Summary
Zebrafish embryoner anvendes til at evaluere toksiciteten af kemiske forbindelser. De udvikler sig eksternt og er følsomme over for kemikalier, hvilket gør det muligt at påvise subtile fænotypiske forandringer. Eksperimentet kræver kun en lille mængde af sammensatte, som er direkte føjet til pladen, der indeholder embryoner, hvilket gør testsystemet effektivt og omkostningseffektivt.
Abstract
Den Zebra er en udbredte hvirveldyr model organisme for sygdommen og fænotype-baserede Drug Discovery. Den Zebra genererer mange afkom, har gennemsigtige embryoner og hurtig ekstern udvikling. Zebrafish-embryoner kan derfor også anvendes til hurtig vurdering af toksiciteten af de lægemidler, der er dyrebare og tilgængelige i små mængder. I denne artikel beskrives en metode til effektiv screening af toksiciteten af kemiske forbindelser, der anvender 1-5-dages efter befrugtnings embryoner. Embryonerne overvåges af stereomicroskop for at undersøge de fænotypiske defekter, der forårsages af eksponeringen for forskellige koncentrationer af forbindelser. Halv-maximale dødelige koncentrationer (LC50) af forbindelserne bestemmes også. Den nuværende undersøgelse krævede 3-6 mg af en inhibitor sammensatte, og hele eksperimentet tager omkring 8-10 h, der skal udfyldes af en person i et laboratorium, der har grundlæggende faciliteter. Den nuværende protokol er egnet til at teste enhver forbindelse til at identificere uacceptable toksiske eller off-Target effekter af forbindelsen i den tidlige fase af Drug Discovery og til at opdage subtile toksiske virkninger, der kan blive savnet i cellekulturen eller andre dyremodeller. Metoden mindsker procedure forsinkelser og omkostninger til narkotika udvikling.
Introduction
Narkotika udvikling er en kostbar proces. Før en enkelt kemisk forbindelse er godkendt af Food and Drug Administration (FDA) og det Europæiske Lægemiddelagentur (EMA) flere tusinde forbindelser screenes til en pris på over 1.000.000.000 dollars1. Under den prækliniske udvikling, den største del af denne omkostning er nødvendig for dyreforsøg2. For at begrænse omkostningerne har forskere inden for narkotika udvikling brug for alternative modeller til sikkerhedsscreening af kemiske forbindelser3. Derfor, i den tidlige fase af lægemiddel udviklingen, ville det være meget gavnligt at bruge en metode, der hurtigt kan evaluere sikkerheden og toksiciteten af forbindelserne i en passende model. Der er flere protokoller, der er blevet anvendt til toksicitets screening af kemiske forbindelser, der involverer dyre-og cellekultur modeller, men der er ikke en enkelt protokol, som er valideret og er til fælles brug4,5. Eksisterende protokoller med Zebra varierer i længden og er blevet brugt af individuelle forskere, der vurderede toksiciteten som pr deres bekvemmelighed krav6,7,8,9, 10 , 11 , 12.
I den seneste fortid, zebra er dukket op som en bekvem model for vurdering af toksiciteten af kemiske forbindelser under embryonale udvikling6,7. Zebra har mange indbyggede fordele til vurdering af kemiske forbindelser13. Selv store eksperimenter er modtagelige, som en zebra kvinde kan lægge partier af 200-300 æg, som udvikler sig hurtigt ex vivo, behøver ikke ekstern fodring i op til en uge og er gennemsigtige. Forbindelserne kan tilsættes direkte i vandet, hvor de kan (afhængigt af arten af den sammensatte) diffus gennem chorion, og efter klækning, gennem huden, gæller og mund af larver. Forsøgene kræver ikke rigelige mængder af kemiske forbindelser14 på grund af den lille størrelse af embryonet. Udvikle Zebra embryoner udtrykker de fleste af de proteiner, der kræves for at opnå det normale udviklingsmæssige resultat. Derfor er en zebra embryo en følsom model til at vurdere, om et potentielt lægemiddel kan forstyrre funktionen af et protein eller signalerings molekyle, der er udviklingsmæssigt signifikant. De organer af Zebra bliver funktionelle mellem 2-5 DPF15, og forbindelser, der er giftige i denne følsomme periode af embryonale udvikling inducerer fænotypiske defekter i Zebra larver. Disse fænotypiske ændringer kan let påvises ved hjælp af et simpelt mikroskop uden invasive teknikker11. Zebrafish embryoner er meget udbredt i toksikologisk forskning på grund af deres langt større biologisk kompleksitet i forhold til in vitro Drug screening ved hjælp af cellekultur modeller16,17. Som et hvirveldyr er den genetiske og fysiologiske makeup af Zebra sammenlignelig med mennesker, og derfor er toksiciteter af kemiske forbindelser ens mellem Zebra og mennesker8,18,19, 20 , 21 , 22. zebrafish er således et værdifuldt redskab i den tidlige fase af lægemiddel opdagelsen til vurdering af de kemiske forbindelsers Toksicitet og sikkerhed.
I denne artikel giver vi en detaljeret beskrivelse af den metode, der anvendes til at evaluere sikkerheden og toksiciteten af carbonanhydrase (ca)-hæmmer forbindelser ved hjælp af 1-5-dag efter befrugtning (DPF) Zebra embryoner af en enkelt forsker. Protokollen indebærer at udsætte Zebra-embryoner for forskellige koncentrationer af kemiske inhibitor forbindelser og studere dødelighed og fænotypiske forandringer under fosterudviklingen. Ved afslutningen af eksponeringen for de kemiske forbindelser bestemmes LC50 dosis af kemikaliet. Metoden gør det muligt for en person at udføre effektiv screening af 1-5 test forbindelser og tager omkring 8-10 h afhængigt af oplevelsen af den person med metoden (figur 1). Hvert af de skridt, der kræves for at vurdere toksiciteten af forbindelserne er skitseret i figur 2. Vurderingen af toksicitet af CA-hæmmere kræver 8 dage, og omfatter opsætning af parring par (dag 1); opsamling af embryoner fra avls tanke, rengøring og overførsel til 28,5 °C inkubator (dag 2); fordeling af embryonerne i brøndene på en 24-brønd plade og tilsætning af fortyndede CA-inhibitor forbindelser (dag 3); fænotypisk analyse og billeddannelse af larver (dag 4-8) og bestemmelse af LC50 dosis (day8). Denne metode er hurtig og effektiv, kræver en lille mængde af den kemiske forbindelse og kun grundlæggende faciliteter på laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra Core Facility på Tampere University har en autorisation for virksomheder, der er udstedt af det nationale dyreeksperiment nævn (esavi/7975/04.10.05/2016). Alle eksperimenter med Zebra embryoner blev udført i henhold til provinsregeringen i det østlige Finland, social-og Sundhedsministeriet i Tampere regional service Unit Protocol # lslh-2007-7254/YM-23.
1. opsætning af natten over Zebrafish Mating tanks
- Placer 2-5 voksne mandlige Zebra og 3-5 voksne kvindelige Zebra i parring tanke natten over. (Avl induceres om morgenen ved automatisk mørk og lys cyklus natten over).
- Oprette flere Kors for at opnå nok embryoner til at vurdere toksiciteten af mere end to kemiske forbindelser. Til vurdering af toksicitet, hver koncentration har brug for mindst 20 embryoner23.
- For at undgå at håndtere stress for dyrene, tillade dyrene at hvile i 2 uger før du bruger de samme individer til avl.
2. indsamling af embryoner og tilberedning af plader til udsættelse for kemiske forbindelser
- Saml embryonerne, den næste dag før middagstid, ved hjælp af en finmasket si og overfør dem til en Petri skål indeholdende E3 embryo medium [5,0 mm NaCl, 0,17 mm KCl, 0,33 mm CaCl2, 0,33 mm mgso4og 0,1% w/v methylenblåt].
- Fjern snavs ved hjælp af en plastik-pipette (f. eks. mad og fast affald). Undersøg hvert parti af embryoner under stereomicroskop for at fjerne de ubefrugtede/døde embryoner (identificeret ved deres uigennemsigtige udseende).
- Opbevar embryonerne ved 28,5 °C i en inkubator. Undersøg embryonerne, næste morgen, under et stereomicroskop, og fjern eventuelle usunde eller døde embryoner. Udskift også det gamle E3 medium med Fresh E3 medium.
Bemærk: zebrafish-embryoner opretholdes altid ved 28,5 °c under laboratorieforhold. - Overfør forsigtigt 1 embryo til hver brønd af en 24-brønd plade, der indeholder nok E3 medium til at dække embryonerne.
3. præparater af stamopløsningen af kemiske forbindelser og distribution af fortyndet forbindelse til brøndene
- Tag hætteglassene indeholdende inhibitor forbindelser, der opbevares ved 4 °C, ud.
Bemærk: afhængigt af egenskaberne af sammensat, disse er lagret ved forskellige temperaturer. - Vejning af sammensat (e) ved hjælp af en analytisk balance, der kan veje et par milligram (mg) af sammensat nøjagtigt.
- Mindst 250 μL (100 mM) af stamopløsningen fremstilles for hver forbindelse i et passende opløsningsmiddel (f. eks. E3 vand eller dimethylsulfoxid (DMSO), baseret på forbindelsens opløseligheds egenskaber.
Bemærk: ovenstående trin kan udføres en dag før starten af eksperimentet på et belejligt tidspunkt og opbevares ved 4 °c). - Foretag seriefortyndinger af stamopløsninger (f. eks., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM og 500 μM) med E3 vand i 15 mL centrifugeglas.
Bemærk: koncentrationerne og antallet af serielle fortyndinger varierer fra den ene forbindelse til den anden sammensatte afhængig af deres toksicitetsniveau. - Fra 24-brønd pladen, der indeholder embryoner, fjernes E3 vand fra brøndene ved hjælp af en Pasteur-pipette og en 1 mL pipette (indeholdende 1 DPF-embryoner) én række ad gangen.
- 1 mL af hver fortyndingsvæske fordeles i hver brønd (startende fra lavere og flytter til højere koncentration) ind i brøndene på 24-brønd pladen.
- Konfigurer en kontrolgruppe ud fra samme batch af embryoner, og tilsæt den tilsvarende mængde fortyndingsvæske.
- Etiket 24-brønd plader med stoffets navn og koncentration og opbevar pladerne ved 28,5 °C i en inkubator.
4. fænotypisk analyse og billeddannelse af embryonerne ved hjælp af et Stereomicroskop
- Undersøg embryonerne under et stereomicroskop for parametre 24 h efter eksponering for de kemiske forbindelser.
- Bemærk parametre såsom dødelighed, klækning, hjerteslag, udnyttelse af æggeblomme sæk, svømme blære udvikling, bevægelse af fisken, perikardiødem, og formen af kroppen23.
- Tag larverne udsat for hver koncentration af stoffet og lægge dem sidelæns i en lille Petri skål indeholdende 3% højmolekyl vægt methylcellulose ved hjælp af en metal sonde.
Bemærk: 3% methylcellulose (høj Molekylær med) er en viskøs væske, der er nødvendig for at indlejre fisken med en nødvendig retning for mikroskopisk undersøgelse. For at orientere fiskene i denne væske, en metal sonde er nødvendig. - Tag billederne ved hjælp af stereomikroskopet, der er fastgjort til et kamera. Gem billederne i en separat mappe hver dag indtil slutningen af eksperimentet.
- Indtast alle observationer i en tabel hver dag enten i en online tabel eller på et udskrevet ark.
- Hvis forbindelserne er neurotoksiske, kan 4 til 5 DPF larver vise ændret svømme mønster, lave en fortegnelse over sådanne ændringer enten ved at fange en kort (30 s til 1 min) video af larverne udviser unormal bevægelsesmønster.
- Efter 5 dages udsættelse for de kemiske forbindelser, Bemærk den koncentration, hvor halvdelen af embryonerne dør til beregning af den halve maksimale letale koncentration 50 (LC50) af hvert kemikalie.
Bemærk: LC50 er den koncentration, hvormed 50% af embryonerne dør i slutningen af 5 dage efter udsættelse for en kemisk forbindelse. Brug mindst 20 embryoner til afprøvning af toksiciteten af hver koncentration af en forbindelse23. - Konstruere en kurve for dødelighed af embryoner for alle koncentrationer ved hjælp af et egnet program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kritiske del af vurderingen af toksicitet er afprøvning af forskellige koncentrationer af en eller flere kemiske forbindelser i et enkelt eksperiment. I begyndelsen skal du vælge de forbindelser til evaluering af toksicitet, antallet af koncentrationer til at teste for hver forbindelse, og derfor gøre et diagram (figur 3). Vi brugte en unik farve for hver forbindelse til at organisere prøverne (figur 3). Brugen af solvent resistente markør og mærkning i bunden eller siderne af pladerne er vigtigt at undgå mix-up senere. Hvis forbindelserne fremkalder eventuelle fænotypiske defekter i larverne, der er eksponeret for forskellige koncentrationer af inhibitorer, registreres fejlene hver 24 h i perioden 1-5 DPF (figur 4a, B, C, D). De embryoner, der blev behandlet med en kendt CA IX-hæmmer i en koncentration på 500 μM, viste ingen tilsyneladende fænotypiske ændringer i 1-5 dage efter eksponeringen for den kemiske forbindelse (figur 4b). Figur 4c og figur 4d viser embryonerne behandlet med β-ca-hæmmere, der inducerede forskellige fænotypiske defekter udklækkede embryoner selv på dag 3 (pilehoved), buet kropsstruktur (pil), uudnyttet æggeblomme sæk og perikardialødem (pilehoved) og fravær af Otolith-sække i larverne i 5 dage efter behandling med kemisk forbindelse (pil). I en anden undersøgelse viser embryonerne behandlet med ca-hæmmer (figur 4e) fraværet af Otolith-sække og svømme blære (pilehoveder). I vores undersøgelse (figur 4c, D) dokumenterede vi fænotypiske defekter (skrøbelige embryoner og fravær af pigmentering) selv efter dag 1 for eksponering for ca-hæmmere. De fænotypiske analyser viste, at nogle af inhibitor forbindelserne er dødelige og ikke kan udvikles som lægemidler til human brug (figur 4c, D og tabel 1).
Forsøgene identificerede en repræsentativ forbindelse, som inducerede minimal eller ingen fænotypiske ændringer under fosterudviklingen og viste en høj LC50 dosis (figur 5), hvilket tyder på, at forbindelsen er sikker for yderligere karakterisering og potentielt kan udvikles til et stof kandidat til human brug16. Ser man på stillbilleder af larver eksponeret for forbindelsen viste ingen fænotypiske defekter (figur 4B). Det blev imidlertid konstateret, at det samme stof var neurotoksisk og inducerede ataksi i larverne efter 5 dages udsættelse for CA-inhibitor (figur 6). Denne fænotype kunne kun påvises ved direkte at observere svømning opførsel af Zebra larver under mikroskopet. Disse undersøgelser tyder på, at neurale udvikling af Zebra larver er følsom over for den sammensatte16,17.
Figur 1: tid i timer, der kræves til hurtig screening af kemiske forbindelser ved hjælp af Zebra-embryoner: I et sæt eksperimenter, en person med hands-on erfaring kan screene omkring 5 kemiske forbindelser (hver forbindelse kræver mindst 6 fortyndinger) ved hjælp af Zebra embryoner i 24-brønd plader. I alt tager det omkring 8-10 h fra oprettelsen af Kors til at udføre LC50 bestemmelse over en periode på 8 dage.
Figur 2: diagram, der viser nedbrydningen af toksicitets vurderingen af kemiske forbindelser. Toksicitet screening af kemiske forbindelser kræver 8 dage og kan opdeles i fem trin. (Dag 1) Består af opsætning af Zebra parring par i tanke. (Dag 2) Involverer indsamling af embryoner fra parring tanke til Petri skåle efterfulgt af at holde dem på en 28,5 °C inkubator for natten. (Dag 3) Undersøgelse af embryoner ved hjælp af et stereomicroskop og rensning af embryonerne. Fordelingen af embryonerne i 24-brønden og tilsætning af fortyndinger af test forbindelserne. (Dag 4-8) Fænotypiske analyser af larver for udviklingsmæssige defekter. Svømning mønster undersøgelse og LC50 bestemmelse blev udført på den sidste dag af udsættelse for forbindelser. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk præsentation af eksperimenter, der er involveret i toksicitets evaluering. Toksicitets evalueringen består i at udarbejde tabeloversigt med oplysninger om kemiske forbindelser, fortyndinger af forbindelserne og de parametre, der skal vurderes. Fortynding af stamopløsninger til de ønskede koncentrationer i 15 mL centrifugeglas (fortynding fra et rør, der skal tilsættes til hver række i 24-brønd pladen). En 24-brønd plademærket med en vandtætte markør med navnet på test forbindelsen, koncentration i hver række og eksponerings dato. Undersøgelse og billeddannelse af embryoner ved at overføre larverne til en lille Petri skål, der indeholder 3% høj molekylvægt methylcellulose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: eksempel på fænotypisk analyse af larverne i de behandlede grupper med kontrol-og test forbindelser. A) fænotypiske analyser af kontrolgruppen larver, der ikke er behandlet med nogen sammensatte, viste ingen fænotypisk defekt under et mikroskop. B) larverne behandlet med 500 μM ca-hæmmer (kendt hæmmer af carbonanhydrase IX viste ingen observerede fænotypiske defekter. (C, D) Larverne behandlet med β-CA-hæmmer med koncentrationer på henholdsvis 250 μΜ og 125 μM. De forbindelser induceret fænotypiske defekter såsom buet krop, perikardiødem, og uudnyttede æggeblomme SAC (pile og pilehoveder). Paneler A og B er blevet modificeret fra aspatwar et al16. Panelerne C, D og E viser tidligere ikke-offentliggjorte billeder, som blev opnået ved hjælp af et andet mikroskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: bestemmelse af dødelig koncentration 50 (LC50) med 1-5 DPF Zebra larver. Toksicitets vurdering ved hjælp af Zebra embryoner giver forskerne mulighed for at bestemme den mindste dødelige koncentration af den kemiske forbindelse ved afslutningen af forsøget. LC50 koncentrationen af forbindelsen (en kendt ca IX-hæmmer) var 3,5 mm. Den høje LC50 koncentration giver mulighed for yderligere karakterisering af forbindelsen. Dette tal er blevet modificeret fra Aspatwar et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: et eksempel på analyse af svømme mønster i både ubehandlet (A) og inhibitor behandlet (B) grupper af larver. Zebra larver behandlet i panel B med 300 μM test inhibitor forbindelse (en kendt hæmmer af humant carbonanhydrase IX) viste et unormalt (ataxic) bevægelsesmønster (pilehoveder), hvilket tyder på, at forbindelsen inducerer neurotoksicitet i udviklings embryonerne . Pilespidser peger på den normale krumning af halen under svømning. I panel A pilene peger på den normale krumning af halen under svømning. Dette tal er blevet modificeret fra Aspatwar et al.16. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| CA-hæmmer | Toksicitets screening | LC50 | In vivo | Giftige CAIs | Reference |
| Carbamater | 24 | Alle | 1a | 3b | 24, ikke offentliggjort |
| Coumariner | 10 | Alle | - | 2 | Upublicerede |
| Nitroimidazoler | 2 | Alle | 2 | 2c | 16 |
| Sulfonamider | 5 | Alle | - | 3 | 25 |
| Samlede | 41 | Alle | 3 | 10 | - |
| en stor På baggrund af toksicitets screeningen blev inhibitorer anvendt til hæmning af Mycobacterium Marinum i Zebra-modellen. b Dødelig inhibitor, cneurotoksisk over 300 μM koncentration | |||||
Tabel 1: et resumé af sikkerheden og toksiciteten af de screenede forbindelser. Toksiciteten evaluering eksperiment hjælper forskeren til at nå frem til en konklusion om sikkerheden af de testede kemiske forbindelser. LC50 koncentrationen gør det muligt at definere sikker koncentration for yderligere karakterisering. En forsker kan beslutte, om forbindelsen er dødelig, selv efter 24 h eksponering af embryoner til den sammensatte under undersøgelse. I vores eksempel er en subtil effekt på svømning på grund af neurotoksicitet de væsentlige oplysninger, som er nyttige for at oprette yderligere eksperimenter. På baggrund af toksicitets screeningen var vi derfor i stand til at anvende sikre koncentrationer af CA-inhibitorer til yderligere karakterisering in vivo24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro toksicitetstest ved hjælp af dyrkede celler kan detektere overlevelse og morfologiske undersøgelser af cellerne, der giver begrænsede oplysninger om toksiciteten induceret af teststoffet. Fordelen ved toksicitets screening af kemiske forbindelser ved hjælp af zebrafiskembryoner er hurtig påvisning af kemisk inducerede fænotypiske forandringer i et helt dyr under fosterudviklingen i en relevant model organisme. Omkring 70% af protein-kodning menneskelige gener har orthologs modparter i Zebra genom25. Genetiske veje, der styrer signaltransduktion og udvikling, er stærkt bevaret mellem menneske og Zebra26, og derfor vil kemiske forbindelser sandsynligvis have lignende toksiske virkninger i mennesker25.
Zebrafish er på forkant med toksikologisk forskning og er allerede blevet flittigt anvendt til at påvise toksiner i vandprøver og til at studere virkningsmekanismen af miljømæssige toksiner og deres virkninger på dyret27. I denne artikel viser vi brugen af at udvikle Zebra embryoner til at evaluere toksiciteten af potentielle forbindelser i den tidlige fase af Drug Discovery. Vores hurtige og mangefacetterede toksicitets vurdering er baseret på 1) ændringer i organismens fænotype (klækning, Otolith SACs, perikardiødem, blomme SAC udnyttelse, notochord udvikling, hjerteslag, svømning blære udvikling, bevægelse) under embryonale udvikling over en periode på 5 dage, og 2) bestemmelse af den dødelige koncentration (LC50). Rimelige timer med hands-on arbejde (8-10 h fordelt over 8 dage) er nok til at bestemme toksiciteten profil af en forbindelse ved hjælp af denne procedure. For nyligt syntetiserede forbindelser, der er tilgængelige i begrænsede mængder, toksicitet kan evalueres ved hjælp af mindst 3 mg af stoffet. Der kræves ikke noget særligt udstyr. Proceduren er således en hurtig og billig måde at evaluere de toksiske virkninger af enhver forbindelse, der potentielt kan udvikles til lægemidlet til human brug.
Kvaliteten af partiet af embryoner har en stor indvirkning på udfaldet af forsøget. Kvaliteten af æg (herunder gødskning) er ikke indlysende umiddelbart efter opsamling fra avls tanke (0-4 HPF). For at opnå kun normalt at udvikle embryoner til forsøgene, før tilsætning af forbindelser, tillader vi, at embryonerne forbliver ved 28,5 °C i 24 timer efter indsamlingen fra avls tankene. Efter 24 HPF kasseres alle døde eller usunde embryoner. Ud over dette, er det tilrådeligt at have en mock-behandlet gruppe af embryoner i hvert eksperiment til yderligere kontrol for kvaliteten af partiet af æg, der anvendes i forsøget, samt at se baseline dødelighed til præcist at bestemme LC50.
En mock-behandlet gruppe er også nødvendig for at kontrollere for toksiciteten af køretøjet af valg. Mange kemikalier er uopløselige i vand og DMSO bruges ofte som køretøjet til levering af test forbindelser. DMSO tolereres generelt godt af embryonerne i lavere (0,1%) koncentrationer28. Nogle gange er forbindelserne ikke helt opløselige selv i DMSO, og opløsningen synes uklar, hvilket gør det vanskeligt for vurderingen af toksiciteten. I sådanne tilfælde, at få stamopløsning af sammensat helt opløselig og klar, tilføje en dråbe på 0,1% NaOH vil løse problemet. Der skal oprettes passende kontrolgrupper til vurdering af stoffets toksicitet nøjagtigt. Hvis der anvendes andre køretøjer, kan deres iboende toksicitet påvirke forsøget.
Hver brønd af en 24-brønd plade indeholder fra 1-10 embryoner nedsænket i et samlet volumen på 1 mL. Hvis teststoffet kun er tilgængeligt i små mængder, kan det være nødvendigt at anvende op til 10 embryoner pr. brønd til vurdering af toksiciteten. Det anbefales stærkt, at kun 1 embryo pr brønd skal anvendes til hver analyse16,24,29. Pladen opbevares ved 28,5 °C inkubator i 5 dage. Sommetider signifikant fordampning observeres forårsager en markant ændring i koncentrationen af forbindelsen i en given brønd16. Ved forsegling af 24-brønden plader med paraffin film fra alle sider, placere embryoner kun i midten brønde og fylde de andre brønde langs fælge med vand, kan de problemer, der forårsages af fordampning undgås. I vores tidligere undersøgelser, vi ikke observere nogen fordampning af fortyndingsmidler af kemikalierne fra 24-brønd plader24,29. Også, hvis den pågældende forbindelse er kendt for at være ustabil under omgivende temperaturer, daglige ændringer af vand med friske sammensatte vil være nødvendige for pålidelige resultater.
Svømme mønstret af Zebra larver analyseres efter de 5 dages udsættelse for forbindelsen. Brøndene af en 24-brønd plade indeholdende 5 DPF larver er ikke ideelle til formålet på grund af den begrænsede størrelse af brønden. For nøjagtig analyse af svømme mønsteret skal larverne derfor overføres til en Petri skål, der indeholder 50 mL E3 vand og kan bosætte sig i 2 minutter før analysen. I vores undersøgelse viste kun to hæmmere effekten på svømme mønsteret16 blandt de 52 α-ca-og β-ca-hæmmere, som blev screenet for sikkerhed og toksicitet, baseret på vores erfaring denne test kan detektere subtile ændringer, herunder mild ataxic bevægelse af larverne.
Denne undersøgelse viste, at den eneste begrænsning til den nuværende metode er fysisk fingerfærdighed. Denne bekymring kan overvindes ved gentagelse, da en persons dygtighed forbedres med praksis. Når den ekspertise er opnået evaluering af forbindelser ved hjælp af Zebra embryoner er etisk, let, effektiv og informativ. Vi forventer derfor, at en sådan hurtig analyse ved hjælp af Zebra-embryoner bliver et populært værktøj til in vivo -toksicitets screening i den tidlige fase af lægemiddel udviklingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne rapporterede ikke om potentielle interessekonflikter.
Acknowledgments
Arbejdet blev støttet af tilskud fra Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), finsk kulturfond (AA, MH), Finlands Akademi (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tampere tuberkulose Foundation (SP, MH og MP) og Jane og Aatos Erkko Foundation (SP og MP ). Vi takker vores italienske og franske samarbejdspartnere, Prof. Supuran, og Prof. Winum, for at levere carbonanhydrasehæmmere for sikkerhed og toksicitet evaluering for anti-TB og anti-cancer Drug udvikling formål. Vi takker Aulikki Lehmus og Marianne Kuuslahti for den tekniske bistand. Vi takker også Leena Mäkinen og hannaleena piippo for deres hjælp med Zebra avl og indsamling af embryoner. Vi oprigtigt takke Harlan Barker for kritisk evaluering af manuskriptet og indsigtsfulde kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
