Summary
在这里，我们提出了免疫荧光染色方案，以直接观察小鼠主尾的内皮细胞。该技术在研究不同流动模式的内皮细胞细胞和分子表型以及动脉粥样硬化的发展时非常有用。
Abstract
内皮表型和形态的异常变化被认为是动脉粥样硬化发病机制的初始事件。直接观察完整的内皮，为了解功能失调的内皮细胞的细胞和分子事件提供有价值的信息。在这里，我们描述了一种经过修饰的面免疫荧光染色技术，使科学家能够获得完整的内皮表面的清晰图像，并原位分析分子表达模式。该方法简单可靠，用于观察主塔不同部位的整个内皮单层。这项技术可能是了解动脉粥样硬化病理生理学的有前途的工具，特别是在早期阶段。
Introduction
血管的早期变化主要在内皮内展开，内皮球在血液和血管壁之间具有选择性屏障，其细胞间紧密结复合物1。大量证据表明，血流在调节内皮功能2中的机械作用起着关键作用。流体剪切应力，一种由血流产生的摩擦力，根据不同血管位点2、3的特定流动模式，不同形状内皮细胞形态和功能。与稳定流动（s-flow）区域（如动脉的直线段）相比，动脉粥样硬化病变优先发生在血流紊乱（d-flow）部位，如血管曲率、流量分频和分支点。因此，直接观察内皮形态和分子表达模式，应有助于深入了解不同流动范式下内皮细胞的结构和功能表型。
培养的内皮细胞可能无法像在体内那样表达实际表型，部分原因是流体剪切应力、周围细胞因子和细胞细胞细胞外基质相互作用的影响。为了达到这个目的，可以使用传统的免疫组织化学在横截面研究完整的内皮细胞单层。然而，内皮单层是如此薄和脆弱，它通常无法清楚地观察到。En 面部免疫组织化学已用于观察内皮内表面，但结果要么复杂或不稳定，因为内皮容易从底层组织剥离，或者只是大鼠或兔子动脉壁的一部分，其壁厚，安装4，5。
老鼠模型在许多方面比其他动物有相当大的优势。在这里，我们采用一种经过修饰的面内免疫荧光技术来分析C57BL/6小鼠的主动脉和胸主动脉的内皮细胞。这种技术已被广泛用于研究不同流动模式的内皮病理生理学，以及动脉粥样硬化6、7、8、9、10的发展。这种方法使科学家能够清楚地观察内皮的整个表面，并比较不同流体剪切应力下区域中特定蛋白质的表达模式。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有动物实验均按照上海交通大学动物资源委员会批准的实验规程进行。
1. 灌注鼠标主塔
- 简单地说，用五巴比妥钠（50毫克/千克体重）的腹内注射麻醉12周大的C57BL/6小鼠。轻轻捏紧尾巴，确认正确的麻醉。
注：如果未观察到任何运动，动物被充分麻醉以开始实验。 - 用胶带将鼠标的爪子粘在一叠纸巾上。
- 用钳子抓住老鼠的皮肤，用剪刀把皮肤从腹部切到胸部顶部。
- 用锋利的剪刀打开肋骨下面的腹腔。
- 用钳子提起胸骨，并切开隔膜;然后，切掉肋骨，露出胸腔。
- 用剪刀把肝脏正上方的卡瓦酒剪掉。
- 压力注入（100毫米汞柱）动脉树5分钟与预冷的正常盐水含有40单位/mL肝素通过左心室，直到肺部和肝脏变苍白。然后，在磷酸盐缓冲盐水中注入预冷却的4%甲醛（PBS，pH 7.4）3分钟。
- 去除所有的肌肉、器官和脂肪，直到主塔暴露。
- 将鼠标放在解剖显微镜下。
2. 主塔的解剖和纵向打开
- 在解剖显微镜下清晰地露出主塔，用细腻的钳子和一把细腻的剪刀将主塔沿主塔的结缔组织尽可能干净（图1）。
- 用一把精致的剪刀将胸主腹从心脏解剖到腹腔主干，并将主塔放入带PBS的6厘米细胞培养盘中。纵向、沿较小的曲线和沿较大的曲线切割打开主塔，直到满足直线段。用微剪刀切开主动脉的三个分支，包括无主动脉、左公道和左下环动脉，如图2所示。
3. 主塔的预处理和免疫染色
- 在PBS中用0.1%聚乙烯八苯基醚渗透主母，用10%正常山羊血清在Tris缓冲盐水（TBS）中将其阻断，在室温12孔细胞培养板中，在室温下1小时。
- 接下来，在阻塞缓冲液中孵育5 g/mL兔子抗VCAM-1和5 g/mL大鼠抗VE-卡塞林，在4°C过夜。
- 用洗涤溶液冲洗样品3x后（TBS含有2.5%聚二醇20），在房间内应用荧光结合二级抗体（1：1，000稀释、Alexa Fluor 555标记抗兔子IgG和Alexa Fluor 488标记抗鼠IgG）1小时温度。在洗涤溶液中冲洗 3 次。
- 用4'，6-二酰胺-2-苯林多尔（DAPI）（1微克/mL）对主塔进行10分钟的抗污，并在洗涤溶液中冲洗3次。
4. 主塔安装在玻璃滑块上
- 将主盘放在与发光表面向下的盖玻上，然后缓慢地将其移动到先前掉落在盖玻片上的防褪色安装解决方案。轻轻伸展主塔以保持试样平整。
- 将盖玻片反转，并放在滑动玻璃上。必须小心，不要让任何气泡留在试样和玻璃之间。
5. 主塔的观察
- 使用激光扫描共聚焦显微镜检查主塔。
- 使用 Image-Pro Plus 软件分析 en 人脸图像中所需区域不同通道的颜色强度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
一只12周大的C57BL/6小鼠被安乐死，并注入含有40单位/mL肝素的正常盐水，然后预冷冻4%的甲醛。小鼠主塔在解剖显微镜下暴露（图1），解剖，纵向切开（图2）。血管内皮细胞的En面免疫荧光染色，如图3和表1所示。血管细胞粘附蛋白-1（VCAM-1）表达的En面免疫荧光，以VE-卡塞林作为内皮标记物，在小鼠主塔不同区域的不同流动模式下显示。DAPI也被反染，以显示细胞核更好的可视化。内皮和平滑肌细胞在显微镜下通过z堆栈观察时可以很容易地从细胞核的形态中区分出来，因为内皮细胞核呈椭圆形，比主轴形光滑更大肌肉细胞核。代表的人脸图像如图4所示。 主塔由LSM 710激光扫描显微镜（材料表）用FLUAR 40x/1，3油透镜检查。从面免疫荧光染色，我们可以清楚和直接地观察到，VCAM-1的表达在扰动流（主大头拱的曲率较低）的区域比那些在稳定流动（主大头拱的曲率更大）更丰富和胸主塔）。
图 1：在解剖显微镜下暴露小鼠主塔。尽可能干净地去除主塔上的连接组织。a = 内分动脉;b = 左普通胡萝卜动脉;c = 左下方动脉。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2：解剖小鼠胸主塔，纵向切开。（A） 胸主从心脏到腹腔主干沿较小的曲线纵向和沿较大的曲线切开，直到满足直线段。主动脉的三个分支，包括无主体、左普通胡萝卜和左子形动脉，也用微剪刀切开。红色虚线表示切割线。（B） 主塔被打开，平摊在玻璃滑梯上。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：血管内皮细胞的免疫荧光染色的架构。首先，在PBS中用0.1%聚乙烯八苯基醚渗透解剖主母10分钟，在12孔细胞培养板室温下，在室温下用TBS中含有2.5%聚糖20的10%正常山羊血清将其阻断。接下来，在4°C下用原抗体在阻断缓冲液中孵育主数，然后用洗涤溶液冲洗三次（TBS含有2.5%聚二沙酯20）。然后，在室温下应用荧光结合二级抗体1小时，冲洗三次。用 DAPI 将主盘进行 10 分钟的反光，并在洗涤溶液中冲洗三次。最后，将主塔安装在玻璃玻片上，用激光扫描共聚焦显微镜观察主塔。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：代表面对染色结果。（A） En 对小鼠主尾（d-流区域）的较小曲率和较大的曲率或胸主数（s-流区域）进行免疫荧光分析，以比较不同流动范式下的内皮 VCAM-1 表达。内皮细胞形态通过VE-卡塞林染色显示。（B） 代表性 d 流区域（曲率较低）和 s 流区域（较大的曲率和胸腔）用箭头表示。请点击此处查看此图的较大版本。
| 步 | 过程 | 缓冲区 | 温度 | 时间 |
| 1 | 渗透 | 0.1% 聚氧乙烯八苯基醚在PBS | 室温 | 10分钟 |
| 2 | 阻塞 | 含有2.5%多糖的三聚糖（TBS）中10%正常山羊血清 | 室温 | 1 小时 |
| 3 | 第一抗体 （5 g/mL） | 阻塞缓冲区 | 4 °C | 一 夜 之间 |
| 4 | 冲洗 | TBS 含有 2.5% 多糖酸酯 20 | 室温 | 5 分钟， 3 次 |
| 5 | 荧光二级抗体 （1：1000） | 阻塞缓冲区 | 室温 | 1 小时 |
| 6 | 冲洗 | TBS 含有 2.5% 多糖酸酯 20 | 室温 | 5 分钟， 3 次 |
表 1：有关 en face 的详细信息免疫荧光染色程序。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
内皮液暴露于许多原生因子，包括脂质、炎症中介和流体剪切应激1，11，12。直接观察原位内皮细胞为分析细胞形态、细胞间结和分子表达模式的变化，以响应损伤刺激具有特殊优势。
以前的研究提供了两种不同的面免疫性化学技术来观察动脉壁4，5的内皮。其一是通过特殊技术从血管壁上剥离内皮单层，这很难掌握，并可能导致动脉4的分支部位失去大量内皮单层。另一个是安装整个动脉墙，如我们所述。全装准备易于执行，可以维持整个内皮单层在兔子和大鼠5，13。然而，将整个小鼠主动脉标本平放并不容易，如果不这样做，可能会在很大程度上影响观察质量。此处所述主动脉试样的准备，曲率切开，光表面朝下在盖玻上，使得将主动脉试样平放在滑动玻璃上更容易。此外，需要激光扫描共聚焦显微镜，以更好地关注血管内衬的薄内皮细胞单层。
该技术的关键点是尽可能将主动脉标本拉伸平整，以便更好地观察主动脉。此外，在灌注前，肝素应添加到正常盐水中，主动脉标本应在整个过程中进行温和处理。甲醛应新鲜制备，并保持在4°C，直到使用。
此技术有其局限性。首先，与组织部分的常规免疫组织化学相比，面免疫荧光检测下皮物质（如沉积的低密度脂蛋白）的能力是有限的。其次，荧光信号在共聚焦显微镜扫描后容易漂白，特别是在执行z轴分析时。此外，靶分子的表达只能根据其荧光强度进行半量化。
总之，这种经过修饰的面免疫荧光染色技术提供了一种简单的方法来分析不同血流模式下区域血管内皮细胞的形态和蛋白质表达模式6，7和动脉粥样硬化的发病机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家自然科学基金（授权号81670451，81770430）、上海新星计划（授权号17QA1403000）和上海市政府科学技术委员会（授权号81670451）的支持。14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
