Summary
Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.
Abstract
Zebra balığı hastalık ve fenotip bazlı ilaç keşfi için yaygın olarak kullanılan omurgalı modeli organizmadır. Zebra balığı birçok yavru üretir, şeffaf embriyolar ve hızlı dış gelişim vardır. Zebra balığı embriyoları, bu nedenle, aynı zamanda değerli ve küçük miktarlarda mevcut ilaçların toksisite hızlı değerlendirilmesi için kullanılabilir. Bu makalede, 1-5 günlük gübreleme sonrası embriyolar kullanılarak kimyasal bileşiklerin toksisitesinin etkin bir şekilde taranması için bir yöntem tanımlanmıştır. Embriyolar, farklı bileşik konsantrasyonlarına maruz kalmanın neden olduğu henotipik kusurları araştırmak için stereomikroskop la izlenir. Bileşiklerin yarı maksimal öldürücü konsantrasyonları (LC50)de belirlenir. Bu çalışma bir inhibitör bileşik 3-6 mg gerekli, ve tüm deney temel tesisleri olan bir laboratuvarda bir birey tarafından tamamlanması için yaklaşık 8-10 saat sürer. Mevcut protokol, ilacın keşfinin erken evresinde bileşiğin dayanılmaz toksik veya hedef dışı etkilerini belirlemek ve hücre kültürü veya diğer hayvan modellerinde gözden kaçmış olabilecek ince toksik etkileri tespit etmek için herhangi bir bileşiği test etmek için uygundur. Yöntem, prosedürdeki gecikmeleri ve ilaç geliştirme maliyetlerini azaltır.
Introduction
İlaç geliştirme pahalı bir süreçtir. Tek bir kimyasal bileşik Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı (EMA) tarafından onaylanmadan önce birkaç bin bileşikler bir milyar doların üzerinde bir maliyetle taranmaktadır1. Preklinik gelişim sırasında, bu maliyetin en büyük kısmı hayvantesti2 için gereklidir. Maliyetleri sınırlamak için, ilaç geliştirme alanında araştırmacılar kimyasal bileşiklerin güvenlik tarama için alternatif modeller gerekir3. Bu nedenle, ilaç gelişiminin erken aşamasında, hızlı bir şekilde uygun bir modelde bileşiklerin güvenlik ve toksisitesini değerlendirebilir bir yöntem kullanmak çok yararlı olacaktır. Hayvan ve hücre kültürü modellerini içeren kimyasal bileşiklerin toksisite taraması için kullanılan çeşitli protokoller vardır ama doğrulanır ve ortak kullanımda olan tek bir protokol yoktur4,5. Zebra balığı kullanarak mevcut protokoller uzunluğu değişir ve kendi kolaylık gereksinimi6,7,8,9 , olarak toksisite değerlendirildi bireysel araştırmacılar tarafından kullanılmıştır 10.000 , 11.11.20 , 12. Yıl.
Yakın geçmişte, zebra balığı embriyonik gelişim sırasında kimyasal bileşiklerin toksisite değerlendirilmesi için uygun bir model olarak ortaya çıkmıştır6,7. Zebra balığı kimyasal bileşiklerin değerlendirilmesi için birçok dahili avantajları vardır13. Hatta büyük ölçekli deneyler münasip, bir zebra balığı dişi hızla ex vivogeliştirmek 200-300 yumurta, toplu koyabilirsiniz gibi, bir haftakadar dış besleme gerekmez ve şeffaf. Bileşikler doğrudan suya eklenebilir, nerede (bileşiğin doğasına bağlı olarak) chorion yoluyla yayılır, ve yumurtadan sonra, deri yoluyla, solungaçları ve larvaağız. Deneyler, embriyonun küçük boyutu nedeniyle14 kimyasal bileşiklerin bol miktarda gerektirmez. Zebra balığı embriyolarının geliştirilmesi, normal gelişimsel sonuca ulaşmak için gereken proteinlerin çoğunu ifade eder. Bu nedenle, bir zebra balığı embriyopotansiyel bir ilaç bir protein veya sinyal molekülünün işlevini bozabilir olup olmadığını değerlendirmek için hassas bir modeldir. Zebra balığının organları 2-5 dpf15arasında işlevsel hale gelir ve embriyonik gelişimin bu hassas döneminde toksik olan bileşikler zebra balığı larvalarında henotik bozukluklara neden olur. Bu fenotipik değişiklikler kolayca invaziv teknikler olmadan basit bir mikroskop kullanılarak tespit edilebilir11. Zebrabalığı embriyoları yaygın hücre kültürü modelleri kullanarak in vitro ilaç tarama göre çok daha büyük biyolojik karmaşıklığı nedeniyle toksikolojik araştırmalarda kullanılır16,17. Bir omurgalı olarak, zebra balığı genetik ve fizyolojik makyaj insanlar ve dolayısıyla kimyasal bileşiklerin toksisite zebra balığı ve insanlar arasında benzer karşılaştırılabilir8,18,19, 20.000 , 21.000 , 22. Zebrabalığı, böylece, kimyasal bileşiklerin toksisite ve güvenlik değerlendirmesi için ilaç keşif erken aşamasında değerli bir araçtır.
Bu makalede, tek bir araştırmacı tarafından 1-5 günlük post fertilizasyon (dpf) zebra balığı embriyoları kullanılarak karbonik anhidraz (CA) inhibitör bileşiklerinin güvenliğini ve toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yöntemin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Protokol, zebra balığı embriyolarının farklı kimyasal inhibitör bileşiklerkonsantrasyonlarına maruz kalmalarını ve embriyonik gelişim sırasındaki mortalite ve henotik değişimleri incelemeyi içerir. Kimyasal bileşiklere maruz kalma sonunda, kimyasal LC50 doz belirlenir. Bu yöntem bireyin 1-5 test bileşiğinin verimli taramasını gerçekleştirmesini sağlar ve yöntemle kişinin deneyiminebağlı olarak yaklaşık 8-10 saat sürer (Şekil 1). Bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için gereken adımların her biri Şekil2'de özetlenmiştir. CA inhibitörlerinin toksisitesinin değerlendirilmesi 8 gün gerektirir ve çiftleşerek çiftleşerek çiftleşerek (1. gün) kurulmasını içerir; embriyoların üreme tanklarından toplanması, temizlenmesi ve 28,5 °C'ye aktarılması (2. gün); 24-iyi plaka kuyularına embriyoların dağılımı ve seyreltilmiş CA inhibitörü bileşiklerin eklenmesi (gün 3); larvaların fenotipik analizi ve görüntülemesi (gün 4-8) ve LC50 dozu (gün8) tayini. Bu yöntem hızlı ve verimli, kimyasal bileşik ve laboratuvar sadece temel tesisleri küçük bir miktar gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tampere Üniversitesi'ndeki zebra balığı çekirdek tesisi, Ulusal Hayvan Deney Kurulu tarafından verilen bir kuruluş iznine sahiptir (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Zebra balığı embriyosu kullanılarak yapılan tüm deneyler, Doğu Finlandiya İl Hükümeti, Tampere Bölgesel Hizmet Birimi Protokolü Sosyal ve Sağlık Bakanlığı 'lSLH-2007-7254/Ym-23'e göre yapılmıştır.
1. Gecelik Zebrabalığı Çiftertanklarının Kurulumu
- Bir gecede çiftleme tanklarına 2-5 yetişkin erkek zebra balığı ve 3-5 yetişkin dişi zebra balığı yerleştirin. (Üreme otomatik karanlık ve ışık döngüsü gecede tarafından sabah indüklenir).
- İkiden fazla kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için yeterli embriyo elde etmek için birkaç haç ayarlayın. Toksisite nin değerlendirilmesi için, her konsantrasyon20 embriyo23en az ihtiyacı vardır.
- Hayvanlara stres le başa çıkmaktan kaçınmak için, hayvanların üreme için aynı bireyleri kullanmadan önce 2 hafta dinlenmesine izin verin.
2. Embriyoların Toplanması ve Kimyasal Bileşiklere Maruz Kalmak İçin Plakahazırlama
- Embriyoları toplayın, ertesi gün öğlenden önce, ince örgüsüz bir süzgeç kullanarak ve E3 embriyo orta [5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4içeren bir Petri çanak üzerine transfer ve 0.1% w / v Methylene Mavi].
- Plastik pasteur pipeti (örneğin, gıda ve katı atık) kullanarak enkaz kaldırın. Döllenmemiş/ölü embriyoları (opak görünümleriyle tanımlanan) çıkarmak için her bir embriyo kümesini stereomikroskop altında inceleyin.
- Embriyoları 28.5 °C'de bir kuvözde tutun. Embriyoları, ertesi sabah, bir stereomikroskop altında inceleyin ve herhangi bir sağlıksız veya ölü embriyoları çıkarın. Ayrıca, taze E3 orta ile eski E3 orta değiştirin.
NOT: Zebra balığı embriyoları her zaman laboratuvar koşullarında 28.5 °C'de muhafaza edilir. - Dikkatle embriyoları kapsayacak kadar E3 orta içeren 24 kuyuplaka her kuyuya 1 embriyo aktarın.
3. Kimyasal Bileşiklerin Stok Çözeltisinin Hazırlıkları ve Seyreltilmiş Bileşiklerin Kuyulara Dağılımı
- 4 °C'de depolanan inhibitör bileşikleri içeren şişeleri çıkarın.
NOT: Bileşiğin özelliklerine bağlı olarak farklı sıcaklıklarda saklanır. - Bileşiğin birkaç miligramını (mg) doğru bir şekilde tartabilen analitik bir denge kullanarak bileşiğin(ler) tartın.
- Bileşiklerin çözünürlüğü özelliklerine göre, her bileşik için uygun bir çözücüde (örn. E3 su veya Dimetil sülfoksit (DMSO) en az 250 μL (100 mM) stok çözeltisi hazırlayın.
NOT: Yukarıdaki adımlar, denemenin başlamasından bir gün önce uygun bir zamanda yapılabilir ve 4 °C'de saklanabilir). - 15 mL santrifüj tüplerinde E3 suyu kullanarak stok çözeltilerinin seri seyreltmelerini (örn. 10 μM, 20°M, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 300 μM ve 500 μM) yapın.
NOT: Seri seyreltme konsantrasyonları ve sayısı toksisite düzeylerine bağlı olarak bir bileşikten başka bir bileşiğin sayısına göre değişir. - Embriyo içeren 24 kuyu plakasından, pasteur pipeti ve 1 mL pipet (1 dpf embriyo içeren) kullanarak kuyulardan e3 suyunu bir seferde çıkarın.
- Her kuyuda (alttan başlayıp daha yüksek konsantrasyona doğru hareket eden) her bir dilüentin 1 mL'sini 24 kuyunun kuyularına dağıtın.
- Aynı embriyo grubundan bir kontrol grubu ayarlayın ve karşılık gelen miktarda dilüent ekleyin.
- İsmi ve konsantrasyonu ile 24 kuyulu plakaları etiketleyip plakaları bir kuluçka makinesinde 28,5 °C'de tutun.
4. Stereomikroskop Kullanarak Embriyoların Henotypik Analizi ve Görüntülemesi
- Kimyasal bileşiklere maruz kaldıktan sonra 24 saat parametreler için embriyoları stereomikroskop altında inceleyin.
- Mortalite, kuluçka, kalp atışı, sarısı çuval kullanımı, mesane gelişimi, balık hareketi, perikardiyal ödem ve vücudun şekli gibi parametrelere dikkat edin23.
- Bileşiğin her konsantrasyonuna maruz kalan larvaları alın ve metal bir sonda kullanarak %3 yüksek molekül ağırlıklı metil selüloz içeren küçük bir Petri kabında yan lara yerleştirin.
NOT: %3'lük metil selüloz (yüksek moleküler) balığımikroskobik inceleme için gerekli bir oryantasyonla yerleştirmek için gerekli olan viskoz bir sıvıdır. Bu sıvı balık yönlendirme için, bir metal sonda gereklidir. - Görüntüleri kameraya bağlı stereomikroskop kullanarak çekin. Görüntüleri denemenin sonuna kadar her gün ayrı bir klasöre kaydedin.
- Tüm gözlemleri her gün bir tabloya çevrimiçi bir tabloya veya basılı bir sayfaya girin.
- Bileşikler nörotoksik ise, 4-5 dpf larvaları değiştirilmiş yüzme paterni gösterebilir, anormal hareket paterni sergileyen larvaların kısa (30 s ila 1 dk) videosunu çekerek bu tür değişikliklerin kaydını yapabilir.
- Kimyasal bileşiklere maruz kaldıktan 5 gün sonra, her kimyasalın 50 (LC50)yarısını hesaplamak için embriyoların yarısının öldüğü konsantrasyona dikkat edin.
NOT: LC50, embriyoların %50'sinin kimyasal bir bileşiğe maruz kaldıktan 5 gün sonra öldüğü konsantrasyondur. Bir bileşik 23 her konsantrasyonun toksisitesini test etmekiçin en az 20 embriyo kullanın. - Uygun bir program kullanarak tüm konsantrasyonları için embriyoların mortalite için bir eğri oluşturmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toksisite değerlendirmesinin kritik kısmı, tek bir deneyde bir veya birden fazla kimyasal bileşiğin farklı konsantrasyonlarını test etmektir. Başlangıçta, toksisite nin değerlendirilmesi için bileşikleri seçin, her bileşik için test etmek için konsantrasyonsayısı, ve buna göre, bir grafik yapmak (Şekil 3). Örnekleri düzenlemek için her bileşik için benzersiz bir renk kullandık (Şekil 3). Daha sonra karışmayı önlemek için solvente dayanıklı marker ve plakaların alt veya yanlarında etiketleme kullanımı önemlidir. Bileşikler inhibitörlerin farklı konsantrasyonlarına maruz kalan larvalarda herhangi bir henotipik kusura neden olursa, defektler 1-5 dpf döneminde her 24 saat olarak kaydedilir (Şekil4A,B,C,D). 500 μM konsantrasyonda bilinen bir CA IX inhibitörü ile tedavi edilen embriyolar, kimyasal bileşiğe maruz kalmanın 1-5 gün içinde belirgin bir henotik değişiklik göstermedi (Şekil4B). Şekil 4C ve Şekil 4D, 3. ve kimyasal bileşik (ok) ile tedaviden sonra 5 gün larvalarda otolikat keselerinin yokluğu. Başka bir çalışmada, CA inhibitörü ile tedavi edilen embriyolar (Şekil4E)otolit keseleri ve yüzme mesane (ok kafaları) yokluğunu gösterir. Çalışmamızda, (Şekil 4C,D), biz ap inhibitörleri maruz kalma gün 1 sonra bile henotipik kusurları (kırılgan embriyolar ve pigmentasyon yokluğu) belgelenmiştir. Fenotipik analizler bazı inhibitör bileşiklerin öldürücü olduğunu ve insan kullanımı için ilaç olarak geliştirilemediğini göstermiştir (Şekil4C,D ve Tablo 1).
Deneyler, embriyonik gelişim sırasında minimal veya hiç fenotipik değişiklik olmayan ve yüksek LC50 dozu (Şekil5)gösteren temsili bir bileşik tanımlayarak, bileşiğin daha fazla karakterizasyon için güvenli olduğunu ve potansiyel olarak insan kullanımı için bir ilaç adayı haline geliştirilebilir16. Bileşiğe maruz kalan larvaların hareketsiz görüntülerine bakıldığında henotipik bozukluklar saptanmama (Şekil4B). Ancak, aynı bileşik nörotoksik bulundu ve CA inhibitörü maruz kalma 5 gün sonra larvalarda indüklenen ataksi (Şekil6). Bu fenotip ancak mikroskop altında zebra balığı larvalarının yüzme davranışlarını doğrudan gözlemleyerek tespit edilebilir. Bu çalışmalar zebra balığı larvalarının nöral gelişiminin bileşim16,17duyarlı olduğunu ileri sürmüştür.
Şekil 1: Zebra balığı embriyoları kullanılarak kimyasal bileşiklerin hızlı taranması için gereken saatler in time: Bir dizi deneyde, uygulamalı deneyime sahip bir kişi 24 kuyuluk tabaklarda zebra balığı embriyoları kullanarak yaklaşık 5 kimyasal bileşiği (her biri en az 6 seyreltme gerektiren) tarayabiliyor. Toplamda, 8 günlük bir süre içinde LC50 tayini gerçekleştirmek için haçlar kurulumu yaklaşık 8-10 saat sürer.
Şekil 2: Kimyasal bileşiklerin toksisite değerlendirmesinin dökümünü gösteren grafik. Kimyasal bileşiklerin toksisite taraması 8 gün gerektirir ve beş adıma ayrılabilir. (Gün 1) Tanklarda zebra balığı çiftleşiş çiftlerinin kurulmasından oluşur. (Gün 2) Miplin tanklarından embriyoların Petri kaplarına toplanması ve ardından bir gecede 28,5 °C'lik bir kuluçka makinesinde tutulmasını içerir. (Gün 3) Stereomikroskop kullanılarak embriyoların incelenmesi ve embriyoların temizlenmesi. Embriyoların 24 kuyulu plakalara dağılımı ve test bileşiklerinin seyreltmelerinin eklenmesi. (Gün 4-8) Gelişimsel bozukluklar için larvaların fenotipik analizleri. Bileşiklere maruz kalmanın son gününde yüzme deseni çalışması ve LC50 tayini yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Toksisite değerlendirmesinde yer alan deneylerin şematik sunumu. Toksisite değerlendirmesi, kimyasal bileşikler, bileşiklerin seyreltmeleri ve değerlendirilecek parametreler hakkında bilgi içeren tablolu grafiğin hazırlanmasından oluşur. Stok çözeltilerinin 15 mL santrifüj tüpünde istenilen konsantrasyonlara seyreltilmesi (24 kuyulu plakanın her satırına eklenecek bir tüpten seyreltme). Test bileşiğinin adı, her satırdaki konsantrasyon ve maruz kalma tarihi ile işaretlenmiş 24 kuyuluk bir plaka. Larvaları %3 yüksek molekül ağırlıklı metil selüloz içeren küçük bir Petri kabına aktararak embriyoların incelenmesi ve görüntülenmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Test ve test bileşik tedavi gruplarında larvaların hevit analizi örneği. (A) Herhangi bir bileşimle tedavi edilmeyen kontrol grubu larvalarının henotypik analizlerinde mikroskop altında henotibik defekt saptanmama saptandı. (B) 500 μM CA inhibitörü ile tedavi edilen larvalar (bilinen karbonik anhidraz IX inhibitörü gözlemlenebilir henotik defekt göstermedi. (C, D) Gelişmekte olan larvalar β-CA inhibitörü ile sırasıyla 250 μΜ ve 125 μM konsantrasyonları ile tedavi edilir. Bileşikler kavisli vücut, perikardiyal ödem ve kullanılmayan yolk kese (oklar ve ok kafaları) gibi henotibik kusurları indüklenen. Paneller A ve B Aspatwar ve ark16değiştirilmiştir. C, D ve E panelleri, farklı bir mikroskop kullanılarak elde edilen daha önce yayınlanmamış görüntüleri göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: 1-5 dpf zebra balığı larvası kullanılarak öldürücü konsantrasyon 50 (LC50)tayini. Zebra balığı embriyoları kullanılarak toksisite değerlendirmesi araştırmacılar deney sonunda kimyasal bileşiğin minimum öldürücü konsantrasyonbelirlemek için izin verir. Bileşiğin LC50 konsantrasyonu (bilinen bir CA IX inhibitörü) 3.5 mM idi. Yüksek LC50 konsantrasyonu bileşiğin daha fazla karakterizasyonusağlar. Bu rakam Aspatwar ve ark.16'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hem tedavi edilmeyen (A) hem de inhibitör (B) larva gruplarında yüzme klübisi analizine bir örnektir. 300 μM test inhibitörü bileşik (insan karbonik anhidraz IX bilinen bir inhibitörü) ile panel B tedavi zebrabalığı larvaları anormal (ataksik) hareket deseni gösterdi (ok kafaları), bileşik gelişmekte olan embriyolarda nörotoksisite neden düşündüren . Ok başları yüzme sırasında kuyruğun normal eğriliğini işaret. A panelinde oklar yüzme sırasında kuyruğun normal eğriliğini işaret eder. Bu rakam Aspatwar ve ark.16'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| CA inhibitörü | Toksisite Taraması | LC50 | In vivo | Toksik CAI'ler | Başvuru |
| Karbamates | 24 | Tüm | 1a | 3b | 24, Yayınlanmamış |
| Karmarinler | 10 | Tüm | - | 2 | Yayınlanmamış |
| Nitroimidazoller | 2 | Tüm | 2 | 2c | 16 |
| Sülfonamidler | 5 | Tüm | - | 3 | 25 |
| Toplam | 41 | Tüm | 3 | 10 | - |
| bir Toksisite taramasına dayanarak, inhibitör zebrabalığı modelinde Mycobacterium marinum inhibisyonu için kullanılmıştır. b Öldürücü inhibitör, cNörotoksik 300 μM konsantrasyonun üzerinde | |||||
Tablo 1: Taranmış bileşiklerin emniyet ve toksisitesinin bir özeti. Toksisite değerlendirme deneyi, araştırmacının test edilen kimyasal bileşiklerin güvenliği hakkında bir sonuca varmalarına yardımcı olur. LC50 konsantrasyonu daha fazla karakterizasyon için güvenli konsantrasyon tanımlamaya olanak sağlar. Bir araştırmacı, embriyoların 24 saat boyunca bile araştırılanınca bile öldürücü olup olmadığına karar verebilir. Örneğimizde, nörotoksisite nedeniyle yüzme üzerinde ince bir etkisi daha fazla deney kurmak için yararlı olan önemli bilgiler vardır. Buna göre, toksisite taraması dayalı, biz vivo24daha fazla karakterizasyonu için CA inhibitörü güvenli konsantrasyonları kullanmak başardık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kültürlü hücreler kullanılarak yapılan in vitro toksisite testi, test bileşiğinin neden olduğu toksisite hakkında sınırlı bilgi sağlayan hücrelerin hayatta kalma ve morfolojik çalışmalarını tespit edebilir. Zebra balığı embriyoları kullanılarak kimyasal bileşiklerin toksisite tarama avantajı ilgili bir model organizmada embriyonik gelişim sırasında bütün bir hayvankimyasal kaynaklı phenotik değişikliklerin hızlı tespitidir. Protein kodlayan insan genlerinin yaklaşık %70'inde zebrabalığı genomu25'te ortolog lar bulunur. Sinyal iletimi ve gelişimini kontrol eden genetik yollar insan ve zebra balığı26arasında son derece korunmuştur ve bu nedenle kimyasal bileşiklerin insanlarda benzer toksik etkilere sahip olma olasılığı yüksektir25.
Zebrabalığı toksikolojik araştırma ön planda ve zaten yoğun su örneklerinde toksinleri tespit etmek ve çevresel toksinlerin eylem mekanizması ve hayvan üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılmıştır27. Bu makalede, ilaç keşfinin erken evresinde potansiyel bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için zebra balığı embriyolarının geliştirilmesini göstermekteyiz. Hızlı ve çok yönlü toksisite değerlendirmemiz 1) embriyonik dönemde organizmanın fenotipindeki değişikliklere (kuluçka, otolik keseler, perikardiyal ödem, sarıke kesesi kullanımı, notokorkord gelişimi, kalp atışı, mesane gelişimi, hareket) dayanmaktadır. 5 günlük bir süre içinde gelişme ve 2) öldürücü konsantrasyon (LC50)belirlenmesi. Pratik çalışma makul saat (8-10 saat 8 gün içinde bölünmüş) bu prosedürü kullanarak bir bileşiğin toksisite profilini belirlemek için yeterlidir. Sınırlı miktarda mevcut yeni sentezlenmiş bileşikler için, toksisite bileşiğin en az 3 mg kullanılarak değerlendirilebilir. Özel ekipman gerekmez. Prosedür, böylece, potansiyel olarak insan kullanımı için ilaç haline geliştirilebilir herhangi bir bileşiğin toksik etkilerini değerlendirmek için hızlı ve düşük maliyetli bir yoldur.
Embriyoların toplu kalitesi deneyin sonucu üzerinde büyük bir etkisi vardır. Yumurtaların kalitesi (döllenme oranı dahil) üreme tanklarından (0-4 hpf) alındıktan hemen sonra belirgin değildir. Bileşikler eklemeden önce, deneyler için sadece normal olarak gelişen embriyolar elde etmek için, üreme tanklarından toplama dan sonra 28,5 °C'de 24 saat boyunca embriyoların kalmasına izin veririz. 24 hpf sonra, herhangi bir ölü veya sağlıksız görünümlü embriyolar atılır. Buna ek olarak, her deneyde sahte işlem görmüş bir grup embriyonun deneyde kullanılan yumurta ların kalitesini daha iyi kontrol etmesi ve LC50'yi doğru bir şekilde belirlemek için temel mortaliteyi görmesi tavsiye edilir.
Bir mock-tedavi grubu da tercih edilen aracın toksisitesi için kontrol etmek için gereklidir. Birçok kimyasal suda çözünmez ve DMSO genellikle test bileşiklerinin teslimi için araç olarak kullanılır. DMSO genellikle daha düşük embriyolar tarafından iyi tolere edilir (%0.1) konsantrasyonları28. Bazen, bileşikler DMSO bile tamamen çözünür değildir ve çözelti toksisite değerlendirilmesi için zor hale bulutlu görünür. Bu gibi durumlarda, bileşim tamamen çözünür ve net stok çözümü almak için, 0.1% NaOH bir damla ekleyerek sorunu çözecektir. Bileşiğin toksisitesini doğru bir şekilde değerlendirmek için uygun kontrol gruplarının kurulması gerekir. Diğer araçlar kullanılırsa, bunların doğal toksisitesi deneyi etkileyebilir.
24 kuyuluk bir plakanın her kuyusu, toplam 1 mL hacmine batırılmış 1-10 embriyo içerir. Test bileşiği sadece küçük miktarlarda mevcutsa, toksisitesini değerlendirmek için kuyu başına en fazla 10 embriyo kullanmak gerekebilir. Her analiz için her analiz de sadece 1 embriyo kullanılması tavsiye edilir16,24,29. Plaka 28.5 °C inkübatörde 5 gün saklanır. Bazen önemli buharlaşma belirli bir kuyuda bileşik konsantrasyonunda belirgin bir değişime neden gözlenir16. 24 kuyulu plakaları her taraftan parafin filmleriyle mühürleyerek, embriyoları sadece orta kuyulara yerleştirerek ve jantlar boyunca diğer kuyuları suyla doldurarak buharlaşmanın neden olduğu sorunlar önlenebilir. Daha önceki çalışmalarımızda, 24 kuyulu plakalardan kimyasalların dilüentlerinin buharlaşmasını gözlemlemedik24,29. Ayrıca, söz konusu bileşik ortam sıcaklıkları altında kararsız olduğu biliniyorsa, taze bileşik ile su günlük değişiklikler güvenilir sonuçlar için gerekli olacaktır.
Zebra balığı larvalarının yüzme paterni, 5 günlük bileşiğin maruz kalmasından sonra analiz edilir. 5 dpf larva içeren 24 kuyuluk bir plakanın kuyuları, kuyunun sınırlı boyutu nedeniyle amaç için ideal değildir. Bu nedenle, yüzme deseninin doğru analizi için larvaların 50 mL E3 su içeren petri kabına aktarılması gerekir ve analizden önce 2 dakika yada 2 dakika yetinebilir. Çalışmamızda, sadece iki inhibitör, güvenlik ve toksisite için tetkik edilen 52 α-CA ve β-CA inhibitörleri arasında yüzme deseni16 üzerindeki etkisini gösterdi, deneyimlerimize göre bu test larvaların hafif ataksik hareketi de dahil olmak üzere ince değişiklikleri algılayabilir.
Bu çalışma, mevcut yöntemin tek sınırlamasının fiziksel el becerisi olduğunu göstermiştir. Bu endişe tekraryoluyla aşılabilir, bir kişinin beceri uygulama ile geliştirir gibi. Bir kez uzmanlık zebrabalığı embriyoları kullanarak bileşiklerin değerlendirilmesi elde etik, kolay, verimli ve bilgilendirici. Bu nedenle, zebra balığı embriyolarını kullanarak böyle hızlı bir titreşin, ilaç gelişiminin erken evresinde in vivo toksisite taraması için popüler bir araç haline gelmesini bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar tarafından olası bir çıkar çatışması bildirilmedi.
Acknowledgments
Çalışma Sigrid Juselius Vakfı (SP, MP), Finlandiya Kültür Vakfı (AA, MH), Finlandiya Akademisi (SP, MP), Orion Farmos Vakfı (MH), Tampere Tüberküloz Vakfı (SP, MH ve MP) ve Jane ve Aatos Erkko Vakfı (SP ve MP) hibe ile desteklendi ). İtalyan ve Fransız işbirlikçilerimiz Prof. Supuran ve Prof. Winum'a anti-TB ve anti-kanser ilaç geliştirme amaçları için güvenlik ve toksisite değerlendirmesi için karbonik anhidraz inhibitörleri sağladıklarından dolayı teşekkür ederiz. Aulikki Lehmus ve Marianne Kuuslahti'ye teknik yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Leena Mäkinen ve Hannaleena Piippo'ya zebra balığı üremesi ve embriyo toplama konusunda yardımcı olmaları için teşekkür ederiz. Harlan Barker'a el yazmasının eleştirel değerlendirmesi ve anlayışlı yorumları için içtenlikle teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
- Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
- Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A. M. Reproductive and developmental safety evaluation of new pharmaceutical compounds. Reproductive and Developmental Toxicology. Gupta, R. C. , Elsevier. Boston, MA, USA. 89-109 (2011).
- Lee, H. Y., Inselman, A. L., Kanungo, J., Hansen, D. K.
- Gao, G., Chen, L., Huang, C. Anti-cancer drug discovery: update and comparisons in yeast, Drosophila, and zebrafish. Current Molecular Pharmacology. 7 (1), 44-51 (2014).
- Brown, N. A. Selection of test chemicals for the ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests. European Centre for the Validation of Alternative Methods. Alternatives to Laboratory Animals. 30 (2), 177-198 (2002).
- Selderslaghs, I. W., Van Rompay, A. R., De Coen, W., Witters, H. E. Development of a screening assay to identify teratogenic and embryotoxic chemicals using the zebrafish embryo. Reproductive Toxicology. 28 (3), Elmsford, N.Y. 308-320 (2009).
- Brannen, K. C., Panzica-Kelly, J. M., Danberry, T. L., Augustine-Rauch, K. A. Development of a zebrafish embryo teratogenicity assay and quantitative prediction model. Birth Defects Research Part B Developmental and Reproductive Toxicology. 89 (1), 66-77 (2010).
- Hermsen, S. A., van den Brandhof, E. J., van der Ven, L. T., Piersma, A. H. Relative embryotoxicity of two classes of chemicals in a modified zebrafish embryotoxicity test and comparison with their in vivo potencies. Toxicology in Vitro. 25 (3), 745-753 (2011).
- Lessman, C. A. The developing zebrafish (Danio rerio): a vertebrate model for high-throughput screening of chemical libraries. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Reviews. 93 (3), 268-280 (2011).
- Lantz-McPeak, S., et al. Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos. Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).
- Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Evaluation of embryotoxicity using the zebrafish model. Methods in Molecular Biology. 691, 271-279 (2011).
- Rodrigues, G. C., et al. Design, synthesis, and evaluation of hydroxamic acid derivatives as promising agents for the management of Chagas disease. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (2), 298-308 (2014).
- Kanungo, J., Cuevas, E., Ali, S. F., Paule, M. G. Zebrafish model in drug safety assessment. Current Pharmaceutical Design. 20 (34), 5416-5429 (2014).
- Peterson, R. T., Link, B. A., Dowling, J. E., Schreiber, S. L. Small molecule developmental screens reveal the logic and timing of vertebrate development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 12965-12969 (2000).
- Stainier, D. Y., Fishman, M. C. The zebrafish as a model system to study cardiovascular development. Trends in Cardiovascular Medicine. 4 (5), 207-212 (1994).
- Aspatwar, A., et al. Nitroimidazole-based inhibitors DTP338 and DTP348 are safe for zebrafish embryos and efficiently inhibit the activity of human CA IX in Xenopus oocytes. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 33 (1), 1064-1073 (2018).
- Rami, M., et al. Hypoxia-targeting carbonic anhydrase IX inhibitors by a new series of nitroimidazole-sulfonamides/sulfamides/sulfamates. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (21), 8512-8520 (2013).
- Spitsbergen, J. M., Kent, M. L. The state of the art of the zebrafish model for toxicology and toxicologic pathology research--advantages and current limitations. Toxicologic Pathology. , Suppl 31. 62-87 (2003).
- Teraoka, H., et al. Induction of cytochrome P450 1A is required for circulation failure and edema by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in zebrafish. Biochemical and Biophysical Research Communications. 304 (2), 223-228 (2003).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Kari, G., Rodeck, U., Dicker, A. P. Zebrafish: an emerging model system for human disease and drug discovery. Clinical Pharmacology and Therapeutics. 82 (1), 70-80 (2007).
- Gourmelon, A., Delrue, N. Validation in Support of Internationally Harmonised OECD Test Guidelines for Assessing the Safety of Chemicals. Advances in Experimental Medicine and Biology. 856, 9-32 (2016).
- Aspatwar, A., et al. beta-CA-specific inhibitor dithiocarbamate Fc14-584B: a novel antimycobacterial agent with potential to treat drug-resistant tuberculosis. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 32 (1), 832-840 (2017).
- Kazokaite, J., Aspatwar, A., Kairys, V., Parkkila, S., Matulis, D. Fluorinated benzenesulfonamide anticancer inhibitors of carbonic anhydrase IX exhibit lower toxic effects on zebrafish embryonic development than ethoxzolamide. Drug and Chemical Toxicology. 40 (3), 309-319 (2017).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Granato, M., Nusslein-Volhard, C. Fishing for genes controlling development. Current Opinion in Genetics & Development. 6 (4), 461-468 (1996).
- Bambino, K., Chu, J. Zebrafish in Toxicology and Environmental Health. Current Topics in Developmental Biology. 124, 331-367 (2017).
- Goldsmith, P. Zebrafish as a pharmacological tool: the how, why and when. Current Opinion in Pharmacology. 4 (5), 504-512 (2004).
