Summary
Embriões de zebrafish são utilizados para avaliar a toxicidade de compostos químicos. Desenvolvem-se externamente e são sensíveis aos produtos químicos, permitindo a deteção de mudanças fenotípicas sutis. O experimento requer apenas uma pequena quantidade de composto, que é diretamente adicionado à placa contendo embriões, tornando o sistema de teste eficiente e rentável.
Abstract
O zebrafish é um organismo modelo vertebrado extensamente usado para a descoberta da doença e do phenotype-baseado da droga. O zebrafish gera muitos descendentes, tem embriões transparentes e desenvolvimento externo rápido. Os embriões de zebrafish podem, conseqüentemente, ser usados igualmente para a avaliação rápida da toxicidade das drogas que são preciosas e disponíveis em quantidades pequenas. No presente artigo, descreve-se um método para a triagem eficiente da toxicidade de compostos químicos utilizando embriões de adubação pós-fertilização de 1-5 dias. Os embriões são monitorados por estereomicroscópio para investigar os defeitos fenotípicos causados pela exposição a diferentes concentrações de compostos. Concentrações letais semimáximas (LC50) dos compostos também são determinadas. O presente estudo exigiu 3-6 mg de um composto inibidor, e todo o experimento leva cerca de 8-10 h para ser completado por um indivíduo em um laboratório com instalações básicas. O protocolo atual é apropriado para testar todo o composto para identificar efeitos tóxicos ou fora-alvo intolerável do composto na fase adiantada da descoberta da droga e para detectar os efeitos tóxicos sutis que podem ser faltado na cultura de pilha ou em outros modelos animais. O método reduz os atrasos processuais e os custos do desenvolvimento de fármacos.
Introduction
O desenvolvimento de drogas é um processo caro. Antes de um único composto químico é aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) e Agência Europeia de medicamentos (EMA) vários milhares de compostos são rastreados a um custo de mais de 1.000.000.000 dólares1. Durante o desenvolvimento pré-clínico, a maior parte deste custo é necessária para o teste de animais2. Para limitar os custos, os pesquisadores no campo do desenvolvimento de fármacos necessitam de modelos alternativos para a triagem de segurança de compostos químicos3. Portanto, na fase inicial do desenvolvimento da droga, seria muito benéfico usar um método que possa avaliar rapidamente a segurança e a toxicidade dos compostos em um modelo adequado. Existem vários protocolos que têm sido utilizados para a triagem de toxicidade de compostos químicos envolvendo modelos de cultura animal e celular, mas não há um único protocolo que é validado e está em uso comum4,5. Protocolos existentes usando zebrafish variam de comprimento e têm sido utilizados por pesquisadores individuais que avaliaram a toxicidade de acordo com sua exigência de conveniência6,7,8,9, 10 de , 11 anos de , doze anos.
No passado recente, o zebrafish surgiu como um modelo conveniente para a avaliação da toxicidade de compostos químicos durante o desenvolvimento embrionário6,7. O zebrafish tem muitas vantagens incorporadas para a avaliação de compostos químicos13. Mesmo experimentos em grande escala são amenable, como uma fêmea zebrafish pode colocar lotes de 200-300 ovos, que se desenvolvem rapidamente ex vivo, não precisa de alimentação externa para até uma semana e são transparentes. Os compostos podem ser adicionados diretamente na água, onde podem (dependendo da natureza do composto) difusa através do Chorion, e após a eclosão, através da pele, brânquias e boca de larvas. Os experimentos não necessitam de quantidades copiosas de compostos químicos14 devido ao pequeno tamanho do embrião. O desenvolvimento de embriões de zebrafish expressa a maioria das proteínas necessárias para atingir o desfecho normal do desenvolvimento. Portanto, um embrião zebrafish é um modelo sensível para avaliar se um potencial fármaco pode perturbar a função de uma proteína ou molécula de sinalização que é desenvolvimental significativo. Os órgãos do zebrafish tornam-se funcionais entre 2-5 DPF15, e os compostos que são tóxicos durante este período sensível do desenvolvimento embrionário induzem defeitos fenotípicos em larvas do zebrafish. Estas mudanças fenotípicas podem prontamente ser detectadas usando um microscópio simples sem técnicas invasoras11. Os embriões de zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa toxicológica devido à sua complexidade biológica muito maior em comparação com a triagem de fármacos in vitro utilizando modelos de cultura celular16,17. Como um vertebrado, a composição genética e fisiológica de zebrafish é comparável aos seres humanos e, portanto, toxicidades de compostos químicos são semelhantes entre zebrafish e seres humanos8,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22. zebrafish é, portanto, uma ferramenta valiosa na fase inicial de descoberta de drogas para a avaliação da toxicidade e segurança dos compostos químicos.
No presente artigo, fornecemos uma descrição detalhada do método utilizado para avaliar a segurança e a toxicidade de compostos inibidores da anidrase carbônica (CA) usando embriões de zebrafish de 1-5 dias pós-fertilização (DPF) por um único pesquisador. O protocolo envolve expor embriões de zebrafish a diferentes concentrações de compostos inibidores químicos e estudar a mortalidade e as alterações fenotípicas durante o desenvolvimento embrionário. No final da exposição aos compostos químicos, a dose de LC50 do produto químico é determinada. O método permite que um indivíduo realize uma triagem eficiente de 1-5 compostos de teste e leva cerca de 8-10 h, dependendo da experiência da pessoa com o método (Figura 1). Cada uma das etapas necessárias para avaliar a toxicidade dos compostos é descrita na Figura 2. A avaliação da toxicidade dos inibidores da CA requer 8 dias, e inclui a criação de pares de acasalamento (dia 1); recolha de embriões de tanques reprodutores, limpeza e transferência para a incubadora de 28,5 ° c (dia 2); distribuição dos embriões nos poços de uma placa de 24 poços e adição de compostos inibidores de CA diluídos (dia 3); análise fenotípica e imagem de larvas (dia 4-8) e determinação da dose de LC50 (dia8). Este método é rápido e eficiente, requer uma pequena quantidade do composto químico e apenas instalações básicas do laboratório.
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Protocol
A unidade principal da zebrafish na Universidade de Tampere tem uma autorização de estabelecimento concedida pelo Conselho Nacional de experimentação animal (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Todos os experimentos com embriões de zebrafish foram realizados de acordo com o governo provincial da Finlândia Oriental, departamento social e de saúde do protocolo da unidade de serviço regional de Tampere # LSLH-2007-7254/YM-23.
1. criação de tanques de acasalamento zebrafish overnight
- Coloque 2-5 zebrafish masculino adulto e 3-5 zebrafish fêmea adulta em tanques de acasalamento durante a noite. (A reprodução é induzida pela manhã por ciclo automático de luz escura e durante a noite).
- Configurar várias cruzes para obter embriões suficientes para avaliar a toxicidade de mais de dois compostos químicos. Para a avaliação da toxicidade, cada concentração precisa de um mínimo de 20 embriões23.
- Para evitar o manuseio de estresse para os animais, permitir que os animais para descansar por 2 semanas antes de usar os mesmos indivíduos para reprodução.
2. coleta de embriões e preparação de placas para exposição aos compostos químicos
- Recolher os embriões, no dia seguinte antes do meio-dia, usando um filtro de malha fina e transferi-los para uma placa de Petri contendo E3 meio embrião [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4e 0,1% w/v azul de metileno].
- Retire os detritos utilizando uma pipeta plástica Pasteur (por exemplo, alimentos e resíduos sólidos). Examine cada lote de embriões o estereomicroscópio para remover os embriões não fertilizados/mortos (identificados pela sua aparência opaca).
- Mantenha os embriões a 28,5 ° c em uma incubadora. Examine os embriões, na manhã seguinte, um estereomicroscópio e remova quaisquer embriões insalubres ou mortos. Além disso, substitua o antigo meio E3 pelo meio novo E3.
Nota: os embriões de zebrafish são mantidos sempre a 28,5 ° c em condições laboratoriais. - Transfira cuidadosamente 1 embrião para cada poço de uma placa de 24 poços contendo meio E3 suficiente para cobrir os embriões.
3. preparações da solução de estoque de compostos químicos e distribuição de compostos diluídos nos poços
- Tirar os frascos contendo os compostos inibidores armazenados a 4 ° c.
Nota: dependendo das propriedades do composto, estes são armazenados em temperaturas diferentes. - Pesar o composto (s) usando um equilíbrio analítico que pode pesar alguns miligramas (mg) do composto com precisão.
- Prepare pelo menos 250 μL (100 mM) de solução de estoque para cada composto em um solvente apropriado (por exemplo, água E3 ou dimetil sulfóxido (DMSO), com base nas propriedades de solubilidade dos compostos.
Nota: as etapas acima podem ser feitas um dia antes do início do experimento em um momento conveniente e armazenadas a 4 ° c). - Faça diluições seriais das soluções de estoque (por e. g., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM e 500 μM) usando água E3 em tubos de centrífuga de 15 mL.
Nota: as concentrações e o número de diluições seriais variam de um composto para outro composto, dependendo dos seus níveis de toxicidade. - A partir da placa de 24 poços que contém embriões, retire a água E3 das cavidades utilizando uma pipeta Pasteur e uma pipeta de 1 mL (contendo 1 embriões de DPF) uma fileira de cada vez.
- Distribuir 1 mL de cada diluente em cada poço (a partir de menor e movendo-se para maior concentração) para os poços de 24-placa bem.
- Configure um grupo de controle do mesmo lote de embriões e adicione a quantidade correspondente de diluente.
- Rotule 24 placas do poço com o nome e a concentração do composto e mantenha as placas em 28,5 ° c em uma incubadora.
4. análise fenotípica e imagiologia dos embriões utilizando um estereomicroscópio
- Examine os embriões um estereomicroscópio para os parâmetros 24 h após a exposição aos compostos químicos.
- Observe os parâmetros como mortalidade, eclosão, batimento cardíaco, utilização de saco de gema, desenvolvimento da bexiga de natação, movimento dos peixes, edema pericárdico e forma do corpo23.
- Leve as larvas expostas a cada concentração do composto e coloque-as lateralmente em uma pequena placa de Petri contendo 3% de celulose metílico de alto peso molecular usando uma sonda metálica.
Nota: a 3% metil celulose (alta molecular com) é um líquido viscoso necessário para a incorporação dos peixes com uma orientação necessária para o exame microscópico. Para orientar o peixe neste líquido, uma sonda metálica é necessária. - Pegue as imagens usando estereomicroscópio anexado a uma câmera. Salve as imagens em uma pasta separada todos os dias até o final do experimento.
- Insira todas as observações em uma tabela a cada dia em uma tabela on-line ou em uma folha impressa.
- Se os compostos são neurotóxicos, as larvas de 4 a 5 DPF podem mostrar o padrão de natação alterado, fazer um registro de tais alterações, quer através da captura de um curto (30 s a 1 min) vídeo das larvas exibindo padrão de movimento anormal.
- Após 5 dias da exposição aos compostos químicos, anote a concentração em que a metade dos embriões morre calculando a metade da concentração letal máxima 50 (LC50) de cada produto químico.
Nota: o LC50 é a concentração em que 50% dos embriões morrem no final de 5 dias de exposição a um composto químico. Use um mínimo de 20 embriões para testar a toxicidade de cada concentração de um composto23. - Construir uma curva para a mortalidade de embriões para todas as concentrações usando um programa adequado.
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Representative Results
A parte crítica da avaliação da toxicidade é testar diferentes concentrações de um ou vários compostos químicos em um único experimento. No início, selecione os compostos para avaliação da toxicidade, o número de concentrações a testar para cada composto e, consequentemente, faça um gráfico (Figura 3). Utilizamos uma cor única para cada composto para organizar as amostras (Figura 3). O uso do marcador e da rotulagem resistentes solvente na parte inferior ou nos lados das placas é importante evitar a mistura-acima mais tarde. Se os compostos induzem defeitos fenotípicos nas larvas expostas a diferentes concentrações de inibidores, os defeitos são registrados a cada 24 h durante o período de 1-5 DPF (figura 4a, B, C, D). Os embriões tratados com um inibidor conhecido da CA IX na concentração de 500 μM não mostraram alterações fenotípicas aparentes nos 1-5 dias de exposição ao composto químico (Figura 4B). A Figura 4C e a Figura 4D mostram os embriões tratados com inibidores de β-ca que induziu vários defeitos fenotípicos de embriões não eclodificados mesmo no dia 3 (cabeça de flecha), estrutura corporal curvada (seta), saco de gema não utilizado e edema pericárdico (cabeça de seta) e ausência de otólitos SACs nas larvas aos 5 dias após o tratamento com composto químico (seta). Em outro estudo, os embriões tratados com inibidor da CA (Figura 4e) mostram a ausência de sacos de otólitos e bexiga de natação (cabeças de seta). Em nosso estudo, (Figura 4C, D), documentamos defeitos fenotípicos (embriões frágeis e ausência de pigmentação) mesmo após o dia 1 de exposição aos inibidores da CA. As análises fenotípicas mostraram que alguns dos compostos inibidores são letais e não podem ser desenvolvidos como fármacos para uso humano (Figura 4C, D e tabela 1).
Os experimentos identificaram um composto representativo que induziu alterações mínimas ou não fenotípicas durante o desenvolvimento embrionário e mostrou uma alta dose de50 LC (Figura 5), sugerindo que o composto é seguro para maior caracterização e pode ser potencialmente desenvolvido em um candidato a drogas para uso humano16. Observar imagens de larvas expostas ao composto não mostrou defeitos fenotípicos (Figura 4B). Entretanto, o mesmo composto foi encontrado para ser a ataxia neurotóxicos e induzida nas larvas após 5 dias da exposição ao inibidor do CA (Figura 6). Este phenotype podia somente ser detectado diretamente observando o comportamento da natação das larvas do zebrafish o microscópio. Esses estudos sugeriram que o desenvolvimento neural de larvas de zebrafish é sensível ao composto16,17.
Figura 1: tempo em horas necessário para a rápida triagem de compostos químicos utilizando embriões de zebrafish: Em um conjunto de experimentos, uma pessoa com experiência hands-on pode tela cerca de 5 compostos químicos (cada composto que requer um mínimo de 6 diluições) usando embriões de zebrafish em placas de 24 poços. No total, demora cerca de 8-10 h a partir da criação de cruzes para a realização de LC50 determinação ao longo de um período de 8 dias.
Figura 2: gráfico que mostra a degradação da avaliação de toxicidade de compostos químicos. A triagem de toxicidade de compostos químicos requer 8 dias e pode ser dividida em cinco etapas. (Dia 1) Consiste na criação de pares de acasalamento zebrafish em tanques. (Dia 2) Envolve a coleta de embriões dos tanques de acasalamento em placas de Petri seguidos por mantê-los em uma incubadora de 28,5 ° c durante a noite. (Dia 3) Exame de embriões utilizando um estereomicroscópio e limpeza dos embriões. Distribuição dos embriões em placas de 24 poços e adição das diluições dos compostos de teste. (Dia 4-8) Análises fenotípicas de larvas para defeitos desenvolventes. O estudo do teste padrão da nadada e a determinação do LC50 foram executados no último dia da exposição aos compostos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: apresentação esquemática dos experimentos envolvidos na avaliação da toxicidade. A avaliação da toxicidade consiste na elaboração de gráfico tabulado contendo informações sobre compostos químicos, diluições dos compostos e parâmetros a serem avaliados. Fazer a diluição de soluções de estoque para as concentrações desejadas em tubos de centrifugação de 15 mL (a diluição de um tubo a ser adicionado a cada linha da placa de 24 poços). Uma placa de 24 poços marcada com um marcador à prova de água com o nome do composto de teste, a concentração em cada linha e a data de exposição. Exame e imagem de embriões transferindo as larvas para um pequeno prato de Petri contendo 3% de celulose metílico de alto peso molecular. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: exemplo de análise fenotípica das larvas nos grupos Tratado de controle e teste composto. (A) as análises fenotípicas das larvas do grupo controle não tratadas com nenhum composto não mostraram nenhum defeito fenotípico um microscópio. (B) larvas tratadas com inibidor da CA de 500 μm (inibidor conhecido da anidrase CARBONICA IX não mostraram defeitos fenotípicos observáveis. (C, D) As larvas em desenvolvimento tratadas com inibidor de β-CA com concentrações de 250 μΜ e 125 μM respectivamente. Os compostos induziu defeitos fenotípicos tais como o corpo curvado, o edema pericárdico, e o saco de gema não utilizado (setas e cabeças da seta). Os painéis a e B foram modificados a partir de aspatwar et al16. Os painéis C, D e e mostram imagens inéditas, que foram obtidas usando um microscópio diferente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: determinação da concentração letal 50 (LC50) utilizando larvas de zebrafish 1-5 DPF. A avaliação da toxicidade usando embriões de zebrafish permite que os investigadores determinem a concentração letal mínima do composto químico no fim do experimento. A concentração de LC50 do composto (um inibidor conhecido de CA IX) era 3,5 milímetros. A concentração elevada do LC50 permite uma caracterização mais adicional do composto. Este número foi modificado a partir de Aspatwar et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: um exemplo de análise de padrão de natação em grupos de larvas não tratadas (A) e tratadas com inibidores (B). As larvas de zebrafish tratadas no painel B com o composto do inibidor de teste de 300 μm (um inibidor conhecido da anidrase carbônico humana IX) mostraram um teste padrão (ataxic) anormal do movimento (cabeças da seta), sugerindo que o composto induz a neurotoxicidade nos embriões tornando-se . Os setas apontam para a curvatura normal da cauda durante a natação. No painel a as setas apontam para a curvatura normal da cauda durante a natação. Este número foi modificado a partir de Aspatwar et al.16. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Inibidor da CA | Triagem de toxicidade | LC50 | In vivo | CAIs tóxico | Referência |
| Carbamatos | 24 | Todos | 1a | 3b | 24, não publicado |
| Cumarinas | 10 | Todos | - | 2 | Inéditos |
| Nitroimidazóis | 2 | Todos | 2 | 2c | 16 |
| Sulfonamidas | 5 | Todos | - | 3 | 25 |
| Total | 41 | Todos | 3 | 10 | - |
| um Com base na triagem de toxicidade, o inibidor foi utilizado para a inibição do Mycobacterium marinum no modelo zebrafish. b Inibidor letal, cneurotóxicos acima de 300 μm de concentração | |||||
Tabela 1: um resumo da segurança e toxicidade dos compostos selecionados. O experimento de avaliação de toxicidade ajuda o pesquisador a chegar a uma conclusão sobre a segurança dos compostos químicos testados. A concentração do LC50 permite definir a concentração segura para uma caracterização mais adicional. Um pesquisador pode decidir se o composto é letal mesmo após 24 h de exposição de embriões ao composto investigação. Em nosso exemplo, um efeito sutil sobre a natação devido à neurotoxicidade é a informação significativa, o que é útil para a criação de novas experiências. Assim, com base na triagem de toxicidade, pudemos utilizar concentrações seguras do inibidor da CA para a caracterização in vivo24.
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Discussion
O teste de toxicidade in vitro utilizando células cultivadas pode detectar a sobrevivência e os estudos morfológicos das células que fornecem informações limitadas sobre a toxicidade induzida pelo composto de teste. A vantagem da seleção da toxicidade de compostos químicos que usam embriões do zebrafish é deteção rápida de mudanças fenotípicas quimicamente induzidas em um animal inteiro durante o desenvolvimento embrionário em um organismo modelo relevante. Aproximadamente 70% dos genes humanos de codificação de proteínas têm contrapartes ortotoras no genoma do zebrafish25. As vias genéticas que controlam a transdução e o desenvolvimento do sinal são altamente conservadas entre o ser humano e o zebrafish26, e, conseqüentemente, os compostos químicos são prováveis ter efeitos tóxicos similares nos seres humanos25.
Zebrafish estão na vanguarda da investigação toxicológica e já foram amplamente utilizados para detectar toxinas em amostras de água e para estudar o mecanismo de ação de toxinas ambientais e seus efeitos sobre o animal27. Neste artigo, mostramos o uso do desenvolvimento de embriões de zebrafish para avaliar a toxicidade de potenciais compostos na fase inicial da descoberta de fármacos. Nossa avaliação rápida e multifacetada da toxicidade é baseada em 1) mudanças no phenotype do organismo (eclosão, SACs do otólitos, edema pericárdico, utilização do saco de gema, desenvolvimento do Notochord, pulsação do sol, desenvolvimento da bexiga da natação, movimento) durante embrionário desenvolvimento ao longo de um período de 5 dias, e 2) determinação da concentração letal (LC50). Horas razoáveis de trabalho hands-on (8-10 h dividido em 8 dias) é suficiente para determinar o perfil de toxicidade de um composto usando este procedimento. Para compostos recém-sintetizados que estão disponíveis em quantidades limitadas, a toxicidade pode ser avaliada usando um mínimo de 3 mg do composto. Nenhum equipamento especial é exigido. O procedimento é, portanto, uma maneira rápida e de baixo custo para avaliar os efeitos tóxicos de qualquer composto que pode potencialmente ser desenvolvido para a droga para uso humano.
A qualidade do lote de embriões tem um grande impacto no resultado do experimento. A qualidade dos ovos (incluindo a taxa de fertilização) não é óbvia imediatamente após a coleta dos tanques reprodutores (0-4 HPF). Para a obtenção de apenas embriões normalmente em desenvolvimento para os experimentos, antes de adicionar compostos, permitimos que os embriões permaneçam a 28,5 ° c por 24 h após a coleta dos tanques reprodutores. Após 24 HPF, quaisquer embriões mortos ou com aparência insalubre são descartados. Além disso, é aconselhável ter um grupo de embriões tratados simulados em cada experimento para controlar ainda mais a qualidade do lote de ovos utilizados no experimento, bem como ver a mortalidade basal para determinar com precisão o LC50.
Um grupo simulado-Tratado é igualmente necessário controlar para a toxicidade do veículo da escolha. Muitos produtos químicos são insolúveis na água e o DMSO é usado frequentemente como o veículo para a entrega dos compostos do teste. O DMSO é geralmente bem tolerado pelos embriões em menor (0,1%) concentrações de28. Às vezes, os compostos não são completamente solúveis, mesmo em DMSO e a solução parece nublado tornando difícil para a avaliação da toxicidade. Em tais casos, para obter a solução de ações do composto completamente solúvel e claro, acrescentando uma gota de 0,1% NaOH vai resolver o problema. Grupos de controle apropriados precisam ser configurados para avaliar a toxicidade do composto com precisão. Se outros veículos forem usados, sua toxicidade inerente pode afetar o experimento.
Cada poço de uma placa de 24 poços contem de 1-10 embriões submergidos em um volume total de 1 mL. Se o composto de ensaio estiver disponível apenas em pequenas quantidades, pode ser necessário utilizar até 10 embriões por poço para avaliar a sua toxicidade. É altamente recomendável que apenas 1 embrião por poço deva ser utilizado para cada análise16,24,29. A placa é armazenada na incubadora de 28,5 ° c por 5 dias. Às vezes a evaporação significativa observa-se causando uma mudança marcada na concentração do composto em um poço dado16. Selando as 24 placas do poço com películas de parafina de todos os lados, coloc embriões somente nos poços médios e enchendo os outros poços ao longo das bordas com água, os problemas causados pela evaporação podem ser evitados. Em nossos estudos anteriores, não observamos qualquer evaporação dos diluentes dos produtos químicos de 24 placas de poço24,29. Além disso, se o composto em questão é conhecido por ser instável temperaturas ambiente, mudanças diárias de água com composto fresco será necessário para resultados confiáveis.
O padrão de natação das larvas de zebrafish é analisado após os 5 dias de exposição ao composto. Os poços de uma placa 24-well que contem 5 larvas do DPF não são ideais para a finalidade devido ao tamanho limitado do poço. Portanto, para uma análise precisa do padrão de natação, as larvas precisam ser transferidas para uma placa de Petri contendo 50 mL de água E3 e podem se contentar por 2 min antes da análise. Em nosso estudo, apenas dois inibidores mostraram o efeito no padrão de natação16 entre os 52 α-CA e β-CA testados para segurança e toxicidade, com base em nossa experiência este teste pode detectar alterações sutis, incluindo o movimento atáxico leve das larvas.
Este estudo demonstrou que a única limitação do método atual é a destreza física. Esta preocupação pode ser superada através da repetição, como a habilidade de uma pessoa melhora com a prática. Uma vez que a perícia é alcançada a avaliação dos compostos que usam embriões do zebrafish é ética, fácil, eficiente e informativa. Nós, portanto, esperamos que um ensaio tão rápido usando embriões de zebrafish se torne uma ferramenta popular para a triagem de toxicidade in vivo na fase inicial do desenvolvimento de fármacos.
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Disclosures
Nenhum conflito de interesse potencial foi relatado pelos autores.
Acknowledgments
O trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Sigrid Juselius (SP, MP), da Fundação Cultural finlandesa (AA, MH), da Academia da Finlândia (SP, MP), da Fundação Orion Farmos (MH), da Fundação Tampere tuberculosis (SP, MH e MP) e da Fundação Jane e Aatos Erkko (SP e MP ). Agradecemos aos nossos colaboradores italianos e franceses, Prof. Supuran, e ao Prof. Winum, por fornecer inibidores de anidrase carbônica para avaliação de segurança e toxicidade para fins de desenvolvimento de drogas ANTITUBERCULOSE e anticancerígenos. Agradecemos a Aulikki Lehmus e Marianne Kuuslahti pela assistência técnica. Agradecemos também Leena Mäkinen e Hannaleena Piippo por sua ajuda com a criação de zebrafish e coleta de embriões. Agradecemos sinceramente Harlan Barker para a avaliação crítica do manuscrito e comentários perspicazes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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