Summary
Nous présentons ici un protocole pour utiliser thiazole orange pour la détection de l’ADN dans les expériences d’électrophorèse de gel. L’utilisation d’orange thiazole permet d’éliminer le bromure d’éthidium, et la détection par fluorescence peut être réalisée avec UV ou lumière bleue.
Abstract
Électrophorèse de gel d’ADN à l’aide de gel d’agarose est un outil commun dans les laboratoires de biologie moléculaire, permettant la séparation des fragments d’ADN de taille. Après la séparation, l’ADN est visualisé par coloration. Cet article montre comment utiliser ADN thiazole orange sur la tache. Orange de thiazole se compare favorablement à des méthodes de coloration courantes, qu’il est sensible, peu coûteux, excitables avec UV ou lumière bleue (pour éviter les dommages de l’échantillon) et plus sûr que le bromure d’éthidium. Laboratoires déjà équipés pour exécuter les expériences de l’électrophorèse d’ADN en utilisant du bromure d’éthidium peuvent généralement passer colorants sans modification supplémentaire à des protocoles existants, à l’aide de rayons UV pour la détection. Détection de la lumière bleue pour éviter tout endommagement de l’échantillon est possible en outre avec un filtre de source et d’émission de lumière bleue. Laboratoires déjà équipés pour la détection de la lumière bleue peuvent simplement passer colorants sans modification supplémentaire à des protocoles existants.
Introduction
Le but de cette méthode consiste à identifier l’ADN en gels d’agarose en utilisant thiazole orange (TO) pour la détection par fluorescence. En raison de son profil d’innocuité favorable et à faible coût, orange thiazole peut voir particulièrement bénéfique dans les laboratoires d’enseignement de premier cycle et des laboratoires de recherche effectuant la biologie moléculaire, en particulier des trompes et le clonage.
Le bromure d’éthidium reste la teinture plus courante pour la détection de l’ADN en gels d’agarose. C’est principalement parce qu’il peut être obtenu très peu de frais et ne nécessite que d’excitation avec la lumière UV pour détection. Les deux d’éthidium bromure thiazole orange sont peu coûteux, avec détection de faibles limites (ng/voie 1-2)1. Il y a deux principaux inconvénients au bromure d’éthidium, cependant, qui améliore orange thiazole.
Tout d’abord, le bromure d’éthidium est un agent mutagène2 avec un traitement spécial, l’envoi et exigences de la disposition, alors que thiazole orange est moins mutagène (3 – 4 x moins mutagène dans le test d’Ames)3,4 et peuvent être éliminées en général avec déchets chimiques communs.
Deuxièmement, le bromure d’éthidium exige la lumière UV pour la détection. Thiazole orange pouvez utiliser de la même façon de lumière UV si vous le souhaitez, mais peut également être détecté avec la lumière bleue. Lumière UV, bien que couramment utilisé, a quelques inconvénients marquants. Tout d’abord, il est dommageable pour les yeux et la peau humaine. Alors que la lumière UV peut être utilisé en toute sécurité par des professionnels qualifiés, cutanée ou oculaire dommages accidentels (fonctionnellement similaires aux coups de soleil) de la lumière UV de laboratoire ne sont pas rares en particulier avec les scientifiques inexpérimentés. En second lieu, la lumière UV est extrêmement nuisible à ADN échantillons5, ce qui réduit le succès des expériences en aval (par exemple la ligature et transformation)1,6,7. TO permet de détecter avec la lumière bleue (λex, max = 510 nm (488 nm et 470 nm montrent aussi forte excitation)), qui ne provoque pas de lésions cutanées ou d’endommager l’ADN (bien que toute lumière intense peut encore être nocif pour les yeux), qui réduit considérablement les risques pour les deux le scientifique et l’échantillon.
N’est pas l’alternative de colorant fluorescent seulement au bromure d’éthidium ; son avantage est le coût. A été découvert dans les années 1980 comme une tache de réticulocytes8et a trouvé l’utilitaire dans un certain nombre de fluorescence basées sur l’ADN des expériences9,10,11,12,13. Il est actuellement vendu par plusieurs fournisseurs. Est le composé parent de supplémentaires, plus cher, colorants commerciaux bleu lumière – détectables et se comporte de la même façon au cours de l’électrophorèse, UV ou lumière bleue pour détection1. En outre, alors que les autres colorants sont plus sensibles à très faibles concentrations d’ADN que le bromure d’éthidium ou TO, pour des expériences d’électrophorèse génériques, ces colorants sont prohibitifs dans de nombreux contextes.
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Protocol
1. préparation du gel
Nota : Pour les protocoles d’électrophorèse sur gel général, voir aussi P.Y. Lee, et al. 14.
- Mélanger le gel d’agarose (~ 1 % p/v, pourcentage peut varier pour des séparations de taille particulière) dans un tampon (environ 70 mL pour un mini-gel (8 x 7 cm)). Les mémoires tampons sont couramment TAE (pH de tris-acétate-EDTA, Tris, acétate de 20 mM, 40 mM EDTA 1 mM, environ 8,6) ou TBE (pH de tris-borate-EDTA, Tris, borate de 90 mM, 90 mM à 2 mM EDTA, environ 8,3)).
- Ajouter thiazole orange à une concentration finale de 1,3 µg/mL.
- Dissoudre thiazole orange dans le DMSO pour faire une solution stock de 10 000 x (13 mg/mL). Tandis que pas particulièrement photosensible, magasin à dans le sombre quand pas en service. Cette solution est stable à température ambiante pendant ~ mois ; entreposage à long terme peut être obtenu par congélation aliquotes (DMSO se figera dans un réfrigérateur standard). N’oubliez pas de tout à fait fondre et remettre en suspension dans une solution congelée avant utilisation.
Remarque : Le gel peut également être coloré avec TO après électrophorèse (voir étape 2.6). Certain temps pour a un profil d’innocuité améliorés sur le bromure d’éthidium, sécurité de laboratoire standard biologie moléculaire des précautions devraient être maintenues.
- Dissoudre thiazole orange dans le DMSO pour faire une solution stock de 10 000 x (13 mg/mL). Tandis que pas particulièrement photosensible, magasin à dans le sombre quand pas en service. Cette solution est stable à température ambiante pendant ~ mois ; entreposage à long terme peut être obtenu par congélation aliquotes (DMSO se figera dans un réfrigérateur standard). N’oubliez pas de tout à fait fondre et remettre en suspension dans une solution congelée avant utilisation.
- Chauffer le mélange de gel d’agarose, tampon et thiazole orange de dissoudre le gel d’agarose (environ 60 s). Cette étape est communément appelé « fusion ». Swirl (5 s) à la dissolution de l’aide si nécessaire.
Remarque : Pour peuvent également être ajoutés après la cuisson aux micro-ondes si vous préférez. - Laisser la solution d’agarose refroidir brièvement avant de verser dans l’appareil de coulage de gel contenant un peigne approprié.
- Laisser la solution de gel d’agarose à se solidifier en gel.
2. chargement et l’exécution du gel
- Placer le gel dans l’appareil d’électrophorèse si il n’est pas déjà présent.
- Ajouter en cours d’exécution de tampon (TAE ou TBE comme ci-dessus) pour couvrir la surface du gel.
- Charger des échantillons d’ADN (couramment 10 μL) en utilisant un colorant de chargement. Inclure une échelle d’ADN de dimensionnement pour référence.
- Fixez le couvercle et les électrodes (gel doit être exécuté vers l’anode rouge (positive)).
- Mettre sous tension (généralement ~ 100V pour un mini-gel, bien que de taille de gel peut exiger une tension modifiée pour éviter d’endommager le gel) jusqu'à ce que le colorant de chargement a parcouru une distance appropriée (environ 4 à 7 cm pour un mini-gel, bien que la distance peut varier selon le champ d’application).
Remarque : Comme le bromure d’éthidium et beaucoup d’autres colorants de liaison à l’ADN, orange thiazole est chargé positivement. Par conséquent, ces colorants vont migrer dans la direction opposée d’electrophoresing ADN. Pour les échantillons qui sont jusqu'à maintenant couler le gel pour séparation renforcée, éventuellement le colorant se séparera de petits fragments d’ADN, ce qui entraîne une coloration faible. Dans ces cas, le gel devrait être coloré comme au point 2.6. Cette situation n’est pas propre aux TO, tout chargés positivement colorant qui réversiblement interagit avec l’ADN exposera ce comportement (y compris le bromure d’éthidium, à et autres). - Si à n’a ne pas ajouté avant la coulée (étape 1.2) en gel, teinture par immersion du gel dans la mémoire tampon contenant thiazole orange.
- Préparer suffisamment tampon (TAE ou TBE) contenant 1,3 thiazole μg/mL orange complètement recouvrir le gel et trempez le gel avec agitation douce jusqu'à ce que les bandes sont entièrement détecté (environ 20 min).
3. visualisation du gel d’agarose orange de thiazole (transilluminateur UV)
- Retirer le gel de l’appareil d’électrophorèse et la placer sur un transilluminateur UV.
Attention : Lampe UV est nuisible pour la peau et les yeux. N’oubliez pas de porter les yeux (lunettes) et protection du visage (facial). Mains devraient avoir des gants et il faut porter des manches longues. - Si vous le souhaitez, découpe souhaitée des bandes d’ADN de gel (pour une digestion plue ou ligature, par exemple). Exposer le gel à la lumière UV pour que court un laps de temps que possible au cours de l’excision. Ultraviolets (indépendamment de la teinture de l’ADN) endommage l’ADN.
- Extraire l’ADN de la tranche de gel à l’aide d’un kit ou protocole disponibles15.
4. visualisation du gel d’agarose orange de thiazole (transilluminateur de lumière bleue ou lampe de poche)
- Retirer le gel de l’appareil d’électrophorèse et la placer sur un transilluminateur de lumière bleue (longueur d’onde 470 ~ d’émission maximum nm). Par ailleurs, une LED bleue (~ 470 nm) lampe de poche peut être dirigée vers le gel (que ce soit par dessus ou en dessous).
NOTE : Tandis que la sensibilité est inférieure à l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue au bromure d’éthidium, ADN coloré au bromure d’éthidium peut être détectée par ce protocole de lumière bleue. - Utiliser un filtre d’ambre d’émission (~ 560 nm longpass, soit des lunettes ou carré) pour filtrer la lumière bleue, ce qui permet la visualisation de la fluorescence des complexes ADN : thiazole orange.
Remarque : Sans le filtre d’émission ambre, il est très difficile de détecter les bandes d’ADN en raison de l’intensité de la source d’excitation de la lumière bleue.
Attention : Bien que la lumière bleue n’a pas la capacité de gravement endommager les tissus (contrastant UV), prolongées une exposition à une lumière bleue intense pourrait endommager les yeux et ambre d’émission des lunettes ou un filtre doit être utilisé. - Si vous le souhaitez, découper des bandes d’ADN désirées du gel pour les autres applications.
Remarque : Étant donné que la lumière bleue n’endommage pas l’ADN, il n’est pas nécessaire de découper rapidement bandes (comme par exemple lorsque avec excitation UV à l’étape 3.2). - Extraire l’ADN de la tranche de gel à l’aide d’un kit ou protocole disponibles15.
5. capture d’image
- Sélectionnez les paramètres appropriés d’excitation et d’émission dans des appareils d’imagerie gel. L’excitation et l’émission d’orange thiazole (λex, max = 510 nm (488 nm et 470 nm montrent aussi une excitation forte, en plus de la forte excitation aux longueurs d’onde UV) ; λem = 527 nm) sont presque identiques aux commun commercial bleu-lumière – détectable colorants, donc peuvent comporter des instruments préétablies des paramètres de filtre qui peuvent être utilisés.
Remarque : Certains paramètres de filtre de lumière bleue – détectables colorants commerciaux utilisent les rayons nocifs UV pour l’excitation, donc soyez prudent si l’imagerie avant de découper des bandes. Utilisez si possible une source de lumière bleue excitation lorsque les bandes d’ADN vont être excisées après l’imagerie. - En l’absence d’un système d’imagerie avec des filtres appropriés, prévoir un filtre ambre entre la caméra et la source d’excitation de gel/bleu-clair.
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Representative Results
Orange de thiazole permet la détection de l’ADN, sans utiliser le bromure d’éthidium et sans moyen de rayons UV endommagent l’ADN. Le bromure d’éthidium est connu pour être mutagène, afin de l’éliminer du labo peut être avantageux. Lumière UV endommage l’ADN et diminue l’efficacité de la transformation significativement, tandis que la lumière bleue n’endommage pas l’ADN. Limites de détection sont similaires entre le bromure d’éthidium, thiazole orange et un colorant ADN commercial commun, bleu lumière – détectables (Figure 1, voir la Table des matières), avec la limite de détection pour tous les trois colorants ~ 1-2 ng/lane dans un mini gel 1.
Pour les applications communes telles que couper une bande de l’enzyme de restriction digéré, orange thiazole est particulièrement bien adapté. Détection de l’ADN avec l’excitation de la lumière bleue est robuste et simple, et le scientifique ne doit pas se précipiter pour exciser ADN comme ils le feraient si détection avec la lumière UV. Un plasmide a été coupé avec des enzymes de restriction pour isoler un insert (Figure 2, un gel est imagé de trois façons différentes). L’insert est facilement détectable avec TO avec lumière bleue en plus des UV, permettant aux applications en aval se produire sans crainte de dommages à l’ADN de l’exposition aux UV.
Figure 1 . Détection de l’ADN à l’aide de thiazole orange, une commune colorant bleu-lumière – détectables d’ADN commercial et du bromure d’éthidium à l’aide de bleu ou la lumière UV. Gel tranche images représentent la dilution double d’une bande de 120-ng d’ADN à travers le gel (band est un groupe de 3,0 Ko d’échelle de 2 log). Ce chiffre a été modifié par o ' Neil, Al.1, reproduit avec permission. Voir o ' Neil, Al.1 pour les détails complets de l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Images multiples de la même thiazole orange gel coloré d’un sommaire de restriction. (A) Excitation avec transilluminateur UV. (B) l’excitation avec lumière bleue courte longueur d’onde. (C) l’excitation avec de la lumière bleue lampe de poche (dont la pointe est légèrement visible, floue, à l’image en bas). Piste 1:2-échelle log, 1 μg d’ADN total (bandes principales de 3,0 Ko et Ko 1,0 0,5 Ko sont étiquetés). Voie 2 : 0,5 μg de pEF-GFP l’ADN plasmidique (5,1 Ko) digéré avec HindIII (attendue taille 5,1 kb). Voie 3 : 0,5 μg de pEF-GFP digéré avec HindIII et EcoRI (attendu tailles : 3,7 Ko, 1,3 Ko). Gel a été exécuté avec 1,3 thiazole μg/mL orange dans le gel. Toutes les images prises à l’aide de filtre standard d’émission (590/110 nm), exposition optimisée pour bandes intenses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le bromure d’éthidium est depuis longtemps un outil standard dans le laboratoire de biologie moléculaire, malgré la toxicité connue. Il souffre également d’exiger la lumière UV, ce qui endommage l’ADN tel qu’il est détecté. Thiazole orange offre une alternative peu coûteuse au bromure d’éthidium, ainsi que des colorants commerciaux utiles mais chers.
Les avantages d’orange thiazole sont ainsi deux fois. Tout d’abord, orange thiazole utilisable simplement comme un remplacement au bromure d’éthidium. Gels peuvent être préparés à l’identique au bromure d’éthidium, avec TO substitué comme la tache (étape 1.2). Limites de détection sont semblables (~ 1-2 ng/lane)1. Aucun équipement supplémentaire n’est nécessaire pour passer les colorants étant orange thiazole peut être détecté avec la lumière UV (étape 3) à l’instar de bromure d’éthidium. Exposition à la lumière UV rapidement endommage l’ADN, cependant et peut entraîner la défaillance des expériences en aval comme la ligature et la transformation1. Lumière UV est aussi nuisible pour la peau et les yeux, nécessitant des précautions de sécurité attention.
Le deuxième avantage de TO, c’est qu’elle offre la possibilité d’en provenance d’excitation UV. Détection avec la lumière bleue (remplaçant étape 3 étape 4) élimine les dommages à l’ADN et limite le risque pour le scientifique. Lumière bleue excitation et détection des peut être réalisé avec un transilluminateur de lumière bleue, ainsi qu’avec une lampe de poche LED bleu peu coûteux (les deux longueurs d’onde ~ 470 nm maximales d’émission, les deux nécessitant un filtre d’émission ambre). L’application appropriée des longueurs d’onde d’excitation (étape 4.1) et filtres d’émission (étape 4.2) est essentielle à la réussite de l’expérience (voir aussi l’étape 5.1). Sources lumineuses et les filtres d’émission sont facilement disponibles, cependant, et avec un investissement minimal, les laboratoires peuvent engranger les bénéfices de l’excitation de la lumière bleue et éviter des dommages légers UV.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de TMD de Christopher Newport University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-log DNA ladder | New England Biolabs | N0469S | |
| Agarose (Genetic Analysis Grade) | Fisher | BP1356-100 | |
| Blue-light flashlight | WAYLLSHINE (Amazon) | WAYLLSHINE Scalable Blue LED | |
| ChemiDoc MP | Biorad | 1708280 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| ethidium bromide | Fisher | BP1302-10 | For comparison, not necessary for protocol |
| Gel apparatus (Owl Easy Cast) | Thermo Scientific | B1A | |
| Qiagen Qiaquick Gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Safe Imager Viewing Glasses | Invitrogen | S37103 | Necessary for using blue light flashlight.* |
| SafeImager 2.0 (Blue light transilluminator) | Invitrogen | G6600 | Blue light flashlight may be used as alternative |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | For comparison, not necessary for protocol |
| TAE (Tris-Acetate-EDTA) | Corning | 46-010-CM | |
| Thiazole orange | Sigma-Aldrich | 390062 | |
| *Glasses are also included with Invitrogen G6600 | |||
References
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