oppdage subtile toksiske effekter som kan være savnet i cellen kultur eller andre dyremodeller. Metoden reduserer prosessuelle forsinkelser og kostnader ved narkotika utvikling.
Introduction
Drug utvikling er en kostbar prosess. Før en enkelt kjemisk sammensatt er godkjent av Food and Drug Administration (FDA) og European legemiddel Agency (EMA) flere tusen forbindelser er vist til en kostnad på over 1 000 000 000 dollar1. Under prekliniske utvikling, er den største delen av denne kostnaden som kreves for dyret testing2. For å begrense kostnadene, forskere innen narkotika utvikling trenger alternative modeller for sikkerhet screening av kjemiske forbindelser3. Derfor, i den tidlige fasen av stoffet utvikling, det ville være svært gunstig å bruke en metode som raskt kan evaluere sikkerhet og toksisitet av forbindelsene i en passende modell. Det er flere protokoller som har blitt brukt for toksisitet screening av kjemiske forbindelser som involverer dyr og cellekultur modeller, men det er ikke en enkelt protokoll som er validert og er i felles bruk4,5. Eksisterende protokoller som bruker sebrafisk varierer i lengde og har blitt brukt av individuelle forskere som evaluerte toksisitet som per deres bekvemmelighet kravet6,7,8,9, 10 andre , 11 flere , Det er 12.
I den siste tiden har sebrafisk dukket opp som en praktisk modell for evaluering av toksisitet av kjemiske forbindelser under embryonale utviklingen6,7. Sebrafisk har mange innebygde fordeler for evalueringen av kjemiske forbindelser13. Selv store eksperimenter er mottagelig, som en sebrafisk kvinne kan legge grupper av 200-300 egg, som utvikler raskt ex vivo, trenger ikke ekstern fôring i opptil en uke og er gjennomsiktige. Forbindelsene kan legges direkte i vannet, hvor de kan (avhengig av arten av sammensatte) diffus gjennom chorionic, og etter klekking, gjennom huden, gjellene og munningen av larver. Eksperimentene krever ikke store mengder kjemiske forbindelser14 på grunn av den lille størrelsen på fosteret. Utvikle sebrafisk embryo uttrykker det meste av proteiner som kreves for å oppnå normal utviklingsmessige utfallet. Derfor er et sebrafisk embryo en følsom modell for å vurdere om et potensielt legemiddel kan forstyrre funksjonen til et protein eller signaliserer molekyl som er developmentally signifikant. Organene i sebrafisk blir funksjonelle mellom 2-5 DPF15, og forbindelser som er giftige i løpet av denne sensitive perioden av embryonale utviklingen induserer fenotypiske defekter i sebrafisk larver. Disse fenotypiske endringene kan lett oppdages ved hjelp av et enkelt mikroskop uten invasive teknikker11. Sebrafisk embryo er mye brukt i toksikologiske undersøkelser på grunn av deres mye større biologisk kompleksitet sammenlignet med in vitro Drug screening ved hjelp av cellekultur modeller16,17. Som virveldyr, genetisk og fysiologiske makeup av sebrafisk er sammenlignbare med mennesker og dermed toksisitet av kjemiske forbindelser er lik mellom sebrafisk og mennesker8,18,19, 20 priser og , 21 priser og , 22. sebrafisk er således et verdifullt redskap i den tidlige fasen av narkotika funnet for evalueringen av toksisitet og sikkerheten til de kjemiske forbindelsene.
I denne artikkelen gir vi en detaljert beskrivelse av metoden som brukes for å evaluere sikkerhet og toksisitet av Karbons karboanhydrasehemmere (CA) inhibitor forbindelser med 1-5-dagers post befruktning (DPF) sebrafisk embryo av en enkelt forsker. Protokollen innebærer å utsette sebrafisk embryo til ulike konsentrasjoner av kjemisk inhibitor forbindelser og studere dødelighet og fenotypiske endringer i løpet av embryoutvikling. På slutten av eksponeringen til kjemiske forbindelser, er LC50 dose av kjemiske bestemmes. Metoden gjør det mulig for en person å utføre effektiv screening av 1-5 test forbindelser og tar ca 8-10 h avhengig av opplevelsen av personen med metoden (figur 1). Hvert av trinnene som kreves for å vurdere toksisitet av forbindelsene er skissert i figur 2. Evalueringen av toksisitet av CA-hemmere krever 8 dager, og omfatter oppsett av parring par (dag 1); samling av embryo fra avl tanker, rengjøring og overføre dem til 28,5 ° c inkubator (dag 2); distribusjon av embryo inn i brønnene av en 24-brønn plate og tillegg av utvannet CA inhibitor forbindelser (dag 3); fenotypiske analyse og bilde av larver (dag 4-8), og bestemmelse av LC50 dose (day8). Denne metoden er rask og effektiv, krever en liten mengde av den kjemiske forbindelsen og bare grunnleggende fasiliteter i laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sebrafisk kjerne anlegg ved Tampere University har en etablerings autorisasjon gitt av det nasjonale dyre eksperiment kortet (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Alle eksperimentene bruker sebrafisk embryo ble utført i henhold til provinsielle regjeringen i øst-Finland, sosial og helse Department of Tampere Regional Service Unit Protocol # LSLH-2007-7254/YM-23.
1. oppsett av overnight sebrafisk mating tanker
- Plasser 2-5 voksne mannlige sebrafisk og 3-5 voksen kvinnelig sebrafisk inn i par Rings tanker over natten. (Avl er indusert i morgen av automatisk mørke og lys syklus over natten).
- Sett opp flere kors for å få nok embryo for å vurdere toksisitet av mer enn to kjemiske forbindelser. For evalueringen av toksisitet, trenger hver konsentrasjon minst 20 embryo23.
- For å unngå å håndtere stress til dyrene, la dyrene til å hvile i 2 uker før du bruker de samme individene for avl.
2. innsamling av embryo og forbereder plater for eksponering for kjemiske forbindelser
- Samle embryo, neste dag før middag, ved hjelp av en fin-mesh sil og overføre dem til en Petri parabolen inneholder E3 embryo medium [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4, og 0,1% w/v metylen blå].
- Fjern rusk ved hjelp av en plastikk Pasteur pipette (for eksempel mat og fast avfall). Undersøk hver gruppe av embryo under stereomikroskopet å fjerne ubefruktede/døde embryo (identifisert av deres ugjennomsiktig utseende).
- Oppbevar embryo ved 28,5 ° c i en inkubator. Undersøk embryo, neste morgen, under en stereomikroskopet og fjern eventuelle usunne eller døde embryo. Også erstatte den gamle E3 medium med friske E3 medium.
Merk: sebrafisk embryo er alltid opprettholdt ved 28,5 ° c under laboratorieforhold. - Forsiktig overføre 1 embryo i hver brønn av en 24-brønn plate som inneholder nok E3 medium for å dekke embryo.
3. preparater av Stock løsning av kjemiske forbindelser og distribusjon av utvannet Compound i Wells
- Ta ut hetteglassene med inhibitor forbindelser lagret ved 4 ° c.
Merk: avhengig av egenskapene til det sammensatte, disse er lagret ved forskjellige temperaturer. - Veie sammensatt (e) ved hjelp av en analytisk balanse som kan veie noen milligram (mg) av sammensatt nøyaktig.
- Forbered minst 250 μL (100 mM) lagerløsning for hver forbindelse i et egnet løsemiddel (for eksempel E3 vann eller dimethyl sulfoxide (DMSO), basert på løselighet egenskapene til forbindelsene.
Merk: trinnene ovenfor kan gjøres en dag før starten av eksperimentet på et passende tidspunkt og lagres ved 4 ° c). - Lag serie fortynninger av lager løsningene (f.eks. 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM og 500 μM) ved bruk av E3-vann i 15 mL sentrifugerør.
Merk: konsentrasjonen og antallet serielle fortynninger varierer fra ett sammensatt til et annet sammensatt, avhengig av deres toksisitet nivåer. - Fra 24 brønn plate som inneholder embryo, fjerne E3 vann fra brønnene ved hjelp av en Pasteur pipette og en 1 mL pipette (som inneholder 1 DPF embryo) én rad om gangen.
- Fordel 1 mL av hver fortynningsmiddel i hver brønn (Start fra lavere og flytte til høyere konsentrasjon) i brønnene på 24-brønn plate.
- Sett opp en kontrollgruppe fra samme parti av embryo og tilsett tilsvarende mengde fortynningsmiddel.
- Label 24-brønn plater med navn og konsentrasjon av sammensatte og holde platene ved 28,5 ° c i en inkubator.
4. fenotypiske analyse og Imaging av embryo bruke en stereomikroskopet
- Undersøk embryo under en stereomikroskopet for parametre 24 h etter eksponering for kjemiske forbindelser.
- Merk parametrene som dødelighet, klekking, hjerterytme, utnyttelse av eggeplomme sekk, svømme blære utvikling, bevegelse av fisken, perikard ødem, og formen på kroppen23.
- Ta Larvene eksponert for hver konsentrasjon av sammensatte og legge dem sidelengs i en liten Petri parabolen inneholder 3% høy molekylvekt metyl cellulose ved hjelp av en metall sonde.
Merk: 3% methyl cellulose (høy molekyl med) er en viskøs væske som trengs for å bygge inn fisken med en nødvendig orientering for mikroskopisk undersøkelse. For orientere fisken i denne væsken, er en metall sonde nødvendig. - Ta bilder ved hjelp stereomikroskopet festet til et kamera. Lagre bildene i en egen mappe hver dag til slutten av eksperimentet.
- Angi alle observasjonene i en tabell hver dag, enten i en elektronisk tabell eller på et utskrevet ark.
- Hvis forbindelsene er nevrotoksiske, de 4 til 5 DPF larver kan vise endrede svømme mønster, lage en oversikt over slike endringer enten ved å fange en kort (30 s til 1 min) video av Larvene viser unormal bevegelse mønster.
- Etter 5 dager med eksponering for kjemiske forbindelser, Legg merke til konsentrasjonen der halvparten av embryo dø for beregning av en halv maksimal dødelig konsentrasjon 50 (LC50) av hver kjemisk.
Merk: LC50 er konsentrasjonen der 50% av embryo dø på slutten av 5 dager etter eksponering for en kjemisk sammensatte. Bruk minimum 20 embryo for å teste toksisitet av hver konsentrasjon av en sammensatt23. - Lag en kurve for dødelighet av embryo for alle konsentrasjoner ved hjelp av et egnet program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kritiske delen av evalueringen av toksisitet er å teste ulike konsentrasjoner av en eller flere kjemiske forbindelser i et enkelt eksperiment. I begynnelsen, Velg forbindelsene for evaluering av toksisitet, antall konsentrasjoner å teste for hver sammensatte, og følgelig lage et diagram (Figur 3). Vi brukte en unik farge for hver sammensatte å organisere prøvene (Figur 3). Bruk av løsemiddelbestandig markør og merking på bunnen eller sidene av platene er viktig for å unngå å blande seg opp senere. Hvis forbindelsene induserer noen fenotypiske defekter i Larvene eksponert for ulike konsentrasjoner av hemmere, er defekter registreres hver 24 h over perioden 1-5 DPF (figur 4a, B, C, D). Embryo behandlet med en kjent CA IX-hemmer ved en konsentrasjon på 500 μM viste ingen åpenbare fenotypiske endringer i 1-5 dager etter eksponering for den kjemiske forbindelsen (figur 4b). Figur 4c og figur 4d viser embryo behandlet med β-ca hemmere som indusert ulike fenotypiske defekter uklekket embryo selv på dag 3 (pil hode), buet kropps struktur (pil), unutilized eggeplomme sekk og perikard ødem (pil hode) og fravær av otolith SACs i Larvene på 5 dager etter behandling med kjemisk sammensatte (pil). I en annen studie, embryo behandlet med CA inhibitor (figur 4e) viser fraværet av otolith SACs og svømme blære (pil hoder). I vår studie, (figur 4c, D), dokumenterte vi fenotypiske defekter (skjøre embryo og fravær av pigmentering) selv etter dag 1 av eksponering for ca-hemmere. Fenotypiske analyser viste at noen av inhibitor forbindelsene er dødelige og ikke kan utvikles som medikamenter for menneskelig bruk (figur 4c, D og tabell 1).
Eksperimentene identifiserte en representativ sammensatt som indusert minimal eller ingen fenotypiske endringer under embryoutvikling og viste en høy LC50 dose (figur 5), noe som tyder på at forbindelsen er trygt for videre karakterisering og kan potensielt utvikles til et medikament kandidat for menneskelig bruk16. Ser på stillbilder av larver eksponert for sammensatte viste ingen fenotypiske defekter (Figur 4B). Imidlertid ble det samme sammensatte funnet å være nevrotoksiske og indusert ataksi i Larvene etter 5-dager med eksponering for CA inhibitor (figur 6). Denne fenotype kan bare oppdages ved å observere svømme atferden til sebrafisk larver under mikroskopet. Disse studiene antydet at neural utvikling av sebrafisk larver er følsom for sammensatte16,17.
Figur 1: tid i timer som kreves for rask screening av kjemiske forbindelser ved hjelp av sebrafisk embryo: I ett sett eksperimenter, en person med hands-on erfaring kan skjermen ca 5 kjemiske forbindelser (hver sammensatte krever minimum 6 fortynninger) ved hjelp sebrafisk embryo i 24-brønn plater. I alt tar det ca 8-10 h fra innstillingen opp av kors til å utføre LC50 bestemmelse over en periode på 8 dager.
Figur 2: diagram som viser fordelingen av toksisitet evaluering av kjemiske forbindelser. Toksisitet screening av kjemiske forbindelser krever 8 dager og kan brytes ned i fem trinn. (Dag 1) Består av å sette opp av sebrafisk par i tanker. (Dag 2) Innebærer å samle embryo fra parings tankene i Petri retter etterfulgt av å holde dem på en 28,5 ° c inkubator for natten. (Dag 3) Undersøkelse av embryo ved hjelp av en stereomikroskopet og rengjøring av embryo. Fordeling av embryo i 24-brønn plater og legge til fortynninger av testen forbindelser. (Dag 4-8) Fenotypiske analyser av larver for utviklingsmessige defekter. Swim mønster studie og LC50 bestemmelse ble utført på den siste dagen av eksponering for forbindelser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk presentasjon av eksperimenter som er involvert i toksisitet evaluering. Toksisitet evalueringen består av å utarbeide tabell kart som inneholder informasjon om kjemiske forbindelser, fortynninger av forbindelsene og parametrene som skal vurderes. Making fortynning av lager løsninger til ønsket konsentrasjoner i 15 mL sentrifugerør (fortynning fra ett rør som skal legges til hver rad av 24-brønn plate). En 24-brønn plate merket med en vanntett markør med navnet på testen sammensatte, konsentrasjon i hver rad, og dato for eksponering. Undersøkelse og bilde av embryo ved å overføre Larvene til en liten Petri-tallerken som inneholder 3% høy molekylvekt metyl cellulose. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksempel på fenotypiske analyse av Larvene i kontroll og test sammensatte behandlede grupper. (A) fenotypiske analyser av kontrollgruppen Larvene ikke behandlet med noen forbindelse viste ingen fenotypiske defekt under et mikroskop. (B) larver behandlet med 500 μM ca-hemmer (kjent hemmer av KARBONS karboanhydrasehemmere IX viste ingen Observer fenotypiske defekter. (C, D) De utvikler larver behandlet med β-CA inhibitor med konsentrasjoner av 250 μΜ og 125 μM hhv. Forbindelsene indusert fenotypiske defekter som buet kropp, perikard ødem, og unutilized eggeplomme sac (piler og pil hoder). Panel A og B har blitt modifisert fra Aspatwar et al16. Panelene C, D og E Vis tidligere upubliserte bilder, som ble innhentet ved hjelp av et annet mikroskop. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: fastsettelse av dødelig konsentrasjon 50 (LC50) ved hjelp av 1-5 DPF sebrafisk larver. Toksisitet vurdering ved hjelp av sebrafisk embryo gjør forskerne til å bestemme den minste dødelige konsentrasjonen av den kjemiske sammensatte på slutten av eksperimentet. Den LC50 konsentrasjon av sammensatte (en kjent ca IX inhibitor) var 3,5 mm. Den høye LC50 -konsentrasjonen gjør det mulig å karakterisering sammensatt. Dette tallet er blitt modifisert fra Aspatwar et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: et eksempel på svømme mønster analyse i både ubehandlet (A) og inhibitor behandlet (B) grupper av larver. Den sebrafisk larver behandlet i panel B med 300 μM test inhibitor sammensatte (en kjent hemmer av menneskelig Karbons karboanhydrasehemmere IX) viste en unormal (Ataxic) bevegelse mønster (pilhodene), noe som tyder på at forbindelsen induserer nevrotoksisitet i å utvikle embryo . Pilspissene peker på den normale krumning av halen under svømming. I panel A pilene peker til normal krumning av halen under svømming. Dette tallet er endret fra Aspatwar et al.16. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| CA-hemmer | Screening ved toksisitet | LC50 | I vivo | Giftig CAIs | Referanse |
| Karbamater | 24 | Alle | 1a | 3b | 24, upubliserte |
| Kumariner | 10 | Alle | - | 2 | Upubliserte |
| Nitroimidazoler | 2 | Alle | 2 | 2c | 16 |
| Sulfonamider | 5 | Alle | - | 3 | 25 |
| Totalt | 41 | Alle | 3 | 10 | - |
| en egen Basert på toksisitet screening ble inhibitor brukt for hemming av Mycobacterium marinum i sebrafisk modell. b Dødelig inhibitor, cnevrotoksiske over 300 μM konsentrasjon | |||||
Tabell 1: en oppsummering av sikkerhet og toksisitet av forbindelsene vist. Forsøket på toksisitet evaluering hjelper forskeren til å nå en konklusjon om sikkerheten til de testede kjemiske forbindelsene. LC50 -konsentrasjonen gjør det mulig å definere sikker konsentrasjon for videre karakterisering. En forsker kan avgjøre om sammensatt er dødelig selv etter 24 h av eksponering av embryo til sammensatt under etterforskning. I vårt eksempel er en subtil effekt på svømming på grunn av nevrotoksisitet viktig informasjon, som er nyttig for å sette opp ytterligere eksperimenter. Følgelig, basert på toksisitet screening, var vi i stand til å bruke sikre konsentrasjoner av CA-hemmer for videre karakterisering i vivo24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vitro toksisitet test ved hjelp av kulturperler celler kan oppdage overlevelse og morfologiske studier av cellene gir begrenset informasjon om toksisitet indusert av testen sammensatte. Fordelen med toksisitet screening av kjemiske forbindelser ved hjelp sebrafisk embryo er rask påvisning av kjemisk indusert fenotypiske endringer i et helt dyr under embryonale utviklingen i en relevant modell organisme. Ca 70% av protein-koding menneskelige gener har orthologs kolleger i sebrafisk Genova25. Genetiske trasé kontrollere signalet Transduction og utvikling er svært bevart mellom menneske og sebrafisk26, og derfor kjemiske forbindelser er sannsynlig å ha lignende toksiske effekter hos mennesker25.
Sebrafisk er i forkant av toksikologiske undersøkelser og har allerede blitt mye brukt til å oppdage giftstoffer i vann prøver og å studere virkningsmekanismen av miljøgifter og deres virkninger på dyret27. I denne artikkelen viser vi bruken av å utvikle sebrafisk embryo for å evaluere toksisitet av potensielle forbindelser i den tidlige fasen av narkotika funnet. Vår raske og mangesidig toksisitet vurdering er basert på 1) endringer i fenotype av organismen (klekking, otolith SACs, perikard ødem, eggeplomme SAC utnyttelse, notochord utvikling, hjerterytme, svømme blære utvikling, bevegelse) under embryonale utvikling over en periode på 5 dager, og 2) bestemmelse av den dødelige konsentrasjonen (LC50). Rimelige timer med hands-on arbeid (8-10 h fordelt over 8 dager) er nok til å bestemme toksisitet profilen til et sammensatt ved hjelp av denne prosedyren. For nylig syntetisert forbindelser som er tilgjengelige i begrensede mengder, toksisitet kan evalueres ved hjelp av et minimum av 3 mg av sammensatte. Det er ikke nødvendig med spesialutstyr. Prosedyren er dermed en rask og rimelig måte å evaluere toksiske effekter av enhver forbindelse som potensielt kan utvikles inn i stoffet for menneskelig bruk.
Kvaliteten på partiet av embryo har en stor innvirkning på utfallet av eksperimentet. Kvaliteten på egg (inkludert graden av befruktning) er ikke opplagt umiddelbart etter oppsamling fra avl tankene (0-4 hpf). For å få bare normalt utvikle embryo for eksperimentene, før du legger til forbindelser, lar vi embryo å holde seg på 28,5 ° c for 24 timer etter at samlingen fra avl stridsvogner. Etter 24 hpf, noen døde eller usunn utseende embryo kastes. I tillegg til dette, er det tilrådelig å ha en mock-behandlet gruppe av embryo i hvert eksperiment for å ytterligere kontroll for kvaliteten på batch av egg som brukes i eksperimentet, samt å se Baseline dødelighet å nøyaktig bestemme LC50.
En uekte-behandlet gruppe er også nødvendig for å kontrollere for toksisitet av kjøretøyet av valget. Mange kjemikalier er uløselig i vann og DMSO er ofte brukt som redskap for levering av test forbindelser. DMSO er generelt godt tolerert av embryo i lavere (0,1%) konsentrasjonen28. Noen ganger, forbindelsene er ikke helt løselig selv i DMSO og løsningen vises skyet gjør det vanskelig for evalueringen av toksisitet. I slike tilfeller, for å få lagerløsning av sammensatte helt løselig og klar, og legger en dråpe 0,1% NaOH vil løse problemet. Passende kontroll grupper må settes opp for å vurdere toksisitet av sammensatt nøyaktig. Hvis andre kjøretøyer brukes, kan deres iboende toksisitet påvirke eksperimentet.
Hver brønn av en 24-brønn plate inneholder fra 1-10 embryo nedsenket i et samlet volum på 1 mL. Hvis testen sammensatte er bare tilgjengelig i små mengder, kan det være nødvendig å bruke opptil 10 embryo per brønn for å evaluere sin toksisitet. Det anbefales sterkt at bare 1 embryo per brønn skal brukes for hver analyse16,24,29. Platen er lagret ved 28,5 ° c inkubator i 5 dager. Noen ganger betydelig fordampning er observert forårsaker en markert endring i konsentrasjonen av sammensatte i en gitt brønn16. Ved å forsegle 24-brønn plater med parafin filmer fra alle sider, plassere embryo bare i midten brønner og fylle de andre brønnene langs felger med vann, problemene forårsaket av fordampning kan unngås. I våre tidligere studier, det gjorde vi ikke observere noen fordampning av fortynningsmidler av kjemikalier fra 24-brønn plater24,29. Også, hvis sammensatt i spørsmålet er kjent for å være ustabil under omgivelsestemperaturer, vil daglige endringer av vann med fersk sammensatte være nødvendig for pålitelige resultater.
Svømme mønsteret av sebrafisk larver er analysert etter 5 dager av eksponering for sammensatte. Brønnene av en 24-brønn plate som inneholder 5 DPF larver er ikke ideelt for formålet på grunn av den begrensede størrelsen på brønnen. Derfor, for nøyaktig analyse av svømme mønster, larvene må overføres til en Petri parabolen inneholder 50 mL av E3 vann og kan bosette seg i 2 minutter før analysen. I studien vår, viste bare to hemmere effekten på svømme mønster16 blant 52 α-ca og β-ca-hemmere vist for sikkerhet og toksisitet, basert på vår erfaring denne testen kan oppdage subtile endringer, inkludert mild Ataxic bevegelse av larvene.
Denne studien viste at den eneste begrensningen til den aktuelle metoden er fysisk fingerferdighet. Denne bekymringen kan overvinnes gjennom repetisjon, som ferdigheten til en person forbedrer med praksis. Når kompetansen er oppnådd evalueringen av forbindelser ved hjelp sebrafisk embryo er etisk, enkel, effektiv og informativ. Vi forventer derfor at en slik rask analyse ved hjelp av sebrafisk embryo vil bli et populært verktøy for in vivo toksisitet screening i den tidlige fasen av narkotika utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke rapportert om potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av tilskudd fra Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), finsk Cultural Foundation (AA, MH), Academy of Finland (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere tuberkulose Foundation (SP, MH og MP) og Jane og langgong Erkko Foundation (SP og MP ). Vi takker våre italienske og franske samarbeidspartnere, Prof Supuran, og Prof Grønsdal, for å gi Karbons karboanhydrasehemmere hemmere for sikkerhet og toksisitet evaluering for anti-TB og anti-kreft narkotika utvikling formål. Vi takker Aulikki Lehmus og Marianne Kuuslahti for teknisk assistanse. Vi takker også Leena Mäkinen og Hannaleena utslått for deres hjelp med sebrafisk avl og samling av embryo. Vi oppriktig takker Harlan Barker for kritisk vurdering av manuskriptet og innsiktsfulle kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
