Summary
여기, 선물이 젤 전기 이동 법 실험에서 DNA의 검출을 위한 thiazole 오렌지를 사용 하는 프로토콜. Thiazole 오렌지의 사용 ethidium 평범한 사람의 제거를 허용 하 고 형광 탐지 UV 또는 푸른 빛으로 달성 될 수 있다.
Abstract
DNA 젤 전기 이동 법은 agarose를 사용 하 여 크기에 의해 DNA 파편의 분리를 수 분자 생물학 실험실에서 일반적인 도구입니다. 분리 후 DNA 얼룩에 의해 시각 이다. 이 문서에서는 thiazole 주황색 얼룩을 DNA를 사용 하는 방법을 보여 줍니다. Thiazole 오렌지 비교 호의 일반적인 착 방법, 그것은, 저렴 한, UV 또는 파란 빛 (손상을 방지 하기 위해 샘플), 고르기 민감하고 ethidium 평범한 사람 보다 안전 합니다. 이미 DNA 전기 영동 실험 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 실행을 갖추고 실험실 일반적으로 자외선을 사용 하 여 검색에 대 한 기존 프로토콜을 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다. 블루 빛 감지 샘플의 손상을 방지 하려면 블루 빛 소스와 배출 필터 또한 얻을 수 있습니다. 이미 블루 빛 감지 장비 실험실 단순히 기존 프로토콜 추가 변경 없이 염료를 전환할 수 있습니다.
Introduction
이 방법의 목적은 agarose 젤 형광 탐지 thiazole 오렌지 (을)를 사용 하 여 DNA를 식별 하는 것입니다. 그것의 저가 및 유리한 안전 프로필로 인해 thiazole 오렌지 학부 교육 연구소 및 분자 생물학, 특히 ligations 및 복제를 수행 하는 연구 실험실에서 특정 혜택을 볼 수 있습니다.
Ethidium 평범한 사람 agarose 젤에서 DNA의 검출에 대 한 가장 일반적인 염료 남아 있습니다. 이 매우 저렴 하 게 얻을 수 있습니다 때문에 주로 하며만 자외선과 여기 검색. 두 ethidium 평범한 사람 및 thiazole 오렌지 낮은 검출 한계 (1-2 ng/레인)1비싼 되지 않습니다. 그러나 Thiazole 오렌지 시 향상 ethidium 평범한 사람,,에 두 가지 주요 단점이 있다.
첫째, ethidium 평범한 사람은 특수 처리, 운송, 및 처리 요구 사항, 돌연2 thiazole 오렌지는 덜 돌연변이 (3-4 x 덜 Ames 시험에서 변이 원 성)3,4 와 일반적으로 삭제 될 수 있습니다 일반적인 화학 폐기물입니다.
둘째, ethidium 평범한 사람 검색 UV를 빛을 필요합니다. Thiazole 오렌지 바란다면, UV 빛 마찬가지로 사용할 수 있습니다 하지만 또한 푸른 빛으로 검출 될 수 있습니다. UV 빛, 일반적으로 사용 되는 몇 가지 두드러진 단점이 있습니다. 첫째, 그것은 인간의 피부와 눈에 손상 이다. UV 빛은 숙련 된 전문가 의해 안전 하 게 사용할 수 있습니다, 하는 동안 사고 피부 또는 눈 손상 (기능적으로 비슷합니다 sunburns) 실험실 UV 빛에서 미숙한 과학자와 특히 흔히 되지 않습니다. 둘째, 자외선은 DNA 샘플5, (결 찰 및 변환) 등 다운스트림 실험1,,67의 성공을 감소 시키는 매우 파괴적 이다. TO 있습니다 푸른 빛으로 감지 (λ전, 최대 510 = nm (488 nm 및 470 nm도 강한 흥분을 표시))는 피부 손상의 원인이 되지 않습니다, 또는 DNA 손상 (하지만 어떤 강렬한 빛은 여전히 눈에 해로울 수 있습니다), 두 과학자를 위험을 크게 감소 그리고 샘플입니다.
아니다 ethidium 평범한 사람;에 형광 염료 대안 그것의 이점은 비용입니다. Reticulocyte 얼룩8, 1980 년대에서 발견 되었다 및 다양 한 형광 DNA 기반 실험9,10,11,,1213에 유틸리티를 발견 했다. 그것은 현재 여러 공급 업체에 의해 판매 됩니다. 추가 하 고, 더 비싼의 부모 화합물, 파랑-빛-감지 상업 염료 이며 탐지1UV 또는 푸른 빛을 사용 하 여 전기 이동 법 동안 유사 하 게 동작. 또한, 다른 염료 보다 더 민감한 DNA 농도 매우 낮은 EtBr 또는, 일반 전기 실험에 대 한 동안, 같은 염료는 많은 상황에서 엄청나게 비싸다.
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Protocol
1. 젤을 준비
: 일반 젤 전기 이동 법 프로토콜에 대 한 참고 또한 P.Y.이, 외 알. 14.
- Agarose를 혼합 (~ 1 %w / v, 비율 특정 크기 분판 변화 될 수 있다) 버퍼 (미니 젤 (8 x 7 cm) 약 70 mL). 버퍼는 일반적으로 태 (40 mM Tris, 20mm 아세테이트, 트리 스-아세테이트-EDTA, 1 m m EDTA, pH 약 8.6) 또는 TBE (90mm 트리 스, 90mm borate, 트리 스-borate-EDTA, 2 m m EDTA, pH 약 8.3))입니다.
- 1.3 μ g/mL의 최종 농도에 thiazole 오렌지를 추가 합니다.
- Thiazole 10000 x 재고 솔루션 (13 mg/mL) DMSO에 오렌지를 분해. 특히 빛에 민감한, 동안에 사용 중인 어두운 때에 저장 합니다. 이 솔루션에 대 한 실내 온도에 안정 되어 ~ 개월; 장기 저장 aliquots (DMSO 표준 냉장고에서 얼어) 동결에 의해 달성 될 수 있습니다. 완전히 녹기 하 고 사용 하기 전에 냉동된 솔루션 resuspend 해야 합니다.
참고: 젤 또한 얼룩이 질 수 있다를 가진 전기 이동 법 후 (단계 2.6 참조). 향상 된 안전성 프로필 ethidium 평범한 사람, 표준 분자 생물학 실험실 안전 조치를 유지 한다 있다 하는 동안.
- Thiazole 10000 x 재고 솔루션 (13 mg/mL) DMSO에 오렌지를 분해. 특히 빛에 민감한, 동안에 사용 중인 어두운 때에 저장 합니다. 이 솔루션에 대 한 실내 온도에 안정 되어 ~ 개월; 장기 저장 aliquots (DMSO 표준 냉장고에서 얼어) 동결에 의해 달성 될 수 있습니다. 완전히 녹기 하 고 사용 하기 전에 냉동된 솔루션 resuspend 해야 합니다.
- 전자 레인지 agarose, 버퍼, 그리고 해산 오렌지 thiazole agarose의 혼합물 (약 60 s). 이 단계는 일반적으로 "녹는"로 참조. 소용돌이 (5 s) 필요한 경우 해산을 원조 하기 위하여.
: 참고 선호 하는 경우 microwaving 후 추가할 수 있습니다. - 짧게 젤 캐스팅 장치 포함 하는 적절 한 빗으로 하 고 있는걸 전에 냉각 agarose 솔루션을 수 있습니다.
- 젤으로 공고히 agarose 솔루션을 수 있습니다.
2. 로드 및 실행 하는 젤
- 젤 전기 이동 법 기구에 배치 하지 않는 경우 이미 존재.
- 젤의 표면을 커버를 실행 버퍼 (태 또는 이상으로 TBE)를 추가 합니다.
- DNA 샘플 (일반적으로 10 μ) 로드 염료를 사용 하 여 로드 합니다. 참조에 대 한 DNA 크기 사다리를 포함 합니다.
- 커버와 전극 (젤 빨간 양극 (긍정적인)으로 실행 해야 합니다) 첨부 합니다.
- 전압을 적용 (일반적으로 ~ 100V 미니 젤 젤의 크기는 비록 젤 손상을 방지 하기 위해 수정 된 전압 필요할 수 있습니다) 적절 한 거리를 여행 했다 염료 로드 될 때까지 (미니 젤에 대 한 대략 4-7 cm 거리에 따라 다를 수 있지만 정확한 응용 프로그램)입니다.
참고: ethidium 평범한 사람 그리고 많은 다른 DNA 바인딩 염료, 같은 thiazole 오렌지 긍정적으로 위탁 된다. 따라서, 이러한 염료 electrophoresing DNA의 반대 방향으로 마이그레이션됩니다. 향상 된 분리 젤 아래까지 실행 되는 샘플에 대 한 결국 염료 약한 얼룩이 발생 하는 작은 DNA 조각에서 분리 됩니다. 이러한 경우에는 젤 단계 2.6에서 얼룩이 질 한다. 이 상황 하에 고유 하지 않습니다, 그리고 어떤 긍정적으로 위탁 역 DNA와 상호 작용 하는 염료 (ethidium 평범한 사람를 포함 하 여, 등)이이 동작을 전시할 예정 이다. - 만약에 이전 주조 (1.2 단계) 젤, 젤 thiazole 오렌지를 포함 하는 버퍼에 immersing 하 여 얼룩에 추가 되지 않았습니다.
- 충분 한 버퍼 (TAE 또는 TBE) 준비 (약 20 분)를 감지 1.3 μ g/mL thiazole 젤 커버 하 고 밴드는 완전히 때까지 부드러운 동요와 젤을 담가 완전히 오렌지를 포함 하.
3. thiazole 오렌지 agarose 젤 (UV transilluminator)의 시각화
- 젤 전기 이동 법 기구 및 UV transilluminator에 제거 합니다.
주의: 자외선은 피부와 눈에 손상 이다. 얼굴 (얼굴 방패) 보호 및 적절 한 눈 (고글)을 착용 해야 합니다. 손 장갑 하 고 긴 소매를 착용 한다. - 원하는 경우, 잘라 원하는 (대 한 더 소화 또는 결 찰, 예를 들면) 젤에서 DNA 밴드. 절단 동안 UV 빛에 대 한 짧은에 젤 가능한 시간의 길이 표시 합니다. UV 빛 (DNA 염료)에 DNA를 손상 한다.
- 쉽게 사용할 수 있는 키트 또는 프로토콜15를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 합니다.
4. thiazole 오렌지 agarose 젤 (블루 빛 transilluminator 또는 손전등)의 시각화
- 젤 전기 이동 법 기구 및 블루 빛 transilluminator (~ 470 nm 최대 방출 파장)에 장소에서 제거 합니다. 또는, 파란색 LED (~ 470 nm) 손전등 젤 (중에서 위 또는 아래)에서 지시 될 수 있다.
참고: 감도 블루 빛 transilluminator ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 낮은, ethidium 평범한 사람으로 물 DNA 감지할 수 있습니다이 블루 빛 프로토콜을 사용 하 여. - 푸른 빛, 형광의 시각화를 사용 하면 필터링 황색 방출 필터 (~ 560 nm longpass, 사각형 또는 고글)를 사용 하 여 DNA: thiazole 오렌지 복합물에서.
참고: 주황색 방출 필터 없이 그것 매우 어렵습니다 블루 빛 여기 소스의 강도 때문에 DNA 밴드를 검출 하기 위하여.
주의: 푸른 빛 심하게 손상 조직 (UV 대조), 장기 능력 부족 하지만 강렬한 푸른 빛에 노출 눈 손상 될 수 있습니다 그리고 주황색 방출 고글 또는 필터를 사용 해야 합니다. - 원하는 경우 추가 응용 프로그램에 대 한 젤에서 원하는 DNA 밴드를 잘라.
참고: 이후 블루 라이트 팬 들은 DNA의 정보를 손상 하지 않습니다, 그것은 급속 하 게 밴드를 잘라 하는 데 필요한 (때와 같은 단계 3.2에서에서 UV 여기를 사용 하 여). - 쉽게 사용할 수 있는 키트 또는 프로토콜15를 사용 하 여 젤 조각에서 DNA를 추출 합니다.
5. 이미지 캡처
- 젤-이미징 장치에 적절 한 여기 및 방출 설정을 선택 합니다. 여기 및 thiazole 오렌지의 방출 (λ전, 최대 510 = nm (488 nm와 470 nm 자외선 파장에서 강한 여기 뿐만 아니라 강한 여기 표시); λem = 527 nm) 일반적인 블루 빛-감지 상업 사용 하는 염료 변경, 그래서 악기 필터 설정을 사용할 수 있는 미리 있습니다.
참고: 블루-빛-감지 상업 염료에 대 한 일부 필터 설정을 실제로 유해한 UV 빛을 사용 하 여 여기, 그래서 밴드 절단 전에 이미징 하는 경우 주의 사용. DNA 밴드 영상 후 excised 됩니다 때 블루 빛 여기 소스를 가능 하면 사용 합니다. - 적절 한 필터와 이미징 시스템의 부재에서 카메라와 젤/블루 라이트 여기 소스 사이 황색 필터를 놓습니다.
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Representative Results
Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 사용 하지 않고 고 DNA 손상 자외선을 사용 하지 않고 DNA의 검색을 수 있습니다. Ethidium 평범한 사람은 변이 원 성, 되 고 그래서 실험실에서 그것을 제거 하는 유리한 수 있습니다. UV 빛 DNA를 손상 하 고 파란 빛은 DNA를 손상 하지 않습니다 반면 크게, 변환 효율을 낮춘 다. 검출 한계는 ethidium 평범한 사람, thiazole 오렌지, 일반적인, 파랑-빛-감지 상업 DNA 염색 유사 (그림 1, 테이블의 자료를 참조), ~ 1-2 되 고 모든 3 개의 염료에 대 한 검색 제한 ng/레인 미니 젤 1.
금지 효소 소화 밴드 절단 등 일반적인 응용 프로그램, thiazole 오렌지는 특히 잘 적합 합니다. 블루 빛 여기 DNA의 검출은 강력 하 고 간단 합니다, 그리고 과학자는 자외선을 감지 하는 경우와 마찬가지로 DNA를 삭제할 려 하지 않아도. 한 플라스 미드 삽입을 제한 효소로 절단 되었다 (그림 2를 한 젤은 군데 세 가지 방법으로). 삽입은 UV, UV 노출에서 DNA에 손상의 공포 없이 발생 하는 다운스트림 응용 프로그램 외에도 푸른 빛을 가진 쉽게 감지.
그림 1 . Thiazole 오렌지, 블루 빛-감지 일반적인 상업 DNA 염색과 청색 또는 UV 빛을 사용 하 여 ethidium 평범한 사람을 사용 하 여 DNA의 검출. 젤 슬라이스 이미지 대표 젤에서 DNA의 120-니 밴드의 두 배 희석 (밴드 2-로그 사다리에서 3.0 kb 밴드 이다). 이 그림은 오 닐, 외.1, 권한이 복제에서 수정 되었습니다. 오 닐, 외.1 실험의 자세한 내용은 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 제한 다이제스트의 동일한 thiazole 오렌지 스테인드 agarose 젤의 여러 이미지. UV transilluminator와 (A) 여기. (블루 빛 transilluminator와는 B) 흥분 (블루 라이트 손전등 (이 팁은 약간 초점, 이미지 하단에 표시)는 C) 흥분 레인 1: 2-로그 사다리, 총 DNA의 1 μ g (주요 밴드 3.0 kb, 1.0 kb와 0.5 kb로 표시). 레인 2: 0.5 μ g pEF GFP 플라스 미드 DNA (5.1 kb)의 HindIII와 소화 (예상 5.1 kb 크기). 레인 3: 0.5 μ g pEF GFP의 HindIII와 EcoRI 소화 (예상 크기: 3.7 k b, 1.3 kb). 젤 1.3 μ g/mL thiazole 오렌지 젤에 실행 했다. 표준 방출 필터를 사용 하 여 촬영 하는 모든 이미지 (590/110 nm), 노출 강렬한 밴드에 대 한 최적화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Ethidium 평범한 사람은 오랫동안 알려진된 독성에도 불구 하 고 분자 생물학 실험실에서 표준 도구. 그것은 또한 요구로 감지 되 고 DNA를 손상 자외선에서 겪고 있다. Thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람 뿐만 아니라 유용 하지만 비싼 상업용 염료는 저렴 한 대안을 제공합니다.
Thiazole 오렌지의 혜택은 따라서 두 배. 첫째, thiazole 오렌지 ethidium 평범한 사람을 교체로 간단 하 게 사용할 수 있습니다. 젤에 얼룩 (1.2 단계)으로 대체 된 EtBr을 동일 하 게 준비 될 수 있습니다. 검출 한계는 유사한 (1 ~ 2 ng/레인)1. 추가 장비는 thiazole 오렌지 EtBr 처럼 UV 빛 (3 단계)으로 검출 될 수 있다 때문에 염료를 전환 해야 합니다. 그러나 자외선에 노출 빠르게 손상 DNA,, 그리고 결 찰 및 변환1등 다운스트림 실험의 실패를 일으킬 수 있습니다. 자외선 또한 피부와 눈, 주의 안전 조치 요구에 손상 이다.
TO의 두 번째 혜택은 UV 여기에서의 가능성을 제공 합니다. (3 단계 4 단계 교체) 하는 푸른 빛으로 감지 DNA 손상 하 고 과학자에 위험을 제한 합니다. 블루 빛 transilluminator와 함께 또한 저렴 한 블루 led가 손전등 블루 빛 여기와 하의 얻을 수 있다 (두 ~ 470 nm 최대 방출 파장 모두 황색 방출 필터 요구). 여기 파장 (4.1 단계) 및 방출 필터 (4.2 단계)의 적절 한 적용 실험의 성공에 필수적 이다 (단계 5.1 참조). 그러나 광원 및 방출 필터 쉽게 사용할 수 있습니다,, 고 최소한의 투자와 연구소의 블루 빛 여기 혜택을 얻을 수 있습니다 및 UV 빛 손상을 방지.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 크리스토퍼 뉴포트 대학에서 TDG에 시작 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
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