Summary
ゼブラフィッシュ胚は、化学化合物の毒性を評価するために使用されます。それらは外部で発達し、化学物質に敏感であり、微妙な形知らずの変化の検出を可能にする。実験は少量の化合物しか必要としないが、これは胚を含むプレートに直接添加され、試験システムを効率的かつ費用対効果の高い方法にする。
Abstract
ゼブラフィッシュは、疾患および表現型ベースの創薬のために広く使用されている脊椎動物モデル生物である。ゼブラフィッシュは、多くの子孫を生成し、透明な胚と迅速な外部発達を有する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、貴重で少量で入手可能な薬物の毒性の迅速な評価にも使用することができる。本記事では、1〜5日後受精胚を用いて化学化合物の毒性を効率的にスクリーニングする方法について説明する。胚は、化合物の異なる濃度への暴露によって引き起こされる見型学的欠陥を調査するために、立体顕微鏡によって監視されます。化合物の半分最大致死濃度(LC50)も決定される。本研究では、阻害剤化合物の3〜6mgを必要とし、実験全体は、基本的な設備を有する実験室の個人が完了するのに約8〜10時間かかります。現在のプロトコルは、創薬の初期段階で化合物の耐えうない毒性またはオフターゲット効果を識別し、細胞培養または他の動物モデルで見逃される可能性のある微妙な毒性効果を検出するために、任意の化合物をテストするのに適しています。この方法は、手続き上の遅延と薬剤開発のコストを削減します。
Introduction
医薬品開発は高価なプロセスです。単一の化学化合物が食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認される前に、数千の化合物が10億ドル以上の費用でスクリーニングされます1.前臨床開発の間、この費用の最も大きい部分は動物実験2のために要求される。コストを制限するために、医薬品開発の分野の研究者は、化学化合物3の安全性スクリーニングのための代替モデルを必要とします。したがって、薬剤開発の初期段階では、適切なモデルにおける化合物の安全性および毒性を迅速に評価できる方法を用いることは非常に有益であろう。動物および細胞培養モデルを含む化学化合物の毒性スクリーニングに使用されているいくつかのプロトコルがありますが、検証され、一般的に使用される単一のプロトコルはありません 4,5.ゼブラフィッシュを使用する既存のプロトコルは、長さが異なり、利便性要件6、7、8、9、および、その利便性要件に従って毒性を評価した個々の研究者によって使用されています。10歳,11歳,12.
最近では、ゼブラフィッシュは、胚発生時の化学化合物の毒性の評価のための便利なモデルとして浮上している 6,7.ゼブラフィッシュは、化学化合物13の評価のための多くの内蔵の利点を有する。ゼブラフィッシュメスは、急速にex vivoを開発し、200〜300個の卵のバッチを産むことができるので、大規模な実験でさえ、1週間まで外部摂食を必要とせず、透明である。化合物は、彼らが(化合物の性質に応じて)絨皮を通して拡散することができ、そして孵化後、皮膚、エラおよび幼虫の口を通して、水に直接添加することができる。実験は、胚の小さなサイズのために大量の化学化合物14を必要としない。ゼブラフィッシュ胚の開発は、正常な発達結果を達成するために必要なタンパク質のほとんどを発現する。したがって、ゼブラフィッシュ胚は、潜在的な薬物が発達的に重要なタンパク質またはシグナル伝達分子の機能を妨げることができるかどうかを評価する敏感なモデルである。ゼブラフィッシュの器官は2-5 dpf15の間で機能し、胚発生のこの敏感な期間中に有毒である化合物は、ゼブラフィッシュ幼虫のフェノティピック欠陥を誘発する。これらの型分法の変化は、侵襲的な技術を用いずに単純な顕微鏡を用いて容易に検出することができる11.ゼブラフィッシュ胚は、細胞培養モデル16,17を用いてインビトロ薬物スクリーニングに比べて生物学的複雑性が非常に大きいため、毒物学的研究に広く使用されている。 脊椎動物として、ゼブラフィッシュの遺伝的および生理学的構成はヒトに匹敵し、したがって化学化合物の毒性はゼブラフィッシュとヒト8、18、19の間で類似している。20歳,21歳,22.ゼブラフィッシュは、したがって、化学化合物の毒性および安全性の評価のための創薬の初期段階における貴重なツールである。
本稿では、1~5日間の受精後受精(dpf)ゼブラフィッシュ胚を用いて炭酸アンヒドラーゼ(CA)阻害剤化合物の安全性と毒性を評価するために用いられる方法の詳細な説明を、単一の研究者による。このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚を異なる濃度の化学阻害剤化合物に暴露し、胚発生時の死亡率および先記異動の変化を研究することを含む。化学化合物への曝露の終わりに、化学物質のLC50用量が決定される。この方法は、個人が1〜5の試験化合物の効率的なスクリーニングを行うことを可能にし、方法を持つ人の経験に応じて約8〜10時間かかります(図1)。化合物の毒性を評価するために必要な各ステップは、図2に概説されています。CA阻害剤の毒性の評価は8日を必要とし、交配ペアの設定を含む(1日目)。繁殖タンクから胚のコレクション, 洗浄し、28.5 °Cインキュベーターに転送 (2 日目);24ウェルプレートのウェルへの胚の分布と希釈されたCA阻害剤化合物の添加(3日目)。幼虫のフェ記視分析および画像化(4~8日目)、およびLC50用量(day8)の決定。 この方法は、迅速かつ効率的であり、少量の化学化合物と実験室の基本的な設備のみを必要とする。
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Protocol
タンペレ大学のゼブラフィッシュコア施設は、国立動物実験委員会(ESAVI/7975/04.10.05/2016)によって認可された設立許可を受けています。ゼブラフィッシュ胚を用いたすべての実験は、東フィンランド州政府、タンペレ地域サービスユニットプロトコル#LSLH-2007-7254/Ym-23の社会保健省に従って行われた。
1. 一晩ゼブラフィッシュ交配タンクのセットアップ
- 2-5成人の雄ゼブラフィッシュと3-5大人の雌のゼブラフィッシュを一晩交配タンクに入れます。(繁殖は一晩自動暗いと光サイクルによって午前中に誘発されます)
- 2つ以上の化学化合物の毒性を評価するのに十分な胚を得るためにいくつかの十字架を設定します。毒性の評価のために、各濃度は20個の胚23以上を必要とする。
- 動物へのストレスを処理しないようにするには、動物が繁殖のために同じ個体を使用する前に2週間休息できるようにします。
2. 化学化合物への曝露のための胚の採取とプレートの準備
- 胚を収集し、翌日の正午前に、微細メッシュストレーナーを使用して、E3胚培地[5.0 mM NaCl,0.17 mM KCl,0.33 mM CaCl 2,0.33 mM MgSO4、および0.1%w/vメチレンブルー]を含むペトリ皿に移します。
- プラスチック製のパスツールピペット(食品や固形廃棄物など)を使用して破片を除去します。立体顕微鏡下の胚の各バッチを調べて、未受精/死んだ胚(不透明な外観によって識別される)を除去する。
- 胚をインキュベーターで28.5 °Cに保ちます。翌朝、立体顕微鏡下で胚を調べ、不健康または死んだ胚を取り除く。また、古いE3培地を新鮮なE3培地に置き換えます。
注:ゼブラフィッシュ胚は、実験室の条件下で常に28.5 °Cで維持されています。 - 胚を覆うのに十分なE3培地を含む24ウェルプレートの各ウェルに1個の胚を慎重に移します。
3. 化学化合物のストック溶液の調製と希釈化合物の井戸への分布
- 4°Cに保存した阻害剤化合物を含有するバイアルを取り出す。
注:化合物の特性に応じて、これらは異なる温度で格納されます。 - 化合物の数ミリグラム(mg)を正確に重量を量ることができる分析バランスを使用して化合物を重量を量る。
- 化合物の溶解性特性に基づいて、適切な溶媒(例えば、E3水またはジメチルスルホキシド(DMSO))内の各化合物に対して少なくとも250 μL(100mM)のストック溶液を調出す。
注:上記の手順は、便利な時間に実験開始の前日に行うことができ、4 °Cで保存することができます。 - 15 mL遠心管でE3水を使用して、ストック溶液のシリアル希釈(例えば、10 μM、20 μM、50 μM、100 μM、150 μM、300 μM、500 μM)を作ります。
注:連続希釈の濃度と数は、その毒性レベルに応じて、ある化合物から別の化合物に異なります。 - 胚を含む24のウェルプレートから、パストゥールピペットと1 mLピペット(1dpf胚を含む)を使用して井戸からE3水を一列に取り除きます。
- 各ウェルに各希釈剤の1 mLを分配し(低くからより高い濃度に移動する)24ウェルプレートのウェルに分配します。
- 胚の同じバッチから対照群を設定し、対応する希釈剤量を追加します。
- 化合物の名前と濃度を持つ24ウェルプレートにラベルを付け、インキュベーターで28.5 °Cのプレートを保ちます。
4. 立体顕微鏡を用いた胚の型分分析とイメージング
- 化学化合物に曝露した後、24時間のパラメータを立体顕微鏡下で調べます。
- 死亡率、孵化、心拍、黄身袋の利用、水泳膀胱発達、魚の動き、心膜水腫、および体の形状23などのパラメータに注意してください。
- 化合物の各濃度にさらされた幼虫を取り、金属プローブを使用して3%高分子量メチルセルロースを含む小さなペトリ皿に横に置きます。
注:3%メチルセルロース(高分子)は、顕微鏡検査に必要な向きで魚を埋め込むのに必要な粘性液体です。この液体の魚の向きのために、金属の調査は必要とされる。 - カメラに取り付けた立体顕微鏡を使用して画像を撮影します。実験が終わるまで、毎日別々のフォルダに画像を保存します。
- オンライン テーブルまたは印刷シートに、毎日テーブルにすべての観測値を入力します。
- 化合物が神経毒性である場合、4~5dpf幼虫は、変化した泳ぎパターンを示し、異常な運動パターンを示す幼虫の短い(30~1分)ビデオを捕捉することによって、そのような変化を記録する。
- 化学化合物への暴露の5日後、各化学物質の半分の最大致死濃度50(LC50)を計算するために胚の半分が死ぬ濃度に注意してください。
注:LC50は、胚の50%が化学化合物への曝露の5日の終わりに死ぬ濃度である。化合物23の各濃度の毒性をテストするために、少なくとも20個の胚を使用する。 - 適切なプログラムを使用して、すべての濃度の胚の死亡率のための曲線を構築します。
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Representative Results
毒性の評価の重要な部分は、単一の実験で1つまたは複数の化学化合物の異なる濃度をテストすることです。最初に、毒性の評価のための化合物を選択し、各化合物についてテストする濃度の数、およびそれに応じて、チャートを作成します(図3)。各化合物に固有の色を使用してサンプルを整理しました(図3)。溶剤耐性マーカーの使用とプレートの底部または側面の標識は、後で混同を避けるために重要です。 化合物が異なる濃度の阻害剤にさらされた幼虫の形性欠損を誘発する場合、欠陥は1〜5 dpf(図4A、B、C、D)の期間にわたって24時間ごとに記録される。500μMの濃度で既知のCA IX阻害剤で処理された胚は、化学化合物への曝露の1〜5日間における明らかな型形変化を示さなかった(図4B)。図4Cと図4Dは、3日目でも様々な形分性欠損を誘発したβ-CA阻害剤で処理した胚(矢印頭部)、湾曲した体構造(矢印)、未利用の黄身袋および心膜性眼腫(矢印頭部)を示す。化学化合物(矢印)で処理した後5日目に幼虫にオトリス嚢が存在しない。別の研究では、CA阻害剤(図4E)で処理された胚は、オトリス嚢および水泳膀胱(矢印頭部)の不在を示す。我々の研究(図4C,D)では、CA阻害剤への曝露の1日目以降も、型表欠損(壊れやすい胚および色素沈着の欠如)を文書化した。表現型分析は、阻害剤化合物の一部が致死的であり、ヒト用の薬剤として開発できないことを示した(図4C、Dおよび表1)。
実験は、胚発生時に最小または無同性変化を誘導する代表的な化合物を同定し、高いLC50用量を示した(図5)。潜在的に人間の使用のための薬物候補に開発することができます16.化合物にさらされた幼虫の静止画を見ると、見状欠損は見られなかった(図4B)。しかし、CA阻害剤への曝露の5日後に幼虫に神経毒性および誘導運動失調性であることが判明した(図6)。この表現型は、ゼブラフィッシュ幼虫の水泳行動を顕微鏡下で直接観察することによってのみ検出することができた。これらの研究は、ゼブラフィッシュ幼虫の神経発達が化合物16,17に敏感であることを示唆した。
図1:ゼブラフィッシュ胚を用いて化学化合物を迅速にスクリーニングするのに必要な時間数:1組の実験では、実践的な経験を持つ人は、24ウェルプレートのゼブラフィッシュ胚を使用して、約5つの化学化合物(各化合物は、最低6希釈を必要とする)をスクリーニングすることができます。合計で、十字架の設定から8日間のLC50判定を行うのに約8〜10時間かかります。
図2:化学化合物の毒性評価の内訳を示す図。化学化合物の毒性スクリーニングは8日を必要とし、5つのステップに分けることができます。(1日目)タンク内のゼブラフィッシュ交配ペアの設定で構成されています。(2日目)交配タンクからペトリ皿に胚を集め、その後、一晩28.5°Cのインキュベーターでそれらを維持することを含みます。(3日目)立体顕微鏡を用いて胚を検査し、胚を洗浄する。胚を24ウェルプレートに分布させ、試験化合物の希釈を加える。(4日目~8日目)発達欠陥に対する幼虫の毛虫のフェトピピック分析水泳パターン研究及びLC50判定は、化合物への曝露最終日に行った。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:毒性評価に関わる実験の概略表示毒性評価は、化学化合物に関する情報、化合物の希釈および評価されるパラメータを含む表化チャートを作成して構成される。15 mL遠心管(24ウェルプレートの各行に追加される1つのチューブからの希釈)で所望の濃度にストック溶液の希釈を行います。試験化合物の名前、各行の濃度、および暴露日を持つ防水マーカーでマークされた24ウェルプレート。幼虫を3%高分子量メチルセルロースを含む小さなペトリ皿に移すことによって胚の検査とイメージング。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:コントロールおよび試験化合物処理群における幼虫の見型分析の例。(A)いずれの化合物で処理されなかった対照群幼虫の毛虫のフェノチピック分析は、顕微鏡下での見型欠損を示さなかった。(B)500μM CA阻害剤で処理した幼虫(炭酸アンヒドラーゼIXの公知の阻害剤は、観察可能なフェノティピック欠陥を示さなかった。(C, D)開発中の幼虫をβ-CA阻害剤でそれぞれ250μΜMおよび125μMの濃度で処理した。化合物は、湾曲した体、心膜性うつま、および未利用の黄身嚢(矢印および矢印ヘッド)などの表現型欠損を誘発した。パネルAとBは、アスパトワールら16から変更されています。 パネルC、DおよびEは、異なる顕微鏡を用いて得られた未発表の画像を示す。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:1〜5dpfゼブラフィッシュ幼虫を用いて致死濃度50(LC50)の決定。ゼブラフィッシュ胚を用いて毒性評価を行い、実験終了時に化学化合物の最小致死濃度を決定することができます。 化合物のLC50濃度(公知のCA IX阻害剤)は3.5mMであった。高いLC50濃度は、化合物のさらなる特性評価を可能にする。この図は、Aspatwar et al.16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:未処理(A)および阻害剤(B)群の幼虫群の両方における泳ぎパターン解析の一例。300 μM試験阻害剤化合物(ヒト炭酸アンヒドラーゼIXの公知の阻害剤)でパネルBで処理されたゼブラフィッシュ幼虫は、異常な(アタキシック)運動パターン(矢印ヘッド)を示し、その化合物が現像胚に神経毒性を誘導することを示唆した。.矢印は、水泳中に尾の通常の曲率を指します。パネルAでは、矢印は水泳中に尾の通常の曲率を指します。この図は、Aspatwar et al.16から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| CA阻害剤 | 毒性スクリーニング | LC50 | インビボ | 有毒なCAIs | 参照 |
| カルバメート | 24 | すべての | 1a | 3b | 24、 未公開 |
| クマリンズ | 10 | すべての | - | 2 | 未発表 |
| ニトロイミダゾール | 2 | すべての | 2 | 2c | 16 |
| スルホンアミド | 5 | すべての | - | 3 | 25 |
| 合計 | 41 | すべての | 3 | 10 | - |
| a.毒性スクリーニングに基づいて、阻害剤はゼブラフィッシュモデルにおけるマイコバクテリウム・マリナムの阻害に用いられた。b致死阻害剤、c 神経毒性 300 μM 濃度以上 | |||||
表1:スクリーニングした化合物の安全性及び毒性の概要。毒性評価実験は、研究者が試験された化学化合物の安全性に関する結論に達するのに役立ちます。LC50濃度は、さらなる特性化のための安全な濃度を定義することを可能にする。研究者は、調査中の化合物に胚の暴露の24時間後でも化合物が致命的であるかどうかを決定することができます。この例では、神経毒性による水泳に対する微妙な影響は重要な情報であり、さらなる実験の設定に役立ちます。したがって、毒性スクリーニングに基づいて、生体内24におけるさらなる特徴付けのためにCA阻害剤の安全濃度を用いた。
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Discussion
培養細胞を用いてインビトロ毒性試験は、試験化合物によって誘導される毒性に関する限られた情報を提供する細胞の生存および形態学的研究を検出することができる。ゼブラフィッシュ胚を用いた化学化合物の毒性スクリーニングの利点は、関連するモデル生物における胚発生時の動物全体における化学的に誘発された型分法変化の迅速な検出である。タンパク質コードヒト遺伝子の約70%は、ゼブラフィッシュゲノム25において対応するオルソログを持っている。シグナル伝達および発達を制御する遺伝経路は、ヒトとゼブラフィッシュ26の間で高度に保存され、したがって、化学化合物はヒト25において同様の毒性作用を有する可能性が高い。
ゼブラフィッシュは毒物学的研究の最前線にあり、すでに水サンプル中の毒素を検出し、環境毒素の作用機序と動物27への影響を研究するために広く使用されています。本稿では、創薬の初期段階で潜在的な化合物の毒性を評価するためにゼブラフィッシュ胚を開発する使用を示す。私たちの迅速かつ多面的な毒性評価は、1)胚の間に生物の表現型(孵化、オトリス嚢、心膜浮腫、黄嚢利用、ノトコード発達、心拍、水泳膀胱の発達、動き)の変化に基づいています。5日間の期間にわたって発達し、2)致死濃度(LC50)の決定。実践的な作業の合理的な時間(8-10 hを8日間に分割)は、この手順を使用して化合物の毒性プロファイルを決定するのに十分です。限られた量で利用可能な新たに合成された化合物については、毒性は、化合物の最小3mgを使用して評価することができる。特別な装置は要求しない。この手順は、したがって、人間の使用のための薬物に開発することができる任意の化合物の毒性効果を評価するための迅速かつ低コストの方法です。
胚のバッチの品質は、実験の結果に大きな影響を与えます。卵の品質(受精率を含む)は、繁殖タンク(0-4馬力)からの収集直後には明らかではありません。実験用の胚のみを通常開発するために、化合物を添加する前に、胚が繁殖槽からの採取後24時間28.5°Cにとどまることを可能にする。24馬力の後、死んでいるか不健康に見える胚は捨てられる。これに加えて、実験で使用される卵のバッチの品質をさらに制御し、LC50を正確に決定するためにベースライン死亡率を見るために、各実験で模擬処理された胚群を持つことをお勧めします。
模擬処理されたグループはまた選択した車の毒性のために制御するために必要とされる。多くの化学物質は水中に不溶性であり、DMSOは試験化合物の送達のための手段としてしばしば使用される。DMSOは、一般的に低い(0.1%)の胚によって許容される濃度28.時には、化合物はDMSOでも完全に溶解せず、溶液は曇りのように見え、毒性の評価が困難になります。このような場合、化合物のストック溶液を完全に可溶性かつ明確にするために、0.1%の低下を加えると問題が解決する。化合物の毒性を正確に評価するために適切な対照群を設定する必要があります。他の車両を使用する場合、その固有の毒性が実験に影響を与える可能性があります。
24ウェルプレートの各ウェルは、1mLの総体積に沈んだ1〜10個の胚から含まれています。試験化合物が少量でしか利用できない場合は、その毒性を評価するためにウェルあたり最大10個の胚を使用する必要があるかもしれません。各分析16、24、29に使用するウェルあたり1個の胚のみを使用することを強くお勧めします。プレートは28.5°Cインキュベーターで5日間保存されます。時には有意な蒸発が観察され、与えられたウェル16における化合物の濃度に著しい変化を引き起こす。24ウェルプレートを全面からパラフィンフィルムで密封し、胚を中間ウェルのみに配置し、リムに沿って他の井戸を水で満たすことで、蒸発による問題を回避することができます。我々の以前の研究では、我々は24ウェルプレート24、29からの化学物質の希釈剤の蒸発を観察しませんでした。また、問題の化合物が周囲温度下で不安定であることがわかっている場合、信頼性の高い結果を生み出すためには、新鮮な化合物を含む水の日々の変化が必要になります。
ゼブラフィッシュ幼虫の泳ぎパターンは、化合物への暴露の5日後に分析される。5 dpf幼虫を含む24ウェルプレートの井戸は、井戸の限られたサイズのために目的のために理想的ではありません。したがって、水泳パターンを正確に分析するために、幼虫はE3水の50 mLを含むペトリ皿に移す必要があり、分析の前に2分間沈着することができます。我々の研究では、安全性と毒性のためにスクリーニングされた52のα-CAおよびβ-CA阻害剤の中で泳ぎパターン16に及ぼす影響を示したのは2つの阻害剤のみであり、この試験は幼虫の軽度のアタキシック運動を含む微妙な変化を検出することができる。
この研究は、現在の方法に対する唯一の制限は物理的な器用さであることを実証した。この懸念は、人のスキルが練習で向上するにつれて、繰り返しを通じて克服することができます。専門知識が達成されると、ゼブラフィッシュ胚を使用して化合物の評価は倫理的、簡単、効率的かつ有益です。したがって、ゼブラフィッシュ胚を用いたこのような迅速なアッセイは、薬剤開発の初期段階における生体内毒性スクリーニングの一般的なツールとなることを期待しています。
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Disclosures
潜在的な利益相反は著者によって報告されなかった。
Acknowledgments
この活動は、シグリッド・ジュセリウス財団(SP、MP)、フィンランド文化財団(AA、MH)、フィンランドアカデミー(SP、MP)、オリオン・ファルモス財団(MH)、タンペレ結核財団(SP、MH、MP)、ジェーン・アンド・アトス・エルコ財団(SP、MP)からの助成金によって支援されました。).イタリアとフランスの共同研究者であるスプーラン教授とウィナム教授は、抗結核および抗がん剤開発目的で安全性と毒性評価のための炭酸アンヒドラーゼ阻害剤を提供してくれたことに感謝します。アウリッキ・レムムスとマリアンヌ・クスラフティの技術支援に感謝します。我々はまた、ゼブラフィッシュの繁殖と胚の収集に彼らの助けのためにリーナ・メキネンとハンナリーナ・ピッポに感謝します。私たちは、原稿と洞察力に満ちたコメントの批判的な評価のためにハーラン・バーカーに心から感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
