Summary
Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.
Abstract
Özel kullanarak DNA Jel Elektroforez Moleküler Biyoloji Laboratuvarları, boyutuna göre DNA parçalarının ayrılması sağlayan ortak bir araç olduğunu. Ayrılıktan sonra DNA boyama tarafından görüntülenmiştir. Bu makalede tiyazol leke turuncu DNA kullanımı gösterilmiştir. Hassas, ucuz, UV veya (örnek zarar önlemek için) mavi ışık ile heyecanlı ve etidyum bromür daha güvenli olduğu tiyazol turuncu olumlu ortak boyama yöntemleri karşılaştırır. Zaten DNA Elektroforez deneyler etidyum bromür kullanarak çalıştırmak için donatılmış laboratuvarları genellikle boyalar ile herhangi bir ek değişiklik algılama için UV ışık kullanarak varolan iletişim kuralları, geçiş yapabilirsiniz. Mavi ışık algılama örnek zarar görmemesi için Ayrıca bir mavi ışık kaynağı ve emisyon filtre ile elde edilebilir. Zaten mavi ışık algılama için donatılmış labs sadece boya ile herhangi bir ek değişiklik varolan iletişim kuralları için geçiş yapabilirsiniz.
Introduction
Bu yöntemin amacı DNA Floresans algılama için tiyazol turuncu (için) kullanarak özel jelleri belirlemektir. Onun alçak fiyat ve olumlu Emanet profil nedeniyle tiyazol turuncu lisans öğretim labs ve moleküler biyoloji, özellikle d ve klonlama performans araştırma laboratuvarları belirli fayda görebilirsiniz.
Etidyum bromür DNA tespiti özel jelleri içinde en yaygın boya kalır. Bu öncelikle çok ucuz elde edilebilir çünkü ve sadece algılama için uyarma UV ışığıyla gerektirir. Her iki etidyum bromür ve tiyazol turuncu ucuz, düşük algılama sınırları (1-2 ng/lane)1. Üzerine tiyazol turuncu artıran iki ana dezavantajları vardır etidyum bromür, ancak.
İlk olarak, tiyazol turuncu daha az mutajenik ise etidyum bromür özel işlem, nakliye ve bertaraf gereksinimleri, alkil2 ' dir (3-4 x daha az Ames testi mutajenik)3,4 ve genellikle ile bertaraf ortak kimyasal atık.
İkinci olarak, etidyum bromür algılama için UV ışık gerektirir. Tiyazol turuncu UV ışığı istenirse benzer şekilde kullanabilirsiniz, ancak aynı zamanda mavi ışık ile tespit edilebilir. UV ışığı, yaygın olarak kullanılan, birkaç belirgin dezavantajları vardır. İlk olarak, insan cilt ve göz zarar veriyor. UV ışık eğitimli profesyoneller tarafından güvenle kullanılabilir ise, kaza sonucu deri ya da göz zararlardan (işlevsel olarak sunburns için benzer) laboratuvar UV ışık özellikle deneyimsiz bilim adamları ile nadir değildir. İkinci olarak, UV ışık son derece aşağı akım deneyler (örneğin ligasyonu ve dönüştürme)1,6,7başarısını azaltan DNA örnekleri5' e, zarar veriyor. Kime mavi ışık ile algılama sağlar (λeski, max 510 = nm (488 nm ve 470 nm da göstermek güçlü uyarma)), hangi Deri Hasari neden olmaz veya DNA hasar (herhangi bir yoğun ışık hala gözlere zararlı olabilir, ancak), her iki bilim adamı riskleri büyük ölçüde azalan ve örnek.
Etidyum bromür sadece floresan boya alternatif için değil; onun avantajı maliyetidir. İÇİN Retikülosit leke8olarak 1980'lerde keşfedildi ve yardımcı programı Floresans DNA tabanlı deneyler9,10,11,12,13bir dizi içinde buldu. Şu anda birden çok tedarikçi tarafından satılmaktadır. Etmektir üst bileşik ek, daha pahalı, mavi-ışık-detectable ticari boya ve Elektroforez, UV veya mavi ışık için algılama1kullanarak sırasında benzer şekilde davranır. Ayrıca, diğer boyalar genel Elektroforez deneyleri için EtBr ya da kime, çok düşük DNA konsantrasyonları daha duyarlı olmakla birlikte, bu tür boyalar çok bağlamlarda çok pahalı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlanması jel
Not: genel Jel Elektroforez iletişim kuralları için Ayrıca bkz: P.Y. Lee, ve ark. 14.
- Özel MIX (~ %1 w/v, yüzde belirli boyut ayrımları için çeşitli) arabelleği (yaklaşık 70 mL Mini jel (8 x 7 cm) için). Arabellekleri sık TAE (tris-asetat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM asetat, 1 mM EDTA, pH yaklaşık 8,6) veya TBE (tris-Bor-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH yaklaşık 8.3) vardır).
- Tiyazol turuncu 1.3 μg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.
- Tiyazol DMSO içinde 10.000 x hisse senedi çözüm (13 mg/mL) yapmak için turuncu geçiyoruz. Özellikle ışığa duyarlı karanlık ne zaman değil içinde kullanma kime saklayın. Bu çözüm için oda sıcaklığında stabil ~ ay; uzun süreli depolama aliquots (DMSO standart buzdolabında buz tutar) dondurarak elde. Tamamen erimeye ve kullanımdan önce dondurulmuş bir çözüm resuspend emin olun.
Not: Jel de kime ile Elektroforez sonra Boyanabilen (bkz. Adım 2.6). Süre için üzerinde arasında etidyum bromür, standart Moleküler Biyoloji Laboratuvarı güvenlik önlemleri saklanması gereken bir güvenlik profili vardır.
- Tiyazol DMSO içinde 10.000 x hisse senedi çözüm (13 mg/mL) yapmak için turuncu geçiyoruz. Özellikle ışığa duyarlı karanlık ne zaman değil içinde kullanma kime saklayın. Bu çözüm için oda sıcaklığında stabil ~ ay; uzun süreli depolama aliquots (DMSO standart buzdolabında buz tutar) dondurarak elde. Tamamen erimeye ve kullanımdan önce dondurulmuş bir çözüm resuspend emin olun.
- Özel, arabellek ve çözülmeye turuncu tiyazol özel karışımı mikrodalga (yaklaşık 60 s). Bu adım çok "erime" olarak adlandırılır. Girdap (5 s) gerekirse dağılmasına yardımcı olmak için.
Not: İçin tercih eğer mikrodalga sonra da eklenebilir. - Özel çözüm kısaca uygun bir tarak içeren jel döküm aparatı dökülen önce soğutmak izin verin.
- Bir jel kuvvetlendirmek özel çözüm izin verin.
2. yükleme ve jel çalıştırma
- Jel Elektroforez cihazı yerleştirmek zaten yüklü değilse.
- Jel yüzeyi kapsayacak şekilde çalışan arabellek (TAE veya yukarıda olarak TBE) ekleyin.
- Bir yükleme boya kullanarak DNA örnekleri (genellikle 10 μL) yükleyin. Bir DNA boyutlandırma merdiven için başvuru içerir.
- Kapak ve elektrotlar (jel kırmızı anot (pozitif) doğru çalıştırılmalıdır) ekleyin.
- Gerilim uygulamak (genellikle ~ 100V mini bir jel için her ne kadar jel boyut gerektirebilir jel zarar önlemek için değiştirilmiş bir gerilim) boya yükleme uygun bir mesafe seyahat etti kadar (yaklaşık 4-7 cm mini bir jel için mesafe bağlı olarak değişebilir rağmen kesin uygulama).
Not: etidyum bromür ve birçok diğer DNA'ya bağlanıcı boyalar gibi tiyazol turuncu olumlu ücret uygulanır. Sonuç olarak, bu boyalar DNA electrophoresing ters yönde geçiş yapacak. Çok gelişmiş ayrılması için jel aşağı çalışan örnekler için sonunda boya zayıf boyama sonucu daha küçük DNA parçalarının ayrı. Bu durumda, jel adım 2.6 olduğu gibi lekeli. Bu durum için kime benzersiz değil, herhangi bir olumlu geri dönülebilir olarak DNA ile etkileşim boya (etidyum bromür, için de dahil olmak üzere ve diğerleri) bu davranışı sergiler hesaplanır. - Eğer öncesinde döküm (Adım 1.2) jel, jel tiyazol turuncu içeren arabellekte çeker tarafından leke için eklenmedi.
- Yeterli arabellek (TAE veya TBE) hazırlamak 1.3 μg/mL tiyazol tamamen jel kapak ve bantları tam olana jel yumuşak ajitasyon ile emmek için turuncu içeren tespit (yaklaşık 20 dakika).
3. görsel tiyazol turuncu özel jel (UV transilluminator) olarak
- Jel Elektroforez cihazları ve UV transilluminator yere kaldırın.
Dikkat: UV ışık cilt ve göz zarar veriyor. Uygun göz (gözlük) ve yüz (yüz kalkan) koruma giymek emin olun. Eller eldiven olmalıdır ve uzun kollu giyilmelidir. - İstenirse, dışarı kesim DNA grup jel (daha fazla sindirim ve ligasyonu, örneğin için) istenen. Jel için UV ışık olarak kısa süreyi mümkün olduğunca eksizyonu sırasında maruz bırakmayın. UV ışığı (DNA boya ne olursa olsun) DNA zarar veriyor.
- DNA bir hazır kit veya protokolü15kullanarak jel dilimden ayıklayın.
4. görselleştirme tiyazol turuncu özel jel (mavi ışık transilluminator veya el feneri)
- Jel Elektroforez cihazları ve yer bir mavi ışık transilluminator (~ 470 nm maksimum emisyon dalga boyları) kaldırın. Alternatif olarak, bir mavi LED (~ 470 nm) el feneri jel (ya yukarıda veya aşağıda), yönetmen.
Not: duyarlılığı bir mavi ışık transilluminator etidyum bromür ile kullanarak daha düşük olmakla birlikte, DNA etidyum bromür ile lekeli bu mavi ışık iletişim kuralını kullanan tespit edilebilir. - Bir kehribar emisyon filtresi (~ 560 nm longpass, gözlük ya da Meydanı) DNA: tiyazol turuncu kompleksleri mavi ışık, Floresans görselleştirme etkinleştirme filtre uygulamak için kullanın.
Not: amber emisyon filtre olmadan yoğunluğu nedeniyle DNA grupları Mavi ışıklı uyarma kaynak çok zor.
Dikkat: mavi ışık akut uzun süreli (UV zıt), dokulara zarar verme yeteneği yoksun rağmen yoğun mavi ışığa maruz kalma gözleri zarar verebilir ve kehribar emisyon gözlük ya da filtre kullanılmalıdır. - İsterseniz, daha fazla uygulama için jel istenilen DNA grup kesip.
Not: mavi ışık DNA zarar vermez beri bu hızla bantları kesmek gerekli değildir (örneğin UV uyarma adım 3.2 kullanarak). - DNA bir hazır kit veya protokolü15kullanarak jel dilimden ayıklayın.
5. resim yakalama
- Uygun uyarma ve emisyon ayarları jel görüntüleme cihaz seçin. Uyarma ve emisyon tiyazol Orange (λeski, max 510 = nm (488 nm ve 470 nm da göstermek yanı sıra UV dalga boylarında, güçlü uyarma güçlü uyarma); λem 527 = nm) ortak mavi-ışık-detectable reklama neredeyse aynıdır boya, aletler kullanılabilir filtre ayarlarını önceden ayarlamak bu yüzden.
Not: Mavi-ışık-detectable ticari boyalar için bazı filtre ayarları aslında zararlı UV ışığı uyarma için kullanmak, yani bantları kesmek önce Imaging Eğer dikkatli olun. Mavi ışıklı uyarma kaynak mümkünse DNA bantları görüntüleme sonra eksize kullanın. - Bir görüntüleme sistemi ile uygun süzgeçleri yokluğunda, kamera ve jel/mavi ışık uyarma kaynak arasında kehribar bir filtre yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tiyazol turuncu DNA, algılama arasında etidyum bromür kullanmadan ve DNA zararlı UV ışık kullanmadan sağlar. Etidyum bromür laboratuardan ortadan kaldırarak avantajlı olabilir mutajenik, olmak iyi bilinmektedir. UV ışık DNA zarar ve mavi ışık DNA zarar vermez ise dönüşüm verimliliği önemli ölçüde düşürür. Algılama sınırları arasında etidyum bromür, tiyazol portakal ve bir ortak, mavi-ışık-algılanabilir ticari DNA boya arasında benzer (şekil 1, Tablo malzemelerigörmek), tüm üç boyalar ~ 1-2 olmak için algılama sınırı ile ng/mini bir jel şeritte 1.
Restriksiyon enzimi sindirilmiş bant kesmek gibi ortak uygulamalar için tiyazol turuncu özellikle uygundur. DNA tespiti Mavi ışıklı uyarma ile sağlam ve kolay olduğunu ve bilim adamı gibi UV ışık ile tespit eğer DNA tüketim için acele gerekmez. Bir plazmid bir ekleme yalıtmak için enzimleri ile kesildi (Şekil 2, bir jel olan görüntülü üç farklı şekilde). Ekle ek olarak UV Işınlarına maruz kalma da DNA hasar korkusu gerçekleşmesi aşağı akım uygulamaları izin UV, mavi ışık ile kime ile kolayca detectable olur.
Resim 1 . Tiyazol portakal, ortak mavi-ışık-detectable ticari DNA boya ve etidyum bromür mavi veya UV ışık kullanarak kullanarak DNA tespiti. Jel dilim görüntüleri temsil jel arasında DNA'ın 120-ng grubun iki kat seyreltme (grubudur 2-günlük merdiven 3,0 kb grubudur). Bu rakam izniyle çoğaltılamaz O'Neil, vd.1, üzerinden değiştirildi. O'Neil, et al.1 denemenin tam detayları için bkz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Aynı tiyazol turuncu lekeli özel jel bir kısıtlama Özet, birden çok görüntüsünü. (a) uyarma ile UV transilluminator. (B) uyarma ile mavi ışık transilluminator. (C) uyarma (hangi ucu biraz, alt görüntüdeki yak²n görülüyor) mavi ışık el feneri ile. Lane 1:2-günlük merdiven, toplam DNA'ın 1 μg (3,0 kb, 1.0 kb ve 0.5 kb büyük bantları etiketlenir). Lane pEF-GFP plazmid DNA (5.1 kb) 2: 0,5 μg sindirilmiş HindIII ile (beklenen 5.1 kb boyutu). Lane 3: 0,5 μg pEF-GFP ve sindirilmiş HindIII ve EcoRI ile (beklenen boyutları: 3.7 kb, 1.3 kb). Jel ile 1.3 μg/mL tiyazol jel içinde portakal çalıştırıldı. Standart emisyon filtre kullanılarak yapılan tüm görüntüleri (590/110 nm), yoğun bantları için optimize pozlama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Etidyum bromür uzun moleküler biyoloji laboratuarında bilinen toksisite rağmen standart bir araç olmuştur. Bu da tespit edilmeden gibi DNA zarar UV ışık gerektirmelerini yaşanıyor. Tiyazol turuncu etidyum bromür, aynı zamanda yararlı ama pahalı ticari boyalar için ucuz bir alternatif sunmaktadır.
Tiyazol turuncu faydaları böylece iki kat vardır. İlk olarak, tiyazol turuncu sadece etidyum bromür için bir yedek olarak kullanılabilir. Jelleri aynı şekilde leke (Adım 1.2) yerine kime ile EtBr için hazır olun. Algılama sınırları benzer (~ 1-2 ng/lane)1. Hiçbir ek donanımları tiyazol turuncu EtBr gibi (Adım 3) UV ışığıyla tespit edilebilir çünkü boya geçmek için gereklidir. UV ışığı hızla DNA, zarar ancak ve maruz ligasyonu ve dönüşüm1gibi aşağı akım deney başarısız olmasına neden. UV ışık da cilt ve göz, dikkatli güvenlik önlemleri gerektiren zarar veriyor.
Kime ikinci yararı UV uyarma uzak döşeme imkanı sunuyor olmasıdır. Mavi ışık (Adım 4 ile adım 3 değiştirme) ile algılama DNA hasarı ortadan kaldırır ve bilim adamı için risk sınırlar. Mavi ışıklı uyarma ve kime tespiti bir mavi ışık transilluminator ve de ucuz bir mavi LED el feneri ile elde edilebilir (her iki ~ 470 nm maksimum emisyon dalga boyu, her iki bir kehribar emisyon filtre gerektiren). Uyarma dalga boylarında (Adım 4.1) ve emisyon filtreler (Adım 4.2) uygun uygulama deney başarısı için önemlidir (Ayrıca bkz: adım 5.1). Işık kaynakları ve emisyon filtreleri ancak, kullanılabilir, ve en az yatırım ile labs Mavi ışıklı uyarma avantajlara ve UV ışık zarar görmemesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Christopher Newport Üniversitesi'nden TDG için başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
- O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis. Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).
- McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).
- Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. 1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange. The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).
- Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. Molecular Probes, Inc. , USA. WO/2005/0333342 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light. Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157 (1988).
- Hartman, P. S. Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies. BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).
- Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis. Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).
- Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA. Biopolymers. , 1-13 (1998).
- Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution. Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).
- Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA. Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).
- Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system. Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).
- Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers. Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
