Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשימוש thiazole כתום זיהוי ה-DNA בניסויים ג'ל אלקטרופורזה. השימוש thiazole כתום מאפשר חיסול של אתידיום ברומיד, וכן זיהוי קרינה פלואורסצנטית יכולה להיות מושגת באמצעות UV או אור כחול.
Abstract
דנ א בג'ל באמצעות agarose הוא כלי נפוץ במעבדות בביולוגיה מולקולרית, המאפשר הפרדה בין שברי DNA לפי גודל. לאחר ההפרדה, ה-DNA הוא מדמיין מאת מכתים. מאמר זה מדגים כיצד להשתמש DNA thiazole כתום כתם. Thiazole תפוז משווה לטובה לשיטות מכתימים נפוצות, בכך שהוא רגיש, זול, להתרגש עם UV או אור כחול (כדי למנוע נזק לדוגמה), ובטוחה יותר אתידיום ברומיד. מעבדות מצוידים כבר להפעלת ה-DNA אלקטרופורזה ניסויים באמצעות אתידיום ברומיד יכול לעבור בדרך כלל צבעי ללא שינויים נוספים הפרוטוקולים הקיימים, באמצעות אור UV לגילוי. בנוסף ניתן להשיג גילוי אור כחול כדי למנוע נזק מדגם עם מסנן המקור, פליטת אור כחול. מעבדות מצוידים כבר לגילוי אור כחול ניתן לעבור פשוט צבע ללא שינויים נוספים הפרוטוקולים הקיימים.
Introduction
מטרת שיטה זו היא לזהות את הדנ א של ג'לים agarose באמצעות thiazole כתום (כדי) לגילוי קרינה פלואורסצנטית. עקב פרופיל בטיחות בעלות נמוכה מאהדה שלה, thiazole כתום עשויים לראות תועלת מסוימת הוראה לתואר ראשון מעבדות, מעבדות מחקר, ביצוע בביולוגיה מולקולרית, בעיקר ligations ו שיבוט.
אתידיום ברומיד נשאר הצבע הנפוץ ביותר עבור זיהוי ה-DNA agarose ג'ל. זה בעיקר כי ניתן להשיג בזול מאוד, רק דורש עירור עם אור UV לצורך זיהוי. שניהם אתידיום ברומיד, thiazole כתום זולים, עם זיהוי נמוך מגבלות (1-2 ng/ליין)1. שני חסרונות עיקריים אתידיום ברומיד, עם זאת, המשפר thiazole כתום על.
ראשית, אתידיום ברומיד הוא מוטגן2 עם טיפול מיוחד, משלוח ודרישות סילוק, ואילו thiazole כתום הוא פחות מוטגן (3-4 x פחות כגורמי מוטציה במבחן איימס)3,4 , ניתן באופן כללי להמית עם פסולת כימית נפוצות.
שנית, אתידיום ברומיד דורש אור UV לצורך זיהוי. Thiazole כתום באופן דומה ניתן להשתמש אור UV אם רצונך בכך, אך ניתן לזהות גם עם אור כחול. אור UV, בעוד בשימוש נפוץ, יש כמה חסרונות הבולטות. ראשית, הוא נחשב כמזיק עור ועיניים. בעוד אור UV ניתן להשתמש בבטחה על ידי אנשי מקצוע מיומנים, העור או עין נזק מקרי (בדומה פונקציונלית כוויות שמש) ממעבדה UV אור אינן נדירות במיוחד עם מדענים לא מנוסים. שנית, אור UV מזיק מאוד ל- DNA דגימות5, אשר מפחית את ההצלחה של ניסויים במורד הזרם (כגון מצדו טרנספורמציה)1,6,7. אל מאפשר זיהוי עם אור כחול (λלשעבר, מקסימום = 510 ננומטר (488 ננומטר, 470 nm גם להראות עירור חזק)), אשר אינו גורם נזק לעור או DNA נזק (למרות כל אור אינטנסיבי עשוי עדיין להיות מזיקה לעיניים), להקטין באופן משמעותי את הסיכונים להם שני המדען את הדגימה.
היא לא החלופה רק הפלורסנט אתידיום ברומיד; היתרון שלו הוא העלות. כדי התגלה בשנות ה-80 כמו כתם רטיקולוציט8, מצא השירות במספר של זריחה מבוסס DNA ניסויים9,10,11,12,13. הוא נמכר כעת על-ידי ספקים מרובים. כדי הוא מתחם הורים נוספים, יקר יותר, צבע כחול-אור – לזיהוי מסחרי, מתנהג בדומה במהלך אלקטרופורזה, באמצעות UV או אור כחול עבור זיהוי1. יתר על כן, בעוד צבעים אחרים רגישים נמוך מאוד ריכוזי ה-DNA יותר EtBr או אל, לניסויים אלקטרופורזה כלליים, כגון צבעי הם לחדשו בהקשרים רבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכינים את הג'ל
הערה: עבור כללי ג'ל אלקטרופורזה פרוטוקולים, ראה גם לי פ, ואח. 14.
- לערבב agarose (~ 1% w/v, אחוז יכולים להיות מגוונים להפרדות גודל מסוים) במאגר (כ 70 מ עבור ג'ל מיני (8 x 7 ס מ)). מאגרי הם בדרך כלל טה (טריס-אצטט-EDTA, 40 מ מ טריס, אצטט 20 מ מ, 1 מ מ EDTA, pH כ 8.6) או TBE (טריס-בוראט-EDTA, 90 מ מ טריס, בוראט 90 מ מ, 2 מ מ EDTA, pH כ 8.3)).
- להוסיף thiazole כתום ריכוז סופי של 1.3 μg/mL.
- להמיס thiazole תפוזים ב דימתיל סולפוקסיד לעשות 10,000 x מניות פתרון (13 mg/mL). בזמן רגיש לא קלה במיוחד, לאחסן עד מתי כהה אינו בשימוש. פתרון זה הוא יציב בטמפרטורת החדר במשך ~ חודשים; אחסון לטווח ארוך יכול להיעשות על ידי הקפאת aliquots (דימתיל סולפוקסיד תוקפא מקרר סטנדרטי). ודא שאתה לגמרי להמיס resuspend פתרון קפואה לפני השימוש.
הערה: הג'ל יכול גם להיות מוכתם אל לאחר אלקטרופורזה (ראה שלב 2.6). זמן יש פרופיל בטיחות משופרת של אתידיום ברומיד, בטיחות מעבדה ביולוגיה מולקולרית סטנדרט הזהירות צריכים להישמר.
- להמיס thiazole תפוזים ב דימתיל סולפוקסיד לעשות 10,000 x מניות פתרון (13 mg/mL). בזמן רגיש לא קלה במיוחד, לאחסן עד מתי כהה אינו בשימוש. פתרון זה הוא יציב בטמפרטורת החדר במשך ~ חודשים; אחסון לטווח ארוך יכול להיעשות על ידי הקפאת aliquots (דימתיל סולפוקסיד תוקפא מקרר סטנדרטי). ודא שאתה לגמרי להמיס resuspend פתרון קפואה לפני השימוש.
- את התערובת של agarose, מאגר agarose thiazole כתום כדי להמיס במיקרוגל (כ 60 s). שלב זה בדרך כלל מתייחסים כאל "נמס". מערבולת (5 s) כדי לסייע התפרקות במידת הצורך.
: הערה ניתן להוסיף גם לאחר במיקרוגל אם מועדף. - לאפשר agarose לתמיסה להתקרר בקצרה לפני לשפוך לתוך מכשיר הליהוק ג'ל המכיל של המסרק המתאים.
- לאפשר את הפתרון agarose לגבש לתוך ג'ל.
2. טעינת ויפעילו את הג'ל
- הכנס המנגנון אלקטרופורזה בג'ל אם לא שכבר קיים.
- להוסיף מאגר הפעלה (טה או TBE כמו לעיל) כדי לכסות את המשטח של הג'ל.
- לטעון דגימות די אן איי (בדרך כלל 10 μL) באמצעות צבע טעינה. כולל סולם הדנ א שנקודות לעיון.
- לצרף את הכיסוי ואלקטרודות (הג'ל אמורה לפעול לכיוון האנודה אדום (חיובי)).
- החל מתח (בדרך כלל ~ 100V עבור ג'ל המצומצמת, למרות בגודל של ג'ל עשויים לדרוש מתח ששונה כדי למנוע פגיעה הג'ל) עד טעינת לצבוע נסעה על המרחק המתאים (כ- 4-7 ס"מ על ג'ל המצומצמת, למרות המרחק עשוי להשתנות בהתאם יישום מדויק).
הערה: כמו אתידיום ברומיד רבים צובעת דנ א מחייב אחרים, thiazole כתום טעונה באופן חיובי. כתוצאה מכך, צבעים אלה להעביר בכיוון ההפוך של electrophoresing ה-DNA. לקבלת דוגמאות אשר מופעלים רחוק למטה הג'ל על הפרדה משופרת, בסופו של דבר לצבוע בין שברי DNA קטן יותר, וכתוצאה מכך מכתים חלש. במקרים אלה, הג'ל צריך להיות מוכתם כמו שלב 2.6. מצב זה אינו ייחודי אל, כל טעונה באופן חיובי לצבוע כי הפיכה אינטראקציה עם ה-DNA תערוכת ציורים של התנהגות זו (כולל אתידיום ברומיד, ל, ואחרים). - אם את לא נוסף לפני ג'ל הליהוק (שלב 1.2), כתם במועט הג'ל במאגר הכולל thiazole התפוזים.
- הכנת מאגר מספיק (טה או TBE) המכיל thiazole μg/mL 1.3 כתום לגמרי לכסות את הג'ל, להשרות את הג'ל עם עצבנות עדין עד הלהקות באופן מלא זוהה (בערך 20 דקות).
3. הדמיה של ג'ל כתום agarose thiazole (UV transilluminator)
- להסיר את הג'ל מכשירי אלקטרופורזה של המקום transilluminator UV.
התראה: אור UV מזיק על העור והעיניים. יש להקפיד ללבוש המתאים העין (משקפי מגן) והגנה הפנים (מגן הפנים). הידיים צריך כפפות, שרוולים ארוכים לענידה. - אם רצונך בכך, לגזור את הרצוי DNA להקות של הג'ל (עבור עיכול נוספות או מצדו, לדוגמה). לחשוף הג'ל לאור UV עבור כמו קצר את משך הזמן ככל האפשר במהלך כריתה. אולטרא סגול (ללא קשר לצבוע דנ א) נזקים הדנ א.
- לחלץ את הדנ א מ הפרוסה ג'ל באמצעות זמינים ערכת או פרוטוקול15.
4. ויזואליזציה של ג'ל כתום agarose thiazole (transilluminator אור כחול או פנס)
- להסיר את הג'ל מכשירי אלקטרופורזה והמקום על transilluminator אור כחול (~ 470 ננומטר אורך גל פליטה המרבי). לחלופין, נורית כחולה (~ 470 ננומטר) פנס יכולים להיות מכוונים את הג'ל (גם מעל או מתחת).
הערה: בעוד רגישות נמוכה יותר באמצעות transilluminator של אור כחול עם אתידיום ברומיד, DNA מוכתם אתידיום ברומיד יכול להתגלות באמצעות פרוטוקול זה אור כחול. - השתמש מסנן פליטה ענבר (~ 560 nm longpass, משקפי מגן או ריבוע) כדי לסנן את האור הכחול, המאפשר ויזואליזציה של קרינה פלואורסצנטית ממתחמי דנ א: thiazole כתום.
הערה: ללא המסנן פליטה ענבר, קשה מאוד לזהות להקות DNA עקב האינטנסיביות של מקור אור כחול עירור.
התראה: למרות אור כחול חסרה את היכולת בחריפות נזק לרקמות (מנוגדים UV), ממושך חשיפה לאור כחול אינטנסיבי עלול לגרום נזק לעיניים, משקפת הענבר פליטה או מסנן אמור לשמש. - אם רצונך בכך, לגזור להקות DNA הרצוי של הג'ל לאפליקציות נוספות.
הערה: מאז אור כחול אינו גורם נזק דנ א, אין צורך לחתוך במהירות להקות (כגון בעת שימוש UV עירור בשלב 3.2). - לחלץ את הדנ א מ הפרוסה ג'ל באמצעות זמינים ערכת או פרוטוקול15.
5. לכידת תמונה
- בחר הגדרות המתאימים עירור ופליטה מכשיר הדמיה ג'ל. עירור של פליטה של thiazole כתום (λלשעבר, מקסימום = 510 ננומטר (488 ננומטר, 470 nm גם להראות עירור חזק, בנוסף עירור חזק באורכי גל UV); λem = 527 ננומטר) כמעט זהות לפרסומות כחול-אור – לזיהוי נפוצות צבענים, אז כלי נגינה עשויים מראש הגדרות המסנן יכול לשמש.
הערה: כמה הגדרות המסנן עבור צבעי כחול-אור – לזיהוי מסחרי למעשה לשימוש אור UV המזיקות עירור, אז היזהר אם הדמיה לפני חיתוך להקות. השתמש מקור אור כחול עירור במידת האפשר כאשר להקות דנ א להוציא לאחר דימות. - בהעדר מערכת הדמיה עם המסננים המתאימים, מקום של מסנן ענבר בין המצלמה ואת המקור עירור ג'ל/אור כחול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thiazole תפוז מאפשר זיהוי של ה-DNA, ללא שימוש אתידיום ברומיד, ולא באמצעות אור UV מזיקות-DNA. אתידיום ברומיד ידוע להיות מוטגן, כך ולהוצאתה מהמעבדה עשוי להיות יתרון. אור UV מזיקה דנ א, מוריד את יעילות ההמרה באופן משמעותי, בעוד אור כחול אינו גורם נזק הדנ א. איתור מגבלות דומות בין אתידיום ברומיד, כתום thiazole משותף, כחול-אור – לזיהוי מסחרי DNA צבע (איור 1, ראה טבלה של חומרים), עם מגבלת זיהוי עבור כל צבע שלוש להיות ~ 1-2 ng/ליין ג'ל מיני 1.
עבור יישומים נפוצים כגון חיתוך להקה אנזים הגבלה מתעכל, כתום thiazole מתאימה במיוחד היטב. זיהוי ה-DNA עם אור כחול עירור חזקה וישירה, המדען אין למהר לסלק את הדנ א. כפי שהם היו אם מזהה עם אור UV. פלסמיד נחתך עם אנזימי הגבלה לבודד מוסף (איור 2, ג'ל אחד הוא שבעורך בשלוש דרכים שונות). תותב הוא בקלות לזיהוי עם עם אור כחול בנוסף UV, ומאפשר יישומים במורד הזרם להתרחש ללא חשש של נזק ל- DNA של חשיפה UV.
איור 1 . זיהוי ה-DNA באמצעות thiazole כתום, נפוץ לצבוע דנ א כחול-אור – לזיהוי מסחרי וכן אתידיום ברומיד באמצעות כחול או אור UV- ג'ל פרוסה תמונות מייצגות את הדילול כפולה של להקה 120-ng של ה-DNA על פני הג'ל (הלהקה היא להקת 3.0 kb 2-יומן הסולם). דמות זו שונתה של אוניל, ואח1, לשכפל בעלי הרשאה. ראה אוניל, ואח1 לקבלת פרטים מלאים של הניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . תמונות מרובות של הג'ל שהוכתמו orange agarose thiazole אותו של תקציר ההגבלה. (א) עירור עם UV transilluminator. (ב) עירור עם אור כחול transilluminator. (ג) עירור עם פנס אור כחול (קצה אשר הוא גלוי מעט, ממוקד, בתמונה למטה). ליין 1:2-יומן הסולם, μg 1 של ה-DNA הכולל (מסומנות הלהקות הגדולות של 3.0 kb, 1.0 kb 0.5 ק ב). ליין 2: 0.5 μg של pEF-GFP פלסמיד ה-DNA (5.1 kb) מתעכל עם HindIII (צפוי בגודל 5.1 kb). ליין 3: 0.5 μg של pEF-GFP מתעכל ועם HindIII EcoRI (צפוי גדלים: 3.7 kb, 1.3 kb). ג'ל הופעלה עם 1.3 thiazole μg/mL כתום הג'ל. כל התמונות שצולמו באמצעות מסנן פליטה רגילה (590/110 nm), חשיפה אופטימיזציה עבור להקות אינטנסיבי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אתידיום ברומיד כבר זמן רב כלי תקני במעבדה בביולוגיה מולקולרית, למרות ידועה רעילות. זה גם סובל הדורשים אור UV, אשר פוגעת הדנ א כמו זה להיות מזוהה. Thiazole תפוז מציע אלטרנטיבה זולה אתידיום ברומיד, כמו גם צבע מסחרי שימושי אך יקר.
היתרונות של thiazole תפוז הם לפיכך כפולה. ראשית, ניתן להשתמש thiazole כתום פשוט כתחליף אתידיום ברומיד. ג'לים ניתן להכין באופן זהה כדי EtBr, עם עד שהוחלפו כמו הכתם (שלב 1.2). איתור מגבלות דומות (~ 1-2 ng/ליין)1. אין ציוד נוסף נדרש להחליף צבעים כי ניתן להבחין thiazole כתום עם אור UV (שלב 3) בדיוק כמו EtBr. חשיפה לאור UV במהירות נזקים ה-DNA, אולם, עלול לגרום לכשל של הזרם ניסויים כגון מצדו וטרנספורמציה1. אור UV מזיק גם את העור ואת העיניים, המחייב זהירות זהירות.
היתרון השני של הוא שהיא מציעה את האפשרות של הסטת הרחק עירור UV. זיהוי עם אור כחול (החלפת שלב 3 שלב 4) מבטלת נזק ל- DNA ומגביל לסכן המדען. אור כחול עירור וזיהוי של יכול להיעשות עם transilluminator של אור כחול, וגם עם פנס LED כחול זול (שני ~ 470 nm פליטת מרבית אורך גל, הדורשים מסנן פליטה ענבר). יישום המתאימים עירור אורכי הגל (שלב 4.1) ומסננים פליטה (שלב 4.2) חיוני להצלחת הניסוי (ראה גם שלב 5.1). מקורות אור ומסננים פליטה הם זמינים, עם זאת, עם השקעה מינימלית, מעבדות יכול קבל את היתרונות של עירור אור כחול, למנוע נזק אור UV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות אתחול כדי TDG מ אוניברסיטת ניופורט כריסטופר.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. Molecular Probes, Inc. , USA. WO/2005/0333342 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
