Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 使用噻唑橙检测 DNA 的凝胶电泳实验。使用噻唑橙可以消除溴化乙酯, 并且可以使用紫外或蓝光进行荧光检测。
Abstract
使用琼脂糖进行 DNA 凝胶电泳是分子生物学实验室中常见的工具, 可以按大小分离 DNA 片段。分离后, DNA 通过染色进行可视化。这篇文章演示如何使用噻唑橙染色 DNA。与普通染色方法相比, 噻唑橙与普通染色方法相比是有利的, 因为它敏感、价格低廉、可与紫外线或蓝光激发 (以防止样品损坏), 并且比溴化乙酯更安全。已经配备了使用溴化乙酯进行 DNA 电泳实验的实验室通常可以在不对现有协议作额外修改的情况下切换染料, 使用紫外线进行检测。蓝光检测, 以避免样品损坏, 还可以实现与蓝光源和发射过滤器。已经配备了蓝光检测设备的实验室可以简单地切换染料, 而无需对现有协议进行其他更改。
Introduction
该方法的目的是利用噻唑橙 (TO) 进行荧光检测, 以确定琼脂糖凝胶中的 DNA。由于其低成本和良好的安全性能, 噻唑橙可能会在从事分子生物学, 特别是结扎和克隆的本科教学实验室和研究实验室中看到特别的好处。
溴化乙酯仍然是检测琼脂糖凝胶中 DNA 的最常见染料。这主要是因为它可以非常便宜地获得, 只需要用紫外线进行激发进行检测。溴化乙酯和噻唑橙价格低廉, 检出限低 (1-2 ng/lane)1。有两个主要的缺点, 乙二酸溴, 然而, 噻唑橙改善。
首先, 溴化乙酯是一种具有特殊处理、运输和处置要求的突变体2 , 而噻唑橙剂的致突变性较低 (在艾姆斯试验中3–4x 较少致突变性)3、4, 一般可以用常见的化学废物。
其次, 溴化物需要紫外线进行检测。如果需要, 噻唑橙同样可以使用紫外线, 但也可以用蓝光检测。紫外线虽然使用广泛, 但也有一些明显的缺点。首先, 它损害了人体的皮肤和眼睛。虽然紫外线可以由训练有素的专业人员安全使用, 但实验室紫外线对皮肤或眼睛的意外损害 (功能类似于晒伤) 并不少见, 尤其是在经验不足的科学家中。其次, 紫外线对 dna 样本5的危害极大, 这降低了下游实验 (如结扎和转化)1,6,7的成功。允许用蓝光进行探测 (ex, max = 510 nm (488 nm 和 470 nm 也显示出强烈的激发)), 不会造成皮肤损伤或 dna 损伤 (尽管任何强光可能仍然对眼睛有害), 大大降低了科学家面临的风险和样品。
TO 并不是溴化乙酯的唯一荧光染料替代品;它的优势在于成本。to 在20世纪80年代被发现为网状细胞染色8, 并已在一些基于 dna 的荧光实验9,10,11, 12,13中发现了有用的。它目前由多个供应商出售。TO 是额外的、更昂贵的蓝光--可检测到的商业染料的父化合物, 在电泳过程中表现类似, 使用紫外线或蓝光进行检测1。此外, 虽然其他染料对 Dna 浓度比 EtBr 或 TO 更敏感, 但对于一般电泳实验, 此类染料在许多情况下的成本高得令人望而却步。
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Protocol
1. 准备凝胶
注: 关于一般的凝胶电泳协议, 另见 p. y. lee 等。14岁
- 混合琼脂糖 (~ 1% wv, 特定大小分离的百分比可以变化) 在缓冲液 (约70毫升的小凝胶 (8 x 7 厘米))。缓冲器通常是 TAE (三-醋酸-edta, 40 mM Tris, 20 mm 醋酸, 1 mM EDTA, pH 值约 8.6) 或 TBE (三硼酸盐 edta, 90 mM Tis, 90 mm 硼酸盐, 2 mM EDTA, pH 值约 8.3)。
- 将噻唑橙添加到1.3μgml 的最终浓度。
- 在 DMSO 中溶解噻唑橙, 制成 10, 000倍的库存溶液 (13 Mg/ml)。虽然不是特别对光敏感, 但在不使用的时候, 把 TO 存放在黑暗中。该溶液在室温下稳定 ~ 月;长期储存可以通过冷冻 (DMSO 会冻结在标准冰箱中) 来实现。使用前, 请务必完全熔化并重新悬浮冷冻溶液。
注: 电泳后, 凝胶也可以用 TO 染色 (参见步骤 2.6)。虽然 TO 比溴化乙酯有了更好的安全性, 但应保持标准的分子生物学实验室安全预防措施。
- 在 DMSO 中溶解噻唑橙, 制成 10, 000倍的库存溶液 (13 Mg/ml)。虽然不是特别对光敏感, 但在不使用的时候, 把 TO 存放在黑暗中。该溶液在室温下稳定 ~ 月;长期储存可以通过冷冻 (DMSO 会冻结在标准冰箱中) 来实现。使用前, 请务必完全熔化并重新悬浮冷冻溶液。
- 微波琼脂糖、缓冲液和噻唑橙的混合物溶解琼脂糖 (约 60秒)。此步骤通常称为 "熔化"。如果需要, 要帮助溶解。
注: 如果需要, 也可以在微波后添加 to。 - 在浇注含有适当梳子的凝胶铸造装置之前, 请让琼脂糖溶液短暂冷却。
- 允许琼脂糖溶液凝固成凝胶。
2. 凝胶的装载和运行
- 如果尚未存在, 请将凝胶放入电泳装置中。
- 添加正在运行的缓冲器 (TAE 或 TBE, 如上所示), 以覆盖凝胶的表面。
- 使用加载染料加载 DNA 样本 (通常为 10μl)。包括一个 DNA 施胶梯作为参考。
- 连接盖和电极 (凝胶应向红色阳极 (正) 运行)。
- 应用电压 (通常为小凝胶 ~ 100V, 虽然凝胶的大小可能需要修改电压, 以防止损坏凝胶), 直到加载染料的移动距离 (对于微型凝胶约4-7 厘米, 虽然距离可能会有所不同, 但取决于精确的应用)。
注: 与溴化乙酯和许多其他 dna 结合染料一样, 噻唑橙也是带正电荷的。因此, 这些染料将在电泳 DNA 的相反方向迁移。对于在凝胶下运行的样品, 最终染料将与较小的 DNA 片段分离, 导致弱染色。在这些情况下, 凝胶应按步骤2.6 中的方式染色。这种情况并不是 to 独有的, 任何与 DNA 可逆相互作用的带正电荷染料都会表现出这种行为 (包括溴化乙二铵、溴化物等)。 - 如果在凝胶铸造 (步骤 1.2) 之前未添加 TO, 请将凝胶浸入含有噻唑橙的缓冲液中染色。
- 准备足够的含有1.3μml 噻唑橙的缓冲液 (TAE 或 TBE), 以完全覆盖凝胶, 并以温和的搅拌浸泡凝胶, 直到充分检测到带 (大约 20分钟)。
3. 噻唑橙糖凝胶 (UV 透射照明器) 的可视化
- 从电泳装置中取出凝胶, 放在 UV 透射照明器上。
注意: 紫外线会损害皮肤和眼睛。一定要佩戴适当的眼睛 (护目镜) 和面部 (面罩) 保护。手应该有手套和长袖应该穿。 - 如果需要, 从凝胶中取出所需的 DNA 带 (例如, 用于进一步消化或结扎)。在切除过程中, 将凝胶暴露在紫外线下, 时间尽可能短。紫外线 (不分 DNA 染料) 会损害 DNA。
- 使用现成的试剂盒或协议15从凝胶切片中提取 dna。
4. 噻唑橙琼脂糖凝胶 (蓝光透射灯或手电筒) 的可视化
- 从电泳装置中取出凝胶, 放在蓝光透射光器上 (最大发射波长约470纳米)。或者, 蓝色 LED (~ 470 nm) 手电筒可以指向凝胶 (从上方或下方)。
注: 虽然使用使用溴化乙酯的蓝光透射照明器的灵敏度较低, 但使用这种蓝光协议可以检测到使用溴化乙酯染色的 DNA。 - 使用琥珀色发射过滤器 (~ 560 纳米长道, 护目镜或方形) 来过滤蓝光, 从而实现来自 DNA 的荧光可视化: 噻唑橙色复合物。
注: 如果没有琥珀色发射过滤器, 由于蓝光激发源的强度, 很难检测到 DNA 带。
注意: 虽然蓝光缺乏对组织的急性损伤能力 (与紫外线相反), 但长时间暴露在强烈的蓝光下可能会损害眼睛, 并应使用琥珀色的发射护目镜或过滤器。 - 如果需要, 从凝胶中取出所需的 DNA 带, 以便进一步应用。
注: 由于蓝光不会损坏 DNA, 因此不需要快速切割带 (例如在步骤3.2 中使用 UV 激发时)。 - 使用现成的试剂盒或协议15从凝胶切片中提取 dna。
5. 图像捕获
- 在凝胶成像装置中选择适当的激励和发射设置。噻唑橙的激发和发射 (ex, max = 510 nm (488 nm 和 470 nm 也显示强激发, 除了在紫外线波长的强激发);em = 527 nm) 几乎相同于普通蓝光–可检测的商业染料, 因此仪器可能具有可使用的预设过滤器设置。
注: 蓝光的某些过滤器设置–可检测的商业染料实际上使用破坏性的紫外线进行激发, 因此, 在切割带之前进行成像时要谨慎。如果可能, 当成像后 DNA 带被切除时, 请使用蓝光激发源。 - 在没有具有适当过滤器的成像系统的情况下, 在相机和凝胶蓝光激发源之间放置琥珀色过滤器。
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Representative Results
噻唑橙可以检测 DNA, 无需使用溴化乙酯, 也无需使用 dna 有害的紫外线。溴化乙酯是众所周知的诱变性, 因此从实验室中消除它可能是有利的。紫外线会显著损害 DNA 并降低转化效率, 而蓝光不会对 DNA 造成损害。溴化乙酯、噻唑橙和一种普通的蓝光--可检测的商业 DNA 染料 (图 1, 见材料表) 之间的检测限值相似, 所有三种染料的检测限值均为微型凝胶中的 ~ 1-2 ng/lane(一)
对于常见的应用, 如切割限制酶消化带, 噻唑橙特别适合。用蓝光激发检测 DNA 是稳健而直接的, 科学家不必像用紫外线检测 dna 那样急于切除 DNA。质粒被切断限制性酶分离插入物 (图 2, 一种凝胶被成像三种不同的方式)。除了紫外线外, 使用蓝光的 TO 还可以很容易地检测到刀片, 从而可以在不担心紫外线照射对 DNA 造成损害的情况下进行下游应用。
图 1.使用噻唑橙 (一种常见的蓝光) 检测 DNA--可检测商业 DNA 染料, 使用蓝光或紫外光检测溴化乙酯.凝胶切片图像代表了凝胶中 120 ng 波段 DNA 的两倍稀释 (2-log 阶梯的 x 波段为 3.0 kb 波段)。这一数字已从 O ' Neil 等人1修改, 经允许转载。有关实验的完整细节, 请参见 o 'neil 等人。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2.多个图像的同一噻唑橙角染色琼脂糖凝胶的限制消化。(a) 紫外线透射灯励磁。(B) 蓝光透射灯励磁。(C) 使用蓝光手电筒进行激发 (其尖端略显可见, 脱离焦点, 在底部的图像中)。车道 1:2-log 阶梯, 1 微克的总 DNA (标记为 3.0 kb、1.0 kb 和 0.5 kb 的主要波段)。车道2:0.5 微克的 Epf-gfp 质粒 dna (5.1 kb) 消化与 Hindii (预期大小 5.1 kb)。车道3:0.5 微克的 Epf-gfp 消化与 Hindii 和 EcoRI (预期尺寸: 3.7 kb, 1.3 kb)。凝胶在凝胶中与1.3 μgml 噻唑橙运行。所有使用标准发射过滤器 (590/110 纳米) 拍摄的图像, 曝光针对强波段进行了优化。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
尽管已知毒性, 但溴化乙酯长期以来一直是分子生物学实验室的标准工具。它还受到需要紫外线的影响, 紫外线会在检测到 DNA 时对其造成损害。噻唑橙提供了一种廉价的替代溴化乙酯, 以及有用但昂贵的商业染料。
因此, 噻唑橙的好处是双重的。首先, 噻唑橙可以简单地作为溴化乙酯的替代品。凝胶的制备可以与 EtBr 相同, 用 TO 代替为污渍 (步骤 1.2)。检测极限相似 (~ 1-2 ng/车道)1。更换染料不需要额外的设备, 因为与 EtBr 一样, 用紫外线 (步骤 3) 可以检测到噻唑橙。然而, 暴露在紫外光下会迅速损害 DNA, 并可能导致下游实验 (如结扎和转化1) 的失败。紫外线也会对皮肤和眼睛造成损害, 需要小心的安全预防措施。
TO 的第二个好处是, 它提供了从紫外线激发转移的可能性。蓝光检测 (用步骤4取代步骤 3) 消除了对 DNA 的损害, 并限制了科学家的风险。蓝光激发和检测 TO 可以实现蓝光透射灯, 也可以与廉价的蓝色 LED 手电筒 (两个 ~ 470 纳米最大发射波长, 都需要琥珀色发射过滤器)。适当应用激发波长 (步骤 4.1) 和发射过滤器 (步骤 4.2) 对于实验的成功至关重要 (另见步骤 5.1)。光源和发射过滤器是现成的, 但是, 只要投资最少, 实验室就可以获得蓝光激发的好处, 避免紫外线损坏。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了克里斯托弗·纽波特大学 TDG 创业基金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
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