Summary
Zebrafish embryon används för att utvärdera toxiciteten av kemiska föreningar. De utvecklas externt och är känsliga för kemikalier, vilket möjliggör detektion av subtila fenotypiska förändringar. Experimentet kräver endast en liten mängd av sammansatta, som direkt tillsätts till plattan som innehåller embryon, vilket gör testsystemet effektivt och kostnadseffektivt.
Abstract
Zebrafiskar är en allmänt använd ryggradsdjur modellorganism för sjukdomen och fenotyp-baserade drogen upptäckt. Zebrafiskar genererar många avkomman, har transparenta embryon och snabb extern utveckling. Zebrafish embryon kan därför också användas för en snabb utvärdering av toxiciteten hos de läkemedel som är värdefulla och finns i små mängder. I denna artikel beskrivs en metod för effektiv screening av toxiciteten av kemiska föreningar med hjälp av 1-5-dagars post fertilisering embryon. Embryona övervakas av stereomikroskopet för att undersöka fenotypiska defekter orsakade av exponering för olika koncentrationer av föreningar. Halva maximala dödliga koncentrationer (LC50) av föreningarna bestäms också. Den nuvarande studien krävde 3-6 mg en inhibitor förening, och hela experimentet tar ca 8-10 h som skall fyllas i av en individ i ett laboratorium med grundläggande faciliteter. Det nuvarande protokollet är lämplig för att testa någon förening för att identifiera oacceptabla toxiska eller off-Target effekter av föreningen i den tidiga fasen av Drug discovery och att upptäcka subtila toxiska effekter som kan missas i cellkulturen eller andra djurmodeller. Metoden minskar förseningarna i förfarandet och kostnaderna för läkemedelsutveckling.
Introduction
Läkemedelsutveckling är en dyr process. Innan en enda kemisk förening är godkänd av Food and Drug Administration (FDA) och Europeiskaläkemedelsmyndigheten (EMA) flera tusen föreningar screenas till en kostnad av över 1 000 000 000 dollar1. Under den prekliniska utvecklingen krävs den största delen av denna kostnad för djurförsök2. För att begränsa kostnaderna behöver forskare inom området läkemedelsutveckling alternativa modeller för säkerhets screening av kemiska föreningar3. Därför, i den tidiga fasen av läkemedelsutveckling, det skulle vara mycket fördelaktigt att använda en metod som snabbt kan utvärdera säkerheten och toxiciteten av föreningarna i en lämplig modell. Det finns flera protokoll som har använts för toxicitet screening av kemiska föreningar med djur-och cellkulturer kultur modeller men det finns inte ett enda protokoll som är validerade och är i allmänt bruk4,5. Befintliga protokoll som använder zebrafiskar varierar i längd och har använts av enskilda forskare som utvärderat toxiciteten enligt deras bekvämlighets krav6,7,8,9, 10 , elva , 12.
Under den senaste tiden har zebrafiskar vuxit fram som en praktisk modell för utvärdering av toxiciteten hos kemiska föreningar under embryonal utveckling6,7. Zebrafiskar har många inbyggda fördelar för utvärderingen av kemiska föreningar13. Även storskaliga experiment är mottagliga, som en zebrafiskar hona kan lägga partier av 200-300 ägg, som utvecklas snabbt ex vivo, behöver inte extern matning i upp till en vecka och är transparenta. Föreningarna kan tillsättas direkt i vattnet, där de kan (beroende på vilken typ av förening) diffus genom chorion, och efter kläckning, genom huden, gälar och munnen av larver. Experimenten kräver inte kopiösa mängder av kemiska föreningar14 på grund av den lilla storleken på embryot. Utveckla zebrafiskar embryon uttrycka de flesta av de proteiner som krävs för att uppnå det normala utvecklings utfall. Därför är en zebrafiskar embryo en känslig modell för att bedöma om en potentiell drog kan störa funktionen av ett protein eller signalering molekyl som är utvecklingsmässigt betydande. Zebrafiskar organ blir funktionella mellan 2-5 DPF15, och föreningar som är giftiga under denna känsliga period av embryonal utveckling inducera fenotypiska defekter i zebrafiskar larver. Dessa fenotypiska förändringar kan lätt detekteras med hjälp av ett enkelt Mikroskop utan invasiva tekniker11. Zebrafish embryon används ofta i toxikologisk forskning på grund av deras mycket större biologiska komplexitet jämfört med in vitro -Drug screening med hjälp av cellkultur modeller16,17. Som ryggradsdjur är den genetiska och fysiologiska makeupen hos zebrafiskar jämförbar med människan, och därför är toxiciteter av kemiska föreningar likartade mellan zebrafiskar och människor8,18,19, 20 , 21 , 22. Zebrafish är således ett värdefullt verktyg i den tidiga fasen av läkemedels upptäckt för utvärdering av toxiciteten och säkerheten hos de kemiska föreningarna.
I den här artikeln, ger vi en detaljerad beskrivning av den metod som används för att utvärdera säkerheten och toxiciteten av karbanhydras (ca) hämmare föreningar med 1-5-dagars post fertilisering (DPF) zebrafiskar embryon av en enda forskare. Protokollet omfattar att exponera zebrafiskar embryon för olika koncentrationer av kemiska hämmare föreningar och studera dödlighet och fenotypiska förändringar under embryonal utveckling. Vid slutet av exponeringen för kemiska föreningar, LC50 dosen av kemikalien bestäms. Metoden gör det möjligt för en individ att utföra effektiv screening av 1-5 test föreningar och tar ca 8-10 h beroende på erfarenheten av den person med metoden (figur 1). Var och en av de steg som krävs för att bedöma toxiciteten av föreningarna beskrivs i figur 2. Utvärderingen av toxicitet av CA-hämmare kräver 8 dagar, och inkluderar inrättande av parning par (dag 1); insamling av embryon från avels tankar, rengöring och förflyttning av dem till inkubator för 28,5 ° c (dag 2). spridningen av embryona till brunnarna i en 24-brunnsplatta och tillsats av utspädda CA-hämmare (dag 3). fenotypisk analys och avbildning av larver (dag 4-8), och bestämning av LC50 -dos (day8). Denna metod är snabb och effektiv, kräver en liten mängd av den kemiska föreningen och endast grundläggande anläggningar av laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebrafiskar Core Facility vid Tammerfors universitet har beviljats tillstånd av det nationella djur experiment nämnden (esavi/7975/04.10.05/2016). Alla experiment med zebrafiskar embryon utfördes enligt Länsstyrelsen i östra Finland, social-och hälsodepartementet i Tammerfors regionala Service Unit Protocol # lslh-2007-7254/YM-23.
1. inställning av övernattande Zebrafish parnings tankar
- Placera 2-5 vuxna manliga zebrafiskar och 3-5 vuxna kvinnlig zebrafiskar i parnings tankar över natten. (Avel framkallas på morgonen av automatiskt mörker och ljust cykla över natten).
- Inrätta flera korsningar för att få tillräckligt med embryon för att bedöma toxiciteten hos mer än två kemiska föreningar. För utvärdering av toxicitet, varje koncentration behöver minst 20 embryon23.
- För att undvika att hantera stress till djuren, låt djuren att vila i 2 veckor innan du använder samma individer för avel.
2. insamling av embryon och förberedelse plåtar för exponering för kemiska föreningar
- Samla in embryon, nästa dag före middagstid, med hjälp av en fin-mesh sil och överföra dem till en petriskål innehållande E3 embryo medium [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mm MgSO4, och 0,1% w/v metylenblått].
- Ta bort skräp med en Pastavpipett av plast (t. ex. mat och fast avfall). Undersök varje parti av embryon under stereomikroskopet för att avlägsna de obefruktade/döda embryona (identifierade genom deras ogenomskinliga utseende).
- Förvara embryona vid 28,5 ° c i en inkubator. Undersök embryona, nästa morgon, under ett stereomikroskop och avlägsna eventuella ohälsosamma eller döda embryon. Ersätt också det gamla E3-mediet med färskt E3-medium.
Anmärkning: Zebrafish embryon hålls alltid vid 28,5 ° c under laboratorieförhållanden. - Överför försiktigt 1 embryo till varje brunn på en 24-brunn-platta som innehåller tillräckligt med E3 medium för att täcka embryona.
3. beredningar av stamlösningen av kemiska föreningar och distribution av utspädd substans i brunnarna
- Ta ut injektionsflaskorna innehållande inhibitoren föreningar lagrade vid 4 ° c.
Obs: beroende på egenskaperna hos föreningen, dessa lagras vid olika temperaturer. - Väg de sammansatta (s) med en analytisk balans som kan väga några milligram (mg) av föreningen korrekt.
- Bered minst 250 μL (100 mM) av stamlösningen för varje förening i ett lämpligt lösningsmedel (t. ex. E3-vatten eller dimetylsulfoxid (DMSO), baserat på substansens löslighets egenskaper.
Anmärkningar: ovanstående steg kan göras en dag innan experimentet påbörjas vid en lämplig tidpunkt och lagras vid 4 ° c). - Gör seriella utspädningar av Stamlösningarna (e. g., 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM och 500 μM) med hjälp av E3 vatten i 15 mL centrifugrör.
Anmärkning: koncentrationerna och antalet seriella utspädningar varierar från en förening till en annan förening beroende på deras toxicitetsnivåer. - Från den 24 brunnsplattan som innehåller embryon, avlägsna E3-vatten från brunnarna med en Pasteur-pipett och en 1 mL-pipett (innehållande 1 DPF-embryon) en rad i taget.
- Fördela 1 mL av varje spädningsvätska i varje brunn (med början från lägre och flytta till högre koncentration) i brunnarna på 24-brunnsplattan.
- Ställ in en kontrollgrupp från samma parti embryon och tillsätt motsvarande mängd spädningsvätska.
- Etikett 24-brunn plattor med namn och koncentration av föreningen och hålla plattorna vid 28,5 ° c i en inkubator.
4. fenotypisk analys och avbildning av embryona med hjälp av ett stereomikroskop
- Undersök embryona under ett stereomikroskop för parametrar 24 h efter exponering för kemiska föreningar.
- Notera parametrarna såsom dödlighet, kläckning, hjärtslag, utnyttjande av äggula säck, simma blåsa utveckling, förflyttning av fisk, perikardiell ödem, och form av kroppen23.
- Ta larverna utsätts för varje koncentration av föreningen och lägga dem i sidled i en liten petriskål som innehåller 3% hög molekylvikt metylcellulosa med hjälp av en metall sond.
Anmärkning: den 3% metylcellulosa (hög molekyl med) är en trögflytande vätska som behövs för att bädda fisken med en nödvändig orientering för mikroskopisk undersökning. För att orientera fisken i denna vätska, en metall sond behövs. - Ta bilder med stereomikroskopet ansluten till en kamera. Spara bilderna i en separat mapp varje dag till slutet av experimentet.
- Skriv in alla observationer i en tabell varje dag, antingen i en online-tabell eller på ett tryckt ark.
- Om föreningarna är neurotoxiska, kan 4 till 5 DPF larver Visa förändrad simma mönster, göra ett register över sådana förändringar antingen genom att fånga en kort (30 s till 1 min) video av larverna uppvisar onormala rörelsemönster.
- Efter 5 dagars exponering för kemiska föreningar, notera den koncentration vid vilken hälften av embryona dör för att beräkna den halva maximala dödliga koncentrationen 50 (LC50) av varje kemikalie.
Anmärkning: LC50 är den koncentration vid vilken 50% av embryona dör i slutet av 5 dagars exponering för en kemisk förening. Använd minst 20 embryon för att testa toxiciteten för varje koncentration av en förening23. - Konstruera en kurva för dödlighet av embryon för alla koncentrationer med hjälp av ett lämpligt program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kritiska delen av utvärderingen av toxicitet testar olika koncentrationer av en eller flera kemiska föreningar i ett enda experiment. I början väljer föreningarna för utvärdering av toxicitet, antalet koncentrationer för att testa för varje förening, och därmed göra ett diagram (figur 3). Vi använde en unik färg för varje förening för att organisera proverna (figur 3). Användning av lösningsmedelsresistenta markör och märkning på botten eller sidorna av plattorna är viktigt att undvika att blanda upp senare. Om föreningarna inducerar några fenotypiska defekter i larverna som utsätts för olika koncentrationer av inhibitorer, registreras defekterna var 24: e timme under perioden 1-5 DPF (figur 4a, B, C, D). De embryon som behandlades med en känd CA IX-hämmare vid en koncentration av 500 μM visade inga uppenbara fenotypiska förändringar under de 1-5 dagar som exponeringen för den kemiska föreningen (figur 4b). Figur 4c och figur 4D visar de embryon som behandlats med β-ca-hämmare som inducerade olika fenotypiska defekter okläckta embryon även vid dag 3 (pilhuvud), böjd kropps struktur (pil), outnyttjad äggula säck och perikardiell ödem (pilhuvud) och frånvaro av otolith blåsor i larverna vid 5 dagar efter behandling med kemisk förening (pil). I en annan studie, de embryon som behandlats med ca-hämmare (figur 4e) visar frånvaron av otolith säckar och simma urinblåsan (pilhuvuden). I vår studie (figur 4c, D) dokumenterade vi fenotypiska defekter (bräckliga embryon och frånvaro av pigmentering) även efter dag 1 av exponeringen för ca-hämmare. De fenotypiska analyserna visade att vissa av inhibitoren föreningarna är dödliga och inte kan utvecklas som läkemedel för humant bruk (figur 4c, D och tabell 1).
Experimenten identifierade en representativ förening som inducerade minimala eller inga fenotypiska förändringar under embryonal utveckling och uppvisade en hög LC50 -dos (figur 5), vilket tyder på att substansen är säker för ytterligare karakterisering och potentiellt kan utvecklas till en läkemedelskandidat för humant bruk16. Att titta på stillbilder av larver som exponerats för föreningen visade inga fenotypiska defekter (figur 4B). Emellertid, samma förening befanns vara neurotoxiska och inducerad ataxi i larverna efter 5-dagars exponering för CA-hämmare (figur 6). Denna fenotyp kunde endast upptäckas genom att direkt observera simning beteendet hos zebrafiskar larver under mikroskopet. Dessa studier föreslog att den neurala utvecklingen av zebrafiskar larver är känslig för föreningen16,17.
Figur 1: tid i timmar som krävs för snabb screening av kemiska föreningar med hjälp av zebrafiskar embryon: I en uppsättning experiment, en person med praktisk erfarenhet kan skärmen om 5 kemiska föreningar (varje förening som kräver minst 6 utspädningar) med hjälp av zebrafiskar embryon i 24-brunn tallrikar. Totalt tar det ca 8-10 h från inrättandet av korsningar att utföra LC50 bestämning under en period av 8 dagar.
Figur 2: diagram som visar nedbrytningen av toxicitet utvärdering av kemiska föreningar. Toxicitet screening av kemiska föreningar kräver 8 dagar och kan brytas ned i fem steg. (Dag 1) Består av att sätta upp av zebrafiskar parning par i tankar. (Dag 2) Involverar insamling av embryon från parnings tankarna till petriskålar följt av att hålla dem på en 28,5 ° c inkubator för övernattning. (Dag 3) Undersökning av embryon med hjälp av ett stereomikroskop och rengöring av embryona. Spridningen av embryona till 24-well plattor och tillsats av spädningar av test föreningarna. (Dag 4-8) Fenotypiska analyser av larver för utvecklingsdefekter. Simning mönster studie och LC50 bestämning utfördes på den sista dagen av exponering för föreningar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk presentation av experiment som är involverade i utvärdering av toxicitet. Toxicitetsutvärderingen består av att sammanställa tabell tabell med information om kemiska föreningar, utspädningar av de föreningar och parametrar som skall bedömas. Att göra utspädning av stamlösningar till de önskade koncentrationerna i 15 mL centrifugrör (utspädning från ett rör som skall tillsättas till varje rad i 24-brunnen plattan). En 24-brunn skylt märkt med en vattentät markör med namnet på testsubstansen, koncentration i varje rad, och datum för exponering. Undersökning och avbildning av embryon genom att överföra larverna till en liten petriskål som innehåller 3% hög molekylvikt metylcellulosa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på fenotypisk analys av larverna i kontroll-och test sammansatta behandlade grupper. A) fenotypiska analyser av kontrollgruppen larver som inte behandlats med någon förening visade ingen fenotypisk defekt i Mikroskop. B) larver som behandlats med ca-hämmare 500 μm (känd hämmare av karbanhydras IX visade inga observerbara fenotypiska defekter. (C, D) De utvecklande larverna behandlade med β-CA-hämmare med koncentrationer av 250 μΜ respektive 125 μM. Föreningarna inducerade fenotypiska defekter såsom böjd kropp, perikardiell ödem, och outnyttjad äggula SAC (pilar och pilhuvuden). Panelerna A och B har modifierats från aspatwar et al16. Panelerna C, D och E visar tidigare opublicerade bilder, som erhölls med hjälp av ett annat Mikroskop. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bestämning av dödlig koncentration 50 (LC50) med hjälp av 1-5 DPF zebrafiskar larver. Toxicitetsbedömning med hjälp av zebrafiskar embryon gör det möjligt för forskare att bestämma den lägsta dödliga koncentrationen av den kemiska föreningen i slutet av experimentet. LC50 -koncentrationen av substansen (en känd ca IX-hämmare) var 3,5 mm. Den höga LC50 koncentrationen tillåter ytterligare karakterisering av föreningen. Denna siffra har modifierats från Aspatwar et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: ett exempel på bad mönster analys i både obehandlade (A) och hämmare behandlade (B) grupper av larver. De zebrafiskar larverna behandlas i panel B med 300 μm test inhibitor förening (en känd hämmare av humant karbanhydras IX) visade en onormal (ataxic) rörelsemönster (pilhuvuden), vilket tyder på att föreningen inducerar neurotoxicitet i utvecklingen embryon . Pilspetsen pekar på den normala krökning av svansen under simning. I panel A pekar pilarna till den normala krökning av svansen under simning. Denna siffra har modifierats från Aspatwar et al.16. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| CA-hämmare | Toxicitet screening | LC50 | In vivo | Giftiga CAIs | Referens |
| Karbamater | 24 | Alla | 1en | 3b | 24, opublicerade |
| Kumariner | 10 | Alla | - | 2 | Opublicerade |
| Nitroimidazoler | 2 | Alla | 2 | 2c | 16 |
| Sulfonamider | 5 | Alla | - | 3 | 25 |
| Totala | 41 | Alla | 3 | 10 | - |
| en en Baserat på toxicitetsscreening användes hämmare för hämning av Mycobacterium Marinum i zebrafiskar-modellen. b Dödlig hämmare, cneurotoxisk över 300 μm koncentration | |||||
Tabell 1: en sammanfattning av säkerheten och toxiciteten hos de undersökta föreningarna. Toxicitetsutvärderingsexperimentet hjälper forskaren att nå en slutsats om säkerheten hos de testade kemiska föreningarna. LC50 koncentrationen gör det möjligt att definiera säker koncentration för ytterligare karakterisering. En forskare kan avgöra om föreningen är dödlig även efter 24 h exponering av embryon till den sammansatta under utredning. I vårt exempel, en subtil effekt på simning på grund av neurotoxicitet är viktig information, vilket är till hjälp för att inrätta ytterligare experiment. Därför, baserat på toxicitet screening, kunde vi använda säkra koncentrationer av CA-hämmare för ytterligare karakterisering in vivo24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro toxicitetstest med odlade celler kan detektera överlevnad och morfologiska studier av cellerna som ger begränsad information om toxiciteten som induceras av testsubstansen. Fördelen med toxicitet screening av kemiska föreningar med hjälp av zebrafiskar embryon är snabb detektion av kemiskt inducerade fenotypiska förändringar i ett helt djur under embryonal utveckling i en relevant modellorganism. Cirka 70% av de protein-kodning mänskliga gener har ortologgar motsvarigheter i zebrafiskar Genome25. Genetiska vägar som styr signaltransduktion och utveckling är starkt bevarade mellan människa och zebrafisk26, och därför är kemiska föreningar sannolikt att ha liknande toxiska effekter hos människor25.
Zebrafish är i spetsen för toxikologisk forskning och har redan använts i stor utsträckning för att upptäcka gifter i vattenprover och att studera verkningsmekanismen för miljögifter och deras effekter på djuret27. I denna artikel, vi visar användningen av att utveckla zebrafiskar embryon för att utvärdera toxiciteten av potentiella föreningar i början av drogen upptäckt. Vår snabba och mångfacetterade toxicitetsbedömning är baserad på 1) förändringar i fenotyp av organismen (kläckning, otolith säckar, perikardiell ödem, äggula SAC utnyttjande, notochord utveckling, hjärtslag, simma blåsa utveckling, rörelse) under embryonala utveckling under en period av 5 dagar, och 2) bestämning av den dödliga koncentrationen (LC50). Rimliga timmar av hands-on arbete (8-10 h uppdelat på 8 dagar) är tillräckligt för att bestämma toxiciteten profil av en förening med hjälp av detta förfarande. För nya syntetiserade föreningar som finns i begränsade mängder, toxicitet kan utvärderas med hjälp av minst 3 mg av föreningen. Ingen speciell utrustning krävs. Förfarandet är således en snabb och låg kostnad sätt att utvärdera de toxiska effekterna av någon förening som potentiellt kan utvecklas till drogen för humant bruk.
Kvaliteten på partiet av embryon har en stor inverkan på resultatet av experimentet. Kvaliteten på ägg (inklusive befruktnings graden) är inte uppenbar omedelbart efter uppsamling från avels tankarna (0-4 HPF). För att få endast normalt utveckla embryon för experiment, innan du lägger till föreningar, vi tillåter embryon att förbli vid 28,5 ° c för 24 h efter insamling från avel tankar. Efter 24 HPF kasseras alla döda eller ohälsosamma utseende embryon. Utöver detta är det tillrådligt att ha en mock-behandlad grupp av embryon i varje experiment för att ytterligare kontrollera kvaliteten på partiet av ägg som används i experimentet samt att se baslinjen dödligheten att exakt bestämma LC50.
En mock-behandlad grupp behövs också för att kontrollera toxiciteten hos det fordon du väljer. Många kemikalier är olösliga i vatten och DMSO används ofta som ett fordon för leverans av test föreningarna. DMSO tolereras i allmänhet väl av embryona i lägre (0,1%) koncentrationer28. Ibland, föreningarna är inte helt lösliga även i DMSO och lösningen verkar grumlig vilket gör det svårt för utvärderingen av toxiciteten. I sådana fall, för att få beståndet lösning av föreningen helt lösliga och tydliga, lägga till en droppe av 0,1% NaOH kommer att lösa problemet. Lämpliga kontrollgrupper måste inrättas för att bedöma substansens toxicitet på ett korrekt sätt. Om andra fordon används kan deras inneboende toxicitet påverka experimentet.
Varje brunn på en 24-brunn tallrik innehåller från 1-10 embryon nedsänkt i en total volym av 1 mL. Om testsubstansen är tillgänglig endast i små mängder, kan det vara nödvändigt att använda upp till 10 embryon per brunn för att utvärdera dess toxicitet. Det rekommenderas starkt att endast 1 embryo per brunn används för varje analys16,24,29. Plattan förvaras vid 28,5 ° c inkubator i 5 dagar. Ibland betydande avdunstning observeras orsakar en markant förändring i koncentrationen av föreningen i en given brunn16. Genom att täta 24-brunnen plattor med paraffin filmer från alla sidor, placera embryon endast i mitten brunnar och fylla de andra brunnar längs kanterna med vatten, kan de problem som orsakas av avdunstning undvikas. I våra tidigare studier, vi har inte observerat någon avdunstning av spädningsvätskor av kemikalierna från 24-brunn tallrikar24,29. Dessutom, om föreningen i fråga är känt för att vara instabil under omgivningstemperaturer, dagliga förändringar av vatten med färsk förening kommer att behövas för tillförlitliga resultat.
Den simma mönster av zebrafiskar larver analyseras efter 5 dagar av exponering för föreningen. Brunnarna i en 24-borrplatta med 5 DPF-larver är inte idealiska för ändamålet på grund av den begränsade storleken på brunnen. Därför, för noggrann analys av simma mönster, larverna måste överföras till en petriskål som innehåller 50 mL av E3 vatten och kan nöja sig med 2 min före analysen. I vår studie visade endast två hämmare effekten på simma mönster16 bland de 52 α-ca och β-ca-hämmare screening för säkerhet och toxicitet, baserat på vår erfarenhet detta test kan upptäcka subtila förändringar inklusive mild ataktisk förflyttning av larverna.
Denna studie visade att den enda begränsningen till den nuvarande metoden är fysisk fingerfärdighet. Denna oro kan övervinnas genom upprepning, eftersom skickligheten hos en person förbättras med praktik. När kompetensen har uppnåtts är utvärderingen av föreningar med hjälp av zebrafiskar embryon etiskt, enkelt, effektivt och informativt. Vi förväntar oss därför att en sådan snabb analys med hjälp av zebrafiskar embryon kommer att bli ett populärt verktyg för in vivo toxicitet screening i den tidiga fasen av läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga potentiella intressekonflikter rapporterades av författarna.
Acknowledgments
Verket stöddes av bidrag från Sigrid Juselius Foundation (SP, MP), Finlands Kulturstiftelse (AA, MH), Finlands Akademi (SP, MP), Orion Farmos Foundation (MH), Tammerfors Tuberkulosstiftelse (SP, MH och MP) samt Jane och Aatos Erkkos stiftelse (SP och MP ). Vi tackar våra italienska och franska medarbetare, Prof. Supuran, och prof. Winum, för att tillhandahålla karbanhydrashämmare för säkerhet och toxicitet utvärdering för anti-TB och anti-cancerläkemedel utvecklingsändamål. Vi tackar Aulikki Lehmus och Marianne Kuuslahti för det tekniska biståndet. Vi tackar också Leena Mäkinen och Hannaleena Piippo för deras hjälp med sebrafiskuppfödning och insamling av embryon. Vi tackar uppriktigt Harlan Barker för kritisk utvärdering av manuskriptet och insiktsfulla kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
