Summary
Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.
Abstract
Electroforesis en gel de DNA utilizando agarosa es una herramienta común en laboratorios de biología molecular, permitiendo la separación de fragmentos de ADN por tamaño. Después de la separación, ADN es visualizado por la coloración. Este artículo muestra cómo utilizar tiazol naranja para teñir ADN. Naranja de tiazol compara favorablemente a los métodos de tinción común, que es sensible, barato, excitable con UV o luz azul (para evitar el daño de la muestra) y más seguro que el bromuro de etidio. Laboratorios equipados ya para ejecutar experimentos de electroforesis de ADN con bromuro de etidio pueden cambiar generalmente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes, utilizando luz ultravioleta para la detección. Además, detección de luz azul para evitar el daño de la muestra se logra con un filtro de la fuente y emisión de luz azul. Laboratorios ya equipados para la detección de luz azul pueden cambiar simplemente tintes sin cambios adicionales a los protocolos existentes.
Introduction
El propósito de este método es identificar ADN en geles de agarosa utilizando tiazol naranja (a) para la detección de fluorescencia. Debido a su perfil de seguridad favorable y bajo costo, naranja de tiazol puede ver beneficio particular en los laboratorios de docencia de pregrado y laboratorios de investigación realizar biología molecular, especialmente trompas y clonación.
Bromuro de etidio queda el tinte más común para la detección de ADN en geles de agarosa. Esto es principalmente porque se puede obtener muy poco costosa y sólo requiere excitación con luz UV para la detección. Ambos etidio bromuro y tiazol naranja son baratos, con baja detección de límites (1-2 ng/carril)1. Hay dos principales inconvenientes a bromuro de etidio naranja de tiazol mejora.
En primer lugar, bromuro de etidio es un mutágeno2 especiales de manejo, envío y requisitos de la disposición, mientras que el naranja de tiazol es menos mutagénico (3 – 4 x menos mutagénicos en la prueba de Ames)3,4 y pueden eliminarse generalmente de con residuos químicos comunes.
En segundo lugar, bromuro de etidio requiere luz UV para la detección. Naranja de tiazol semejantemente puede usar luz UV si se desea, pero también puede ser detectada con luz azul. Luz UV, mientras que comúnmente utilizado, tiene algunas desventajas salientes. En primer lugar, es dañino a los ojos y la piel humana. Mientras que la luz UV puede ser utilizada con seguridad por profesionales capacitados, piel o los ojos daños accidentales (funcionalmente similar a las quemaduras de sol) de la luz UV de laboratorio no son infrecuentes particularmente con científicos inexpertos. En segundo lugar, la luz UV es extremadamente perjudicial para el DNA muestras5, que reduce el éxito de posteriores experimentos (como la ligadura y transformación)1,6,7. A permite la detección con luz azul (λex, max = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran excitación fuerte)), que no causa daño a la piel o daño de ADN (aunque cualquier luz intensa todavía puede ser dañoso a los ojos), disminuyendo enormemente los riesgos para ambos el científico y la muestra.
No es la alternativa de colorante fluorescente sólo a bromuro de etidio; su ventaja es el costo. A fue descubierto en la década de 1980 como una mancha de reticulocitos8y ha encontrado utilidad en un número de fluorescencia basada en ADN experimentos9,10,11,12,13. Actualmente se vende por varios proveedores. A es el compuesto original de adicional, más caro, azul-luz – detectable tintes comerciales y se comporta de manera similar durante la electroforesis, utilizando luz azul o UV para detección1. Además, mientras que otros tintes son más sensibles a concentraciones muy bajas de ADN que EtBr o a, para los experimentos de electroforesis genérico, estos tintes son prohibitivos en muchos contextos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparar el gel
Nota: Para los protocolos de la electroforesis del gel general, ver también P.Y. Lee, et al. 14.
- Mezcla de agarosa (~ 1% w/v, porcentaje puede ser variado para separaciones de tamaño) en tampón (aproximadamente 70 mL para un gel mini (8 x 7 cm)). Tampones son comúnmente TAE (pH de tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris, acetato de 20 mM, 1 mM EDTA, aproximadamente 8.6) o TBE (pH de tris-borato-EDTA, 90 mM Tris, borato de 90 mM, EDTA 2 mM, aproximadamente 8.3)).
- Añadir naranja de tiazol a una concentración final de 1.3 μg/mL.
- Disolver el tiazol naranja en DMSO para hacer una solución stock de 10.000 x (13 mg/mL). Mientras que no particularmente fotosensible, almacenar a en el oscuro cuando no esté en uso. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante ~ meses; almacenamiento a largo plazo puede lograr congelar alícuotas (DMSO se congela en una nevera estándar). No olvide totalmente derretir y resuspender una solución congelada antes de su uso.
Nota: El gel puede también ser manchado con a después de la electroforesis (ver paso 2.6). Si bien tiene un perfil de seguridad mejorado sobre el bromuro de etidio, seguridad en el laboratorio biología molecular estándar deben mantenerse las precauciones.
- Disolver el tiazol naranja en DMSO para hacer una solución stock de 10.000 x (13 mg/mL). Mientras que no particularmente fotosensible, almacenar a en el oscuro cuando no esté en uso. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante ~ meses; almacenamiento a largo plazo puede lograr congelar alícuotas (DMSO se congela en una nevera estándar). No olvide totalmente derretir y resuspender una solución congelada antes de su uso.
- Microondas la mezcla de agarosa, buffer y tiazol naranja para disolver la agarosa (aproximadamente 60 s). Este paso se conoce comúnmente como "fusión". Remolino (5 s) para facilitar la disolución si es necesario.
Nota: Para también se puede añadir después de microondas si se prefiere. - Deje que la solución de agarosa enfriar brevemente antes de verter en gel aparato de fundición que contiene un peine adecuado.
- Deje que la solución de agarosa solidifique en un gel.
2. carga y ejecuta el gel
- Coloque el gel en el aparato de electroforesis si no está ya presente.
- Añadir el buffer corriente (TAE o TBE como arriba) para cubrir la superficie del gel.
- Carga de muestras de ADN (comúnmente de 10 μL) usando un colorante de carga. Incluir una escala de tamaño de DNA para referencia.
- Coloque la tapa y electrodos (se debe ejecutar el gel hacia el ánodo rojo (positivo)).
- Aplique tensión (típicamente ~ 100V para un mini-gel, aunque el tamaño del gel puede requerir una tensión modificada para no dañar el gel) hasta que carga el tinte ha viajado una distancia apropiada (aproximadamente 4-7 cm para un mini-gel, aunque la distancia puede variar dependiendo aplicación precisa).
Nota: Como muchos otros tintes de DNA-que atan y bromuro de etidio, naranja de tiazol se carga positivamente. En consecuencia, estos tintes se migran en la dirección opuesta de electrophoresing ADN. Para las muestras que se bajan mucho el gel de separación mayor, finalmente el tinte se separará de los pequeños fragmentos de DNA, dando por resultado la coloración débil. En estos casos, el gel debe ser teñido como en el paso 2.6. Esta situación no es exclusiva de a, cualquier carga positiva tinte que interactúa reversiblemente con la DNA exhibe este comportamiento (incluyendo a bromuro de etidio y otros). - Si a no fue agregado antes de gel casting (paso 1.2), sumergiendo el gel en el búfer que contiene naranja de tiazol de la mancha.
- Preparar suficiente buffer (TAE o TBE) que contiene 1,3 tiazol μg/mL naranja cubre el gel y remojar el gel con agitación suave hasta que las bandas son totalmente detectado (aproximadamente 20 min).
3. visualización del gel de agarosa naranja de tiazol (transiluminador de UV)
- Retirar el gel desde el aparato de electroforesis y el lugar en un transiluminador UV.
PRECAUCIÓN: La luz UV es dañina para la piel y los ojos. Asegúrese de usar la adecuada protección de ojos (gafas) y cara (careta). Las manos deben tener guantes y se debe usar manga larga. - Si lo desea, recorte había deseado bandas de ADN desde el gel (para la digestión posterior o ligadura, por ejemplo). Exponer el gel a luz UV para tan brevemente un período de tiempo posible durante la supresión. (Independientemente del tinte de ADN) luz UV daña DNA.
- Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit o protocolo disponible15.
4. visualización del gel de agarosa naranja de tiazol (luz azul transiluminador o linterna)
- Retirar el gel desde el aparato de electroforesis y el lugar en un transiluminador de luz azul (~ 470 nm emisión máxima longitud de onda). Alternativamente, un LED azul (~ 470 nm) linterna puede orientarse en gel (ya sea desde arriba o abajo).
Nota: Mientras que la sensibilidad es menor utilizando un transiluminador de luz azul con bromuro de etidio, ADN teñida con bromuro de etidio puede ser detectada mediante este protocolo de luz azul. - Utilice un filtro de emisión ámbar (~ 560 nm longpass, gafas o cuadrado) para filtrar la luz azul, lo que permite la visualización de la fluorescencia de complejos de ADN: tiazol naranja.
Nota: Sin el filtro de emisión ámbar, es muy difícil detectar bandas de ADN debido a la intensidad de la fuente de excitación de luz azul.
PRECAUCIÓN: Aunque luz azul carece de la capacidad de agudo dañar los tejidos (contrastado UV), prolongados exposición a la luz azul intensa puede dañar los ojos y se debe usar gafas ámbar emisión o filtro. - Si lo desea, recorte deseadas bandas de ADN desde el gel para más aplicaciones.
Nota: Puesto que la luz azul no daña el ADN, no es necesario cortar rápidamente las bandas (como por ejemplo al usar excitación UV en el paso 3.2). - Extraer el ADN de la rebanada de gel usando un kit o protocolo disponible15.
5. captura de la imagen
- Seleccione ajustes apropiados de excitación y emisión en aparato de proyección de imagen de gel. La excitación y emisión de la naranja de tiazol (λex, max = 510 nm (488 nm y 470 nm también muestran fuerte excitación, además de fuerte excitación en longitudes de onda de UV); λem = 527 nm) son casi idénticos a los comun comercial azul-luz-perceptible colorantes, por lo que instrumentos pueden tener programadas configuración del filtro que puede ser utilizado.
Nota: Algunas configuraciones de filtro azul luz – detectables colorantes comerciales realmente usar luz perjudicial UV para la excitación, así que tenga cuidado si la proyección de imagen antes del corte de bandas. Usar una fuente de excitación de luz azul si es posible, cuando bandas de ADN serán suprimidos después de la proyección de imagen. - En la ausencia de un sistema de imágenes con filtros adecuados, colocar un filtro ámbar entre la cámara y la fuente de excitación de luz azul/gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Naranja de tiazol permite la detección de ADN, sin utilizar bromuro de etidio y sin necesidad de utilizar luz UV dañan el ADN. Bromuro de etidio es bien sabido ser mutagénico, para eliminar del laboratorio puede ser ventajoso. La luz UV daña el ADN y disminuye la eficiencia de transformación, mientras que la luz azul no daña el ADN. Límites de detección son similares entre el bromuro de etidio, naranja de tiazol y un tinte de ADN comercial común, azul-luz – detectable (figura 1, véase Tabla de materiales), con el límite de detección para todos tres tintes siendo ~ 1-2 ng/carril en un mini-gel 1.
Para aplicaciones comunes como cortar una banda de enzima de la restricción digerida, naranja de tiazol está particularmente bien adaptado. Detección de DNA con la excitación de la luz azul es robusto y sencillo, y el científico no tiene que apresurarse para DNA como lo harían si detectar con luz UV. Un plásmido fue cortado con enzimas de restricción para aislar un inserto (figura 2, es un gel reflejadas tres maneras diferentes). El inserto es fácilmente detectable con a con luz azul además de Ultravioleta, permitiendo que aplicaciones posteriores a sin temor a dañar el ADN de la exposición UV.
Figura 1 . Detección de ADN utilizando naranja de tiazol, común tinte azul luz – detectables de ADN comercial y bromuro de etidio usando azul o luz UV. Gel imágenes representan la dilución doble de una banda de 120 ng de ADN en el gel (la banda es una banda de 3,0 kb de escalera de 2-log). Esta figura ha sido modificada desde o ' Neil, et al.1, reproducido con permiso. Ver a o ' Neil, et al.1 para más detalles del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Varias imágenes del mismo gel de agarosa teñido de naranja de tiazol de un resumen de la restricción. (A) excitación con transiluminador UV. (B) la excitación con transiluminador de luz azul. (C) excitación con linterna de luz azul (la punta de los cuales es levemente visible, fuera de foco en imagen en la parte inferior). Carril 1:2-escalera de troncos, 1 μg de DNA total (bandas principales de 3,0 kb, kb 1,0 y 0,5 kb están etiquetados). Carril 2: 0.5 μg de plásmido de pEF-GFP ADN (5,1 kb) digerido con HindIII (espera de tamaño 5,1 kb). Carril 3: 0,5 μg de pEF-GFP digerido con HindIII y EcoRI (espera tamaños: 3,7 kb, 1,3 kb). Gel se ha ejecutado con 1.3 tiazol μg/mL en el gel de naranja. Todas las imágenes tomadas con filtro de emisión estándar (590/110 nm), optimizada para bandas de intensa exposición. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bromuro de etidio durante mucho tiempo ha sido una herramienta estándar en el laboratorio de biología molecular, a pesar de toxicidad conocido. Padece también requieren luz ultravioleta, que daña el ADN que se está detectando. Thiazole orange ofrece una alternativa económica a bromuro de etidio, así como tintes comerciales útiles pero costosos.
Los beneficios de la naranja de tiazol son así dos veces. En primer lugar, naranja de tiazol simplemente puede utilizarse como sustitución de bromuro de etidio. Los geles se pueden preparar idénticamente a EtBr, con al que sustituyó como la mancha (paso 1.2). Límites de detección son similares (~ 1-2 ng/carril)1. Ningún equipo adicional es necesaria para cambiar los tintes porque naranja de tiazol se puede detectar con luz UV (paso 3) al igual las EtBr. Exposición a la luz UV rápidamente daña el ADN, sin embargo y puede causar falta de posteriores experimentos tales como la ligadura y transformación1. La luz UV también es dañino para la piel y los ojos, que requieren precauciones de seguridad cuidado.
El segundo beneficio de a es que ofrece la posibilidad de cambiar de puesto lejos de excitación UV. Detección con luz azul (sustituir el paso 3 con el paso 4) elimina el daño al ADN y los límites de riesgo para el científico. Excitación de luz azul y la detección de a pueden lograrse con un transiluminador de luz azul y también con una linterna de LED azul barato (ambos onda de máxima emisión ~ 470 nm, ambos que requieren un filtro ámbar de emisión). La aplicación adecuada de longitudes de onda de excitación (paso 4.1) y filtros de emisión (paso 4.2) es esencial para el éxito del experimento (véase también paso 5.1). Fuentes de luz y filtros de emisión están disponibles, sin embargo, y con una inversión mínima, laboratorios pueden obtener los beneficios de la excitación de luz azul y evitar daño luz ultravioleta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de arranque a TDG de Christopher Newport University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. Molecular Probes, Inc. , USA. WO/2005/0333342 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
