Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Thiazole orange für den Nachweis von DNA in Gel-Elektrophorese Experimente verwenden. Die Verwendung von Thiazole Orange ermöglicht Beseitigung der Interkalation Bromid und Fluoreszenz-Detektion mit UV oder blaues Licht erreicht werden.
Abstract
DNA Gelelektrophorese mit Agarose ist ein gemeinsames Tool im molekularbiologischen Labor, Trennung von DNA-Fragmenten durch Größe. Nach der Trennung ist DNA durch Färbung sichtbar gemacht. Dieser Artikel veranschaulicht, Thiazole orange Fleck DNA zu nutzen. Thiazole Orange im Vergleich zu gemeinsamen Färbung Methoden, insofern er empfindlich, kostengünstig, leicht erregbaren mit UV- oder blaues Licht (zum Beispiel Schäden zu verhindern) und sicherer als Interkalation Bromid. Labs bereits ausgestattet, um DNA Elektrophorese Experimente mit Interkalation Bromid laufen können in der Regel Farbstoffe mit keine zusätzlichen Änderungen in bestehenden Protokolle, mit UV-Licht zur Erkennung. Blaulicht-Erkennung zu Probe vermeiden kann zusätzlich mit einem Blaulicht-Quelle und Emission Filter erreicht werden. Labs bereits für Blaulicht-Erkennung ausgestattet können einfach Farbstoffe mit keine zusätzlichen Änderungen in bestehenden Protokolle.
Introduction
Der Zweck dieser Methode ist, DNA in Agarose-Gele mit Thiazole orange (bis) für Fluoreszenz-Detektion zu identifizieren. Wegen seiner niedrigen Kosten und günstige Sicherheitsprofil Thiazole Orange sehen möglicherweise besonderen Vorteil grundständige Lehre Labs und Forschungslabors Durchführung Molekularbiologie, insbesondere Verbindlichkeiten und Klonen.
Interkalation Bromid bleibt der am häufigsten verwendete Farbstoff für die Erkennung von DNA in Agarose-Gele. Dies ist vor allem, weil es sehr kostengünstig bezogen werden kann und erfordert nur Anregung mit UV-Licht zur Erkennung. Beide Interkalation Bromid und Thiazole Orange sind billig, mit niedrigen Erkennung Grenzen (1 bis 2 ng/Bahn)1. Es gibt zwei Hauptnachteile Interkalation Bromid, jedoch zu, denen auf Thiazole Orange verbessert.
Erstens Interkalation Bromid ist ein Mutagen2 mit Sonderbehandlung, Lieferung und Entsorgung Anforderungen, während Thiazole Orange weniger Mutagene (3 – 4 X weniger erbgutverändernd im Ames-Test)3,4 und in der Regel mit entsorgt werden allgemeine chemische Abfälle.
Zweitens erfordert die Interkalation Bromid UV-Licht zur Erkennung. Thiazole Orange kann ähnlich wie UV-Licht, falls gewünscht, aber auch mit blauem Licht erkannt werden. UV-Licht, hat während allgemein verwendet, ein paar markante Nachteile. Erstens ist es schädlich für menschliche Haut und Augen. Während UV-Licht sicher von ausgebildeten Fachleuten verwendet werden kann, Haut oder Auge Unfallschäden (funktionell ähnlich Sonnenbrand) vom Labor UV-Licht sind nicht ungewöhnlich, vor allem bei unerfahrenen Wissenschaftler. Zweitens ist UV-Licht äußerst schädlich für DNA-Proben5, die den Erfolg von nachgelagerten Experimente (z. B. Ligatur und Transformation)1,6,7reduziert. TO ermöglicht die Erkennung mit blauem Licht (λEx, max = 510 nm (488 nm und 470 nm zeigen auch starke Erregung)), die verursacht keine Schädigung der Haut oder DNA schädigen (obwohl kein intensives Licht möglicherweise noch schädlich für die Augen), stark verringern die Risiken für beide der Wissenschaftler und der Probe.
Ist nicht nur Fluoreszenzfarbstoff-Alternative zur Interkalation Bromid; sein Vorteil ist Kosten. In den 1980er Jahren als eine Retikulozytenzahl Fleck8entdeckt wurde, und hat in einer Reihe von DNA-basierten Fluoreszenz Experimente9,10,11,12,13Dienstprogramm gefunden. Es wird derzeit von verschiedenen Anbietern verkauft. Ist die Ausgangssubstanz von zusätzlicher, teurer, blau-Licht – nachweisbar kommerzielle Farbstoffe, und verhält sich ähnlich wie während der Elektrophorese, mit UV- oder blaues Licht für Erkennung1. Während andere Farbstoffe empfindlicher auf sehr geringen DNA-Konzentrationen als EtBr oder TO, für generische Elektrophorese Experimente sind, sind darüber hinaus solche Farbstoffe unerschwinglich teuer in vielen Kontexten.
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Protocol
1. Vorbereitung des Gels
Hinweis: Für allgemeine Gel-Elektrophorese-Protokolle, siehe auch Baujahr Lee Et Al. 14.
- Mischen Sie Agarose (~ 1 % w/V, Prozentsatz variiert werden, für bestimmte Größe Trennungen) im Puffer (ca. 70 mL für ein Mini-Gel (8 x 7 cm)). Puffer sind häufig TAE (Tris-Acetat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM Acetat, 1 mM EDTA, pH-Wert ca. 8,6) oder FSME (Tris-Borat-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH-Wert ca. 8,3)).
- Hinzu kommt eine Endkonzentration von 1,3 μg/mL Thiazole orange.
- Lösen Sie Thiazole orange in DMSO zu einer 10.000 X Vorratslösung (13 mg/mL auf). Während nicht besonders lichtempfindlich speichern bis in die dunklen, wenn nicht in Gebrauch. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur stabil ~ Monate; langfristiger Lagerung kann durch Einfrieren Aliquote (DMSO wird im standard Kühlschrank Einfrieren) erreicht werden. Achten Sie darauf, vollständig schmelzen und erneut eine gefrorene Lösung vor Gebrauch.
Hinweis: Das Gel kann auch auch gebeizt mit TO nach Elektrophorese (siehe Punkt 2.6). Weile, hat ein verbessertes Sicherheitsprofil über Interkalation Bromid, standard Molekularbiologie Labor Sicherheits-Vorkehrungen sollte beibehalten werden.
- Lösen Sie Thiazole orange in DMSO zu einer 10.000 X Vorratslösung (13 mg/mL auf). Während nicht besonders lichtempfindlich speichern bis in die dunklen, wenn nicht in Gebrauch. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur stabil ~ Monate; langfristiger Lagerung kann durch Einfrieren Aliquote (DMSO wird im standard Kühlschrank Einfrieren) erreicht werden. Achten Sie darauf, vollständig schmelzen und erneut eine gefrorene Lösung vor Gebrauch.
- Mikrowellen-die Mischung aus Agarose, Puffer- und Thiazole orange aufzulösen Agarose (ca. 60 s). Dieser Schritt ist gemeinhin als "schmelzen". Wirbel (5 s), Auflösung unterstützen, wenn nötig.
Hinweis: Um auch nach der Mikrowelle auf Wunsch hinzugefügt werden können. - Lassen Sie die Agarose-Lösung kurz vor dem Gießen in Gel Gießvorrichtung mit einem geeigneten Kamm abkühlen.
- Lassen Sie die Agarose-Lösung zu einem Gel zu festigen.
(2) laden und Ausführen der gel
- Legen Sie das Gel in der Elektrophorese-Apparatur, falls nicht bereits vorhanden.
- Fügen Sie laufenden Puffer (TAE oder FSME als oben) auf um die Oberfläche des Gels zu decken.
- Laden Sie DNA-Proben (üblicherweise 10 μL) mit einem Farbstoff beladen. Enthalten Sie eine DNA-Dimensionierung Leiter als Referenz.
- Befestigen Sie die Abdeckung und Elektroden (das Gel sollte in Richtung der roten Anode (positive) ausgeführt werden).
- Spannung anlegen (in der Regel ~ 100V für ein Mini-Gel, obwohl Größe des Gels erfordern eine veränderte Spannung, damit das Gel nicht beschädigt) bis laden Farbstoff eine angemessene Distanz zurückgelegt hat (ca. 4-7 cm für ein Mini-Gel, obwohl Abstand variieren je nach präzise Anwendung).
Hinweis: Wie Interkalation Bromid und viele andere DNA-bindende Farbstoffe, Thiazole Orange ist positiv geladen. Infolgedessen werden diese Farbstoffe in die entgegengesetzte Richtung der electrophoresing DNA migriert. Für Proben, die das Gel für verbesserte Trennung weit heruntergekommen sind, wird schließlich der Farbstoff aus den kleineren DNA-Fragmenten, was schwache Färbung trennen. In diesen Fällen sollte das Gel wie in Schritt 2.6 befleckt werden. Diese Situation ist nicht eindeutig an, einer positiv geladenen, Farbstoff, der reversibel mit DNA interagiert wird dieses Verhalten (einschließlich Interkalation Bromid zu, und andere) aufweisen. - Wenn nicht hinzugefügt wurde vor dem Gießen (Schritt 1.2) gel, Flecken durch das Gel in den Puffer mit Thiazole orange eintauchen.
- Bereiten Sie genügend Puffer (TAE oder FSME) mit 1,3 μg/mL Thiazole orange vollständig bedecken das Gel und das Gel mit sanften Agitation zu tränken, bis die Bänder voll sind (ca. 20 min) erkannt.
(3) Visualisierung von Thiazole orange Agarose-Gel (UV-Transilluminator)
- Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Apparatur und auf einem UV-Transilluminator.
Achtung: UV-Licht ist schädlich für Haut und Augen. Achten Sie darauf, entsprechende Augen (Brille) und Gesichtsschutz (Gesichtsschutz) tragen. Hände sollten Handschuhe und lange Ärmel getragen werden sollte. - Falls gewünscht, auf Wunsch ausgeschnittenen DNA-Bänder aus dem Gel (für weitere Verdauung oder Ligatur, zum Beispiel). Dem Gel, UV-Licht für möglichst kurze eine Zeitspanne wie möglich während Exzision aussetzen. UV-Licht (unabhängig von der DNA-Farbstoff) schädigt die DNA.
- Extrahieren Sie DNA aus dem Gel-Scheibe mit einem leicht zugänglich-Kit oder Protokoll15.
(4) Visualisierung von Thiazole orange Agarose-Gel (Blaulicht-Transilluminator oder Taschenlampe)
- Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Apparatur und auf ein Blaulicht-Transilluminator (~ 470 nm maximale Emissionswellenlänge). Alternativ, eine blaue LED (~ 470 nm) Taschenlampe kann auf das Gel (entweder von oben oder unten) gerichtet sein.
Hinweis: Während Empfindlichkeit Interkalation Bromid ein Blaulicht-Transilluminator mit niedriger ist, kann DNA befleckt mit Interkalation Bromid nachgewiesen werden mit diesem Blaulicht-Protokoll. - Verwenden Sie einen gelbe Emission Filter (~ 560 nm Langpass-, Schutzbrillen oder Quadrat), um blaues Licht, ermöglicht die Visualisierung der Fluoreszenz zu filtern aus DNA: Thiazole orange-komplexe.
Hinweis: Ohne den Bernstein Emission Filter ist es sehr schwer zu DNA-Bänder aufgrund der Intensität der Blaulicht-Anregungsquelle erkennen.
Vorsicht: Obwohl Blaulicht die Fähigkeit fehlt, akut schädigen Gewebe (kontrastierende UV), verlängert Belastung durch intensives blaues Licht könnte schädlich für Augen und Bernstein Emission Schutzbrille oder Filter sollte verwendet werden. - Falls gewünscht, Ausschneiden der gewünschten DNA-Bänder aus dem Gel für weitere Anwendungen.
Hinweis: Da blaues Licht nicht DNA beschädigen, es ist nicht notwendig Bänder schnell Ausschneiden (z. B. bei Verwendung von UV-Anregung in Schritt 3.2). - Extrahieren Sie DNA aus dem Gel-Scheibe mit einem leicht zugänglich-Kit oder Protokoll15.
5. die Bilderfassung
- Wählen Sie die entsprechenden Anregung und Emission Einstellungen in Gel-Imaging Apparatur. Die Anregung und Emission von Thiazole Orange (λEx, max = 510 nm (488 nm und 470 nm zeigen auch starke Erregung, neben der starken Erregung bei UV-Wellenlängen); λEm = 527 nm) sind nahezu identisch mit gemeinsamen blau-Licht – nachweisbar Werbespot Farbstoffe, so dass Instrumente Filtereinstellungen voreingestellt haben können, die verwendet werden können.
Bemerkung: Einige Filter-Einstellungen für blau-Licht – nachweisbar kommerzielle Farbstoffe tatsächlich schädliche UV-Licht zur Anregung, also Vorsicht, wenn vor dem Ausschneiden Bands imaging. Verwenden Sie wenn möglich ein Blaulicht Anregungsquelle, wenn DNA-Bänder nach dem Imaging herausgeschnitten werden. - Legen Sie in Ermangelung eines abbildenden Systems mit entsprechenden Filtern einen Bernstein-Filter zwischen der Kamera und die Gel/Blaulicht-Anregungsquelle.
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Representative Results
Thiazole Orange ermöglicht die Erkennung von DNA, ohne Verwendung von Interkalation Bromid und ohne Verwendung von DNA-schädigenden UV-Licht. Interkalation Bromid ist bekannt, mutagene, so vorteilhaft, aus dem Labor zu eliminieren sein kann. UV-Licht schädigt DNA und senkt Transformationseffizienz deutlich, während blaues Licht DNA nicht beschädigt wird. Nachweisgrenzen sind ähnlich zwischen Interkalation Bromid, Thiazole Orange und ein gemeinsames, blau-Licht – nachweisbar kommerzielle DNA-Farbstoff (Abbildung 1, siehe Tabelle der Materialien), mit der Nachweisgrenze für alle drei Farbstoffe werden ~ 1-2 ng/Bahn in einem Mini-Gel 1.
Für gängige Anwendungen wie Ausschneiden ein Restriktionsenzym verdaut Band ist Thiazole Orange besonders gut geeignet. Nachweis von DNA mit Blaulicht-Anregung ist robust und unkompliziert, und der Wissenschaftler muss nicht zur Eile, um DNA Verbrauchssteuern wie sie wäre, wenn mit UV-Licht zu erkennen. Ein Plasmid wurde geschnitten, mit Restriktionsenzymen, Beilage zu isolieren (Abbildung 2, ein Gel ist abgebildet auf drei verschiedene Arten). Die Einlage ist leicht nachweisbar mit TO mit blauem Licht neben UV, wodurch nachgelagerte Anwendungen ohne Angst vor Schäden an der DNA von UV-Exposition auftreten.
Abbildung 1 . Nachweis von DNA mit Hilfe Thiazole Orange, eine gemeinsame blau-Licht – nachweisbar kommerzielle DNA-Farbstoff und Interkalation Bromid mit blau oder UV-Licht. Gel-Schnittbilder repräsentieren die zweifache Verdünnung einer 120-ng Bande von DNA in das Gel (Band ist eine 3,0 kb-Band 2-Protokoll Leiter). Diese Zahl wurde von O' Neil, Et Al.1, reproduziert mit Erlaubnis verändert. O' Neil, Et Al.1 für komplette Details des Experiments zu sehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Mehrere Bilder des gleichen Thiazole Orange gefärbten Agarose Gels von einer Beschränkungsauswahl. (A) Anregung mit UV-Transilluminator. (B) Anregung mit blauem Licht Transilluminator. (C) Anregung mit blauem Licht Taschenlampe (die Spitze ist leicht sichtbar, unscharf, im Bild unten). Bahn 1:2-Protokoll Leiter, 1 μg Gesamt-DNA (3,0 kb, 1,0 kb und 0.5 kb großen Bands sind beschriftet). Spur 2: 0,5 μg des pEF-GFP Plasmid DNA (5,1 kb) verdaut mit HindIII (erwartete Größe 5,1 kb). Spur 3: 0,5 µg der pEF-GLP verdaut mit HindIII und EcoRI (erwartet Größen: 3,7 kb, 1,3 kb). Gel wurde mit 1,3 μg/mL Thiazole orange im Gel laufen. Alle Bilder mit standard Emission Filter (590/110 nm), Belichtung optimiert für intensive Bands. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Interkalation Bromid ist seit langem ein Standardwerkzeug in der molekularbiologischen Labor, trotz bekannten Toxizität. Es leidet auch unter UV-Licht, die die DNA schädigt, da es erkannt wird, erfordern. Thiazole Orange bietet eine kostengünstige Alternative zur Interkalation Bromid, sowie nützliche, aber teure kommerzielle Farbstoffe.
Die Vorteile von Thiazole Orange sind somit zwei-Fach. Thiazole Orange ist zunächst nur als Ersatz für die Interkalation Bromid einsetzbar. Gele können identisch zu EtBr mit TO ersetzt als der Fleck (Schritt 1.2) zubereitet werden. Nachweisgrenzen sind ähnlich (~ 1-2 ng/Bahn)1. Keine zusätzliche Ausrüstung ist erforderlich, um Farbstoffe zu wechseln, da Thiazole Orange mit UV-Licht (Schritt 3) wie EtBr erkannt werden kann. Exposition gegenüber UV-Licht schnell schädigt DNA, jedoch und kann dazu führen, dass Versagen der nachgeschalteten Experimente wie Ligatur und Transformation1. UV-Licht ist auch schädlich für Haut und Augen, erfordern sorgfältige Sicherheitsvorkehrungen.
Der zweite Vorteil des TA ist, dass es die Möglichkeit der Verlagerung weg von UV-Anregung bietet. Erkennung mit blauem Licht (anstelle von Schritt 3 Schritt 4) verhindert Schäden an der DNA und Risiko der Wissenschaftler. Blaulicht-Anregung und Erkennung von TO erreicht werden mit einem Blaulicht-Transilluminator, sowie eine preiswerte blaue LED-Taschenlampe (beide ~ 470 nm maximale Emissionswellenlänge, beide erfordern einen Bernstein Emission Filter). Entsprechende Anwendung der Erregung Wellenlängen (Schritt 4.1) und Emission Filter (Schritt 4.2) ist entscheidend für den Erfolg des Experiments (siehe auch Punkt 5.1). Lichtquellen und Emission Filter sind leicht zugänglich, aber, und mit minimaler Investition Labs können die Vorteile der Blaulicht-Anregung und UV-Licht Schäden zu vermeiden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Startup-Fonds zu TDG von Christopher Newport University unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
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