Summary
Este protocolo demuestra la inmunofluorescencia secuencial y la inmunohistoquímica en criosecciones de embriones de pez cebra en etapa temprana que permiten análisis precisos de la colocación en poblaciones celulares específicas.
Abstract
La investigación de las interacciones intercelulares a menudo requiere un etiquetado discreto de poblaciones celulares específicas y una localización precisa de proteínas. El embrión de pez cebra es una excelente herramienta para examinar tales interacciones con un modelo in vivo. Los ensayos inmunohistoquímicos e inmunofluorescencia de montaje completo se aplican con frecuencia en embriones de pez cebra para evaluar la expresión de proteínas. Sin embargo, puede ser difícil lograr un mapeo preciso de proteínas co-localizadas en el espacio tridimensional. Además, algunos estudios pueden requerir el uso de dos anticuerpos que no son compatibles con la misma técnica (por ejemplo, el anticuerpo 1 sólo es adecuado para la inmunohistoquímica y el anticuerpo 2 sólo es adecuado para la inmunofluorescencia). El propósito del método descrito en este documento es realizar inmunofluorescencia secuencial y/o inmunohistoquímica en criosecciones individuales derivadas de embriones de pez cebra en etapa temprana. Aquí describimos el uso de rondas secuenciales de inmunofluorescencia, imágenes, inmunohistoquímica, imágenes para una sola criosección con el fin de lograr una identificación precisa de la expresión proteica a nivel de una sola célula. Esta metodología es adecuada para cualquier estudio en embriones de pez cebra en etapa temprana que requiera una identificación precisa de múltiples dianas proteicas en células individuales.
Introduction
El pez cebra es un organismo modelo extremadamente robusto que actualmente se utiliza en una amplia variedad de disciplinas en la investigación biomédica. En particular, el rápido desarrollo externo y la translucidez de los embriones de pez cebra proporcionan una excelente herramienta para los estudios in vivo. En este documento, describimos un método para los análisis de inmunofluorescencia secuencial (IF) e inmunohistoquímicos (IHC) de embriones de pez cebra criodisección. Este novedoso procedimiento utiliza la aplicación secuencial de dos anticuerpos en una sola diapositiva, lo que permite una identificación precisa de las proteínas colocalizadas a nivel celular mientras se conservan las secciones de tejido. Este protocolo es particularmente útil para estudios con el modelo de pez cebra, ya que se ha validado un número relativamente pequeño de anticuerpos para su uso en aplicaciones IF y/o IHC en modelos de peces cebra en comparación con modelos de ratón.
La observación de interacciones intercelulares es un elemento esencial en muchos estudios, y puede proporcionar información clave sobre los mecanismos moleculares que funcionan a nivel celular que subyacen a fenotipos a nivel de organismo. Además, la expresión de proteínas puede proporcionar información sobre la función celular, especialmente cuando se examina la expresión de múltiples proteínas simultáneamente dentro de la célula (colocalización). Aunque IHC y IF de montaje entero son técnicas de uso común para analizar la expresión de proteínas en embriones de pez cebra1,2,3,4,5, procedimientos de montaje completo pueden ser para lograr datos precisos de colocación. En nuestra experiencia, puede ser difícil diferenciar entre capas de tejido y visualizar la expresión de proteínas a nivel de una sola célula en muestras de montaje completo. Los programas de software de imágenes generalmente pueden ser incapaces de distinguir entre la tinción superficial frente a la tinción más profunda. Las expresiones proteicas a nivel no superficial pueden oscurecerse mediante una expresión de nivel de superficie más brillantemente expresada, lo que da lugar a imprecisiones en la cuantificación. Además, la mayoría de los métodos tradicionales de limpieza de peces cebra son bastante tóxicos6 y por lo tanto menos deseables para su uso.
Las técnicas basadas en anticuerpos, como IF e IHC, se utilizan a menudo para detectar la expresión de proteínas en material seccionado, simplificando la identificación de poblaciones celulares discretas que expresan una proteína particular dentro de tejidos complejos. IHC se utiliza comúnmente para la colocalización, más frecuentemente mediante el uso de dos anticuerpos diferentes conjugados en diferentes especies anfitrionas y visualizados con cromógenos de diferentes colores4,7,8,9 , 10. Sin embargo, el uso de varios cromógenos puede dar lugar a manchas de fondo inespecíficos o incompatibilidad de colores11,12.
Desarrollamos un novedoso protocolo para la detección de múltiples proteínas por IF secuencial e IHC en embriones de pez cebra crioseccionados en etapas tempranas. La criosección es particularmente adecuada para tejidos delicados como embriones de pez cebra, y las criosecciones son superiores a las secciones incrustadas en parafina para ensayos basados en fluorescencia13,14. Elegimos optimizar el IF y el IHC combinados en lugar de IF de doble color o IHC, para eludir el problema de la incompatibilidad de anticuerpos para un solo tipo de ensayo. Estos problemas son particularmente relevantes para la investigación que involucra peces cebra debido al número limitado de anticuerpos disponibles comercialmente que se validan para su uso en peces cebra. De hecho, un estudio de cuatro grandes empresas mostró que los anticuerpos disponibles comercialmente para su uso en ratón eran de unos 112.000 frente a unos 5.300 para su uso en peces cebra15. Por último, optamos por desarrollar un protocolo que pudiera realizarse en una sola criosección, que es esencial cuando se trabaja con muestras de tejido pequeñas o limitadas, como las obtenidas de embriones de pez cebra.
Este protocolo fue diseñado para evaluar el comportamiento proliferativo de las células de los donantes en 48 h embriones de pez cebra quimérico después de la fertilización que fueron generados por el trasplante de blastula a blastula como lo describecarcaron Carmany-Rampey y Moens16. Los embriones de donantes se inyectaron en la etapa de una célula con un conjugado de dextran etiquetado fluorescentemente antes del trasplante de células de donantes en embriones receptores. Utilizamos inmunofluorescencia para Ser 10 fosforilated Histone H3 (pH3) para detectar células proliferantes seguidas de inmunohistoquímica para el dextran etiquetado para detectar células de donante en embriones de pez cebra quimérico. La detección secuencial de pH3 y el dextran etiquetado dentro de una sola criosección nos permitió identificar y cuantificar células individuales que expresaban ambos marcadores.
Este protocolo IF/IHC secuencial para el pez cebra crioseccionado proporcionará una herramienta útil para los investigadores de peces cebra que desean un protocolo de colocación para la expresión de proteínas. Los problemas que este protocolo fue diseñado para abordar, tales como especímenes de tejido pequeño y disponibilidad limitada de anticuerpos, no son exclusivos del modelo de pez cebra. Por lo tanto, este método puede ser útil para cualquier investigador que desee realizar IF/IHC secuencial.
DECLARACIONES DE ETICA:
Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Raleigh, Carolina del Norte, EE. UU.
Protocol
1. Preparación de embriones
- Fijar 48 h embriones de pez cebra quimérico después de la fertilización (hpf) generados por el trasplante de blastula a blastula entre embriones de pez cebra de tipo silvestre AB en 4% de paraformaldehído (PFA) durante la noche con balanceo a 4 oC. Realizar dos lavados de 5 min con balanceo a temperatura ambiente utilizando 500 l de solución salina tamponada de fosfato 1x que contiene 0,1% de un tensioactivo no iónico (1x PBSt; véase la Tabla de Materiales)
NOTA: El paraformaldehído es tóxico y carcinógeno y debe eliminarse adecuadamente según las regulaciones institucionales. El trabajo con paraformaldehyde debe realizarse en una campana química, y siempre se debe utilizar el equipo de protección personal adecuado (guantes, capa de laboratorio y gafas de seguridad). - Deshidratar embriones lavando secuencialmente con 500 s de 30%, 50% y 70% de metanol (MeOH) diluido con 1x PBSt durante 10 min cada uno a temperatura ambiente con balanceo. Incubar embriones en 500 ml de 100% MeOH a -20 oC durante al menos 14 h.
NOTA: El metanol es tóxico y debe eliminarse adecuadamente según las regulaciones institucionales. El trabajo con metanol debe realizarse en una campana química, y siempre se debe utilizar el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad). - Rehidrata los embriones lavando secuencialmente con 500 ml de 70%, 50% y 30% MeOH diluido con 1PBSt durante 10 min cada uno a temperatura ambiente con balanceo. Realizar dos lavados de 5 min con 500 ml de 1pbSt a temperatura ambiente con balanceo.
- Retire el 1x PBSt e incubar en 500 ol de sacarosa del 30% diluida con agua desionizada a temperatura ambiente con balanceo hasta que los embriones se hundan en la parte inferior del tubo (aproximadamente 1 h). Sustituya la sacarosa por 500 ml de gelatina de pescado al 15%/25% de sacarosa (15/25; ver la Tabla de Materiales)e incubar a temperatura ambiente con balanceo durante la noche.
- Sustituya aproximadamente la mitad del volumen de 15/25 por un medio de temperatura de corte óptimo (medio OCT) e incubar a temperatura ambiente con balanceo hasta que los embriones se hundan en la parte inferior del tubo (aproximadamente 1 h).
- Reemplace aproximadamente la mitad del volumen por medio PTU e incubar a temperatura ambiente con balanceo durante 1 h. Repita este paso una vez.
- Durante los pasos de incubación con 15/25 y el medio OCT, invierta o deslice el tubo según sea necesario para combinar estos reactivos.
2. Incorporación de embriones y preparación de Cryosections
- Transfiera embriones a un molde plástico (ver la Tabla de Materiales)con fórceps, minimizando cualquier transferencia de la mezcla 15/25-OCT. Llene el molde aproximadamente medio lleno con medio OCT y mezcle suavemente los embriones en medio PTU.
- Preparar los moldes de plástico etiquetados y transferir los embriones deseados (generalmente 1-u20123 embriones) a los moldes de plástico vacíos y etiquetados, minimizando el arrastre del medio PTU. Una vez que los embriones deseados estén en el molde de plástico, llene suavemente con medio OCT hasta la parte superior del molde.
- Utilice fórceps o agujas de 25 G para organizar los embriones a la orientación deseada, utilizando un estereomicroscopio ligero para su visualización (Figura1A,B).
- Congele los moldes preparados sobre hielo seco en un recipiente aislado con una plataforma metálica. Coloque un cubo de hielo o un enfriador de espuma suavemente sobre la plataforma metálica para crear una cámara fría (Figura1C,D)
-
Preparar criosecciones de 10 u201212 m de espesor utilizando un criostato de -20 oC.
- Configure un bloque a la vez y utilice el medio OCT para congelar el bloque en el disco/chuck con la parte inferior del bloque mirando hacia la hoja (Figura2A). Asegúrese de que el bloque esté completamente congelado en el disco (el medio OCT se volverá blanco) antes de comenzar a seccionar (Figura2B).
- Coloque las crioseccionesen los portaobjetos de vidrio cargados (Figura 2C,D) y seque al aire los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente.
3. Inmunofluorescencia para pH3
- Realice tres lavados de 5 minutos de los portaobjetos en 1pbS en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin. Si los tejidos no están bien adheridos a la corredera, realice lavados colocando portaobjetos sobre una superficie plana y pipeteando suavemente 500 ml de 1 pbS en la superficie. Vierta 1 PBS entre lavados inclinando suavemente los portaobjetos.
- Delinee las secciones con un lápiz de barrera o lápiz de cera para mantener líquido en las diapositivas (Figura3).
- Poner las correderas sobre una superficie plana en una cámara húmeda y pipeta 200 l de tampón de bloque por sección en las diapositivas. Incubar en tampón de bloque durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4oC.
- Preparar la dilución de anticuerpos primarios (anticuerpo anti-pH3 de conejo, 1:200; ver Tabla de materiales)en el tampón de bloque y mezclar bien mediante pipeteo. Incline suavemente las correderas para drenar el tampón de bloque, volver a la cámara húmeda y pipetear 200 ml de solución de anticuerpos primarios por sección en los portaobjetos. Para el control de solo secundario, pipeta 200 l de búfer de bloque en las secciones adecuadas.
- Incubar los toboganes a 4oC durante la noche en una cámara húmeda llena de agua desionizada. Selle los bordes de la cámara húmeda para ayudar a retener la humedad.
- Realice tres lavados de 5 minutos de los portaobjetos en 1pbS en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin. Durante los pasos de lavado, prepare la dilución secundaria de anticuerpos (conjugado de anticuerpos secundarios fluorescentes anticonejo, 1:2.000; ver Tabla de materiales)en tampón de bloquey mezcle bien pipeteando.
- Poner los portaobjetos sobre una superficie plana en una cámara húmeda y pipeta 200 l de solución secundaria de anticuerpos por sección sobre los portaobjetos. Incubar los portaobjetos en solución(s) secundaria(s) de anticuerpos a temperatura ambiente, protegidos de la luz, durante 30 min.
- Realice tres lavados de 5 minutos de los portaobjetos en 1pbS en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin, protegido de la luz. Durante los pasos de lavado, prepare una solución de tinción nuclear (consulte la Tabla de materiales).
- Coloque las correderas sobre una superficie plana y la pipeta 200-u2012500 l (dependiendo del tamaño de la muestra) de la solución de tinción nuclear en cada sección. Incubar los portaobjetos en la solución de tinción nuclear durante 10 minutos, protegidos de la luz.
- Escurra la solución de tinción nuclear y monte las correderas con medios de montaje fluorescentes no endurecentes y una cubierta de vidrio. Mantenga las diapositivas en la oscuridad a 4 oC hasta que se realice la toma de imágenes.
NOTA: Los mejores resultados se obtienen cuando las diapositivas se crean imágenes el mismo día o al día siguiente. - Siguiendo IF, visualice e imagen las diapositivas con un microscopio de fluorescencia confocal y una cámara digital utilizando filtros de emisión de 555 nm (rojo) y 645 nm (rojo lejano) a un aumento de 100x (aumento ocular 10x y aumento de objetivos 10x). Mantenga la potencia del láser consistente durante las imágenes.
- Después de la toma de imágenes, coloque los portaobjetos en recipientes individuales de 1pbS y guárdelos a 4 oC durante la noche para prepararse para la eliminación de la capa. Al colocar las correderas en 1pbS, agitar suavemente las diapositivas para ayudar en la extracción de la cubierta.
NOTA: No presione hacia abajo en el cubreobjetos ni intente quitar el cubreobjetos manualmente, ya que esto puede comprometer la calidad de las secciones. Los cubreobjetos deben retirarse horizontalmente con un movimiento forzado mínimo.
4. Inmunohistoquímica para Dextran etiquetado
- Después de retirar los cubreobjetos, transfiera suavemente las diapositivas a 1 PBS nuevo en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin. Retire el 1x PBS y realice tres incubaciones de 5 minutos de las diapositivas en 1 solución salina tris tampón con 0.1% de un tensioactivo no iónico (1x TBSt) a temperatura ambiente.
- Preparar 250 ml de peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) diluido en agua desionizada en un recipiente de tamaño adecuado. Incubar los portaobjetos en solución de 3% H2O2 a temperatura ambiente durante 15 min.
NOTA: El peróxido de hidrógeno es corrosivo y debe eliminarse adecuadamente según las regulaciones institucionales. Siempre se debe utilizar el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad). - Enjuague rápidamente los portaobjetos con agua desionizada. Realice tres lavados de 5 minutos de los portaobjetos en 1x TBSt. Seque cuidadosamente el área alrededor de las secciones de tejido y coloque los portaobjetos planos en una cámara húmeda. Delinee las secciones de tejido con una pluma de barrera o lápiz de cera para mantener el líquido en las secciones si es necesario.
- Aplique una solución de bloqueo sérico de 2,5% lista para usar provista de un kit secundario de etiquetado de anticuerpos (consulte la Tabla de materiales)en cada sección. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 20 min.
- Preparar el anticuerpo primario diluido en diluyente de anticuerpos (dextran antietiquetado conejo, 1:7.500; ver la Tabla de Materiales)y mezclar mediante pipeteo suave. Incline suavemente los portaobjetos para drenar el tampón de bloque, seque el área alrededor de las secciones y coloque los portaobjetos planos en una cámara húmeda.
- No lavar antes de aplicar la solución primaria de anticuerpos. Pipetear 200 l de solución de anticuerpos primarios por sección sobre los portaobjetos e incubar en una cámara húmeda a 4oC durante la noche. Para el control de solo secundario, pipeta 200 l de diluyente de anticuerpos en las secciones apropiadas.
- Incline suavemente los portaobjetos para drenar la solución primaria de anticuerpos y colóquelos en 1 x TBSt en un recipiente adecuado, como un frasco de Coplin. Realizar dos lavados de 5 minutos de los portaobjetos en 1x TBSt. Seque el área alrededor de las secciones y colóquelos planas en una cámara húmeda.
- Aplique un reactivo de bloqueo de reducción de fondo listo para usar (consulte la Tabla de materiales)en sentido de gota a cada sección. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 20 min.
- Incline suavemente los portaobjetos para drenar el tampón de bloque, seque cuidadosamente el área alrededor de las secciones y coloque los portaobjetos planos en una cámara húmeda. No lavar antes de aplicar la solución secundaria de anticuerpos.
- Aplicar una solución de anticuerpos secundarios lista para usar (anticuerpo secundario de polímero de peroxidasa de rábano picante anticonejo (HRP); ver la Tabla de Materiales) a cada sección en forma de gota e incubar en una cámara húmeda a temperatura ambiente durante 30 min.
- Incline suavemente los portaobjetos para drenar la solución secundaria de anticuerpos y colóquelos en 1 x TBSt en un recipiente adecuado, como un frasco de Coplin. Realice dos lavados de 5 min de los portaobjetos en 1 x TBSt.
- Preparar el sustrato cromogénico HRP inmediatamente antes de su uso de acuerdo con el protocolo del fabricante (ver la Tabla de Materiales).
- Seque el área alrededor de las secciones, coloque las diapositivas sobre una superficie plana y aplique 200 ml del sustrato cromogénico HRP en cada sección. Incubar a temperatura ambiente durante 3 min, iniciando un temporizador cuando el sustrato se haya aplicado a la primera diapositiva (Figura4).
- Escurra la solución de sustrato y enjuague las diapositivas brevemente en un frasco de Coplin que contenga 1 x PBS. Coloque los portaobjetos en agua desionizada en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin, y realice dos lavados de 5 minutos en agua desionizada con agitación suave.
- Contrarresta las diapositivas colocándolas en solución de tinción de hematoxilina durante un máximo de 30 s.
NOTA: La hematoxilina es tóxica y debe eliminarse según las regulaciones institucionales. Siempre se debe utilizar el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad). - Coloque los portaobjetos en agua desionizada en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin, y realice tres lavados de 5 minutos en agua desionizada. Transfiera las diapositivas a un recipiente que contenga el agua del grifo de Scott (ver la Tabla de Materiales)e incubar durante 1 min.
- Coloque los portaobjetos en agua desionizada en un recipiente apropiado, como un frasco de Coplin, y realice tres lavados de 5 minutos en agua desionizada.
- Deshidratar los portaobjetos a través de una serie de grados de etanol (EtOH) (diluidos en agua desionizada) y xileno en una campana química. Realizar una incubación de 2 min en 70% EtOH, dos incubaciones de 1 min en 95% EtOH, dos incubaciones de 1 min en 100% EtOH, y tres incubaciones de 1 min en xileno. Retire las diapositivas del xileno y coloque una cubierta mientras está mojada con un medio de montaje a base de tolueno en una campana química.
NOTA: El xileno y el tolueno son tóxicos e inflamables y deben eliminarse adecuadamente según las regulaciones institucionales. El trabajo con xileno y tolueno debe realizarse en una campana química, y siempre se debe utilizar el equipo de protección personal adecuado (guantes, bata de laboratorio y gafas de seguridad). - Siguiendo IHC, visualice e imagen las diapositivas con un microscopio de luz compuesto y una cámara digital con un aumento de 100x (aumento ocular 10x y aumento objetivo 10x). (Figura 5).
Representative Results
Desarrollamos este protocolo con el fin de identificar y analizar la expresión de proteínas en células de donantes individuales en 48 h embriones de pez cebra quimérico post-fertilización que fueron generados por el trasplante de blastula a blastula entre embriones de pez cebra de tipo silvestre AB. El análisis exitoso de la expresión proteica a nivel de una célula requirió la preparación de criosecciones con embriones adecuadamente orientados (Figura1 y Figura2) y una aplicación cuidadosa y secuencial de las técnicas IF e IHC a estos criosecciones (Figura3 y Figura 4). El uso de anticuerpos específicos para detectar simultáneamente células proliferantes (anti-pH3, Figura 5A,B) y células donantes (dextran antietiquetado, Figura 5D)se puede utilizar para identificar y cuantificar las células donantes que están proliferando activamente ( Figura 5E). Es esencial generar imágenes de alta calidad después de IF (Figura2A,B) e IHC (Figura2D)para identificar con precisión las células individuales. Se debe utilizar un programa de análisis de imágenes para realizar la superposición de imágenes (Figura5E). Dependiendo del programa de análisis de imágenes utilizado, puede ser posible realizar recuentos automatizados de celdas etiquetadas en caso de que se desee la cuantificación.
Figura 1: Preparación de bloques OCT congelados. (A) 50x vista microscópica de embriones en PTU en un molde criogénico preparado para la congelación. La flecha roja indica la posición de la cabeza del embrión de pez cebra contra la superficie inferior del molde; flecha negra indica la cola apuntando hacia el usuario. (B) Moldes plásticos con embriones y OCT colocados en plataforma de metal refrigerado. (C) Cubo de hielo de espuma colocado sobre moldes de plástico para crear cámara de congelación. (D) OCT se vuelve blanco de transparente una vez que el bloque está completamente congelado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Criosección de bloques OCT congelados. (A), Aplicación de PTU fresco en el disco criostato y colocación del bloque congelado en PTU, girado 180o desde la orientación de congelación del bloque. (B) Vista lateral del bloque congelado en el disco de sección. (C) Vista del bloque de sección con la placa de rollo en posición. (D) Recogida de secciones utilizando una diapositiva cargada de la plataforma metálica del criostato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Vista de las secciones preparadas después de colocarlas en una diapositiva. Flecha indica barrera hidrófoba, y la línea punteada delinea la zona que contiene secciones dentro del perímetro de la barrera. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Preparación para la aplicación de sustrato cromogénico durante el IHC. La corredera se coloca sobre una superficie plana cubierta con envoltura de plástico para permitir una aplicación uniforme del sustrato cromogénico mientras contiene cualquier derrame de material peligroso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Etiquetado representativo del IF y del IHC de embriones de pez cebra quimérico de 48 hpf crioseccionados generados por el trasplante de blastula a blastula entre embrionesde pez cebra de tipo salvaje AB. (A) IF para detectar ser 10 histona fosforilada H3 (anti-pH3, 1:200) expresión en 48 hpf embrión de pez cebra quimérico. Rojo: células pH3-positivas; azules- núcleos. Las flechas amarillas indican ejemplos de celdas positivas. (B) La resta de la mancha nuclear azul en la imagen digital (software ImageJ) mejora la visualización de células pH3 positivas para la cuantificación y la superposición de imágenes. (C) Control negativo (solo anticuerposecundario secundario) para ensayo IF en embrión de pez cebra quimérico de 48 hpf criosección. La barra de escala representa 50 m (aplicable a todos los paneles). (D) IHC para detectar dextran etiquetado (dextran antietiquetado, 1:7.500) en embrión de pez cebra quimérico de 48 hpf generado por el trasplante de blastula a blastula entre embriones de pez cebra de tipo silvestre AB. Los embriones de donantes fueron inyectados con un conjugado de dextran con etiqueta fluorescente en la etapa de una célula antes de su uso para el trasplante de blastula a blastula. El rojo indica las células etiquetadas con un conjugado dextrano; azul indica núcleos. Las flechas amarillas indican ejemplos de celdas positivas. (E) Superposición del panel B (IF para pH3) y del panel C (IHC para la dextran etiquetado) que muestra la colocalización de la expresión pH3 y el etiquetado de desmtífero en celdas individuales. Las flechas amarillas indican ejemplos de celdas de doble positivo. (F) Control negativo (solo anticuerposecundario secundario) para ensayo según IHC en embrión de pez cebra quimérico de 48 hpf criosección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Hemos presentado un método novedoso para la inmunofluorescencia combinada y la inmunohistoquímica que representa un importante paso adelante en la realización de experimentos de colocalización en embriones de pez cebra criodisección. Existe una falta crítica de protocolos de colocación existentes optimizados para su uso con embriones pequeños y material crioseccionado17,18,los cuales se utilizan comúnmente en estudios moleculares14. Los protocolos de colocación existentes se centran principalmente en la visualización simultánea de dos fluoróforos17,18. Si bien estos protocolos pueden funcionar bien, su utilidad está limitada por la disponibilidad de anticuerpos que (i) se pueden utilizar en el pez cebra y (ii) son compatibles con IF.
Creemos que el uso de criosección para embriones de pez cebra proporciona una ventaja significativa en términos de morfología de tejido preservado. Como IHC se realiza más comúnmente en secciones de parafina que criosecciones7,8, se justifica una exploración adicional de los métodos IHC basados en criosección para la detección de la expresión de proteínas. El uso de todo el montaje IF es un método común para visualizar los niveles de expresión en embriones de pez cebra, y se describe más comúnmente en la literatura que IF utilizando criosecciones1,2,3,4, 19. Sin embargo, los protocolos de montaje completo tienen limitaciones, incluida la falta de localización precisa de proteínas expresadas en tejidos profundos y la posibilidad de que la expresión del nivel de superficie oscurezca la expresión de proteínas en tejidos más profundos. Hemos observado consistentemente un excelente mantenimiento de la morfología celular después de la criopreservación, seccionamiento y secuencial IF e IHC. Para aplicaciones que requieren una localización precisa de la expresión de proteínas a nivel de una sola célula, hay una ventaja significativa para los procedimientos basados en secciones como hemos descrito en este protocolo. La incrustación de resina proporciona una opción alternativa para realizar ensayos IF o IHC en secciones de embriones de pez cebra en etapa temprana20. Las secciones de resina proporcionan una preservación superior de la morfología tisular en comparación con las criosecciones, y se pueden preparar secciones de tejido relativamente más delgadas. Sin embargo, los fabricantes generalmente no recomiendan el uso de secciones de resina para ensayos inmuno-a base, ya que algunos componentes de las resinas no se pueden eliminar de las secciones y pueden enmascarar los sitios de unión de anticuerpos21.
Si bien todo el protocolo es esencial para un análisis preciso y exitoso de los patrones de expresión, algunos pasos específicos son fundamentales para el éxito experimental. El primer paso crítico es el manejo de embriones durante la incrustación en OCT13,14. Puede ser difícil orientar cada embrión en el mismo plano transversal para que las secciones se corten de aproximadamente la misma área para todos los embriones. Hemos descubierto que el uso de agujas de pequeño calibre para realizar movimientos pequeños y deliberados a través del medio pTU viscoso para la orientación embrionaria es superior al uso de fórceps, que son demasiado grandes y desplazan demasiado medio OCT. Un segundo paso crítico ocurre durante la sección de bloques congelados, ya que puede ser difícil obtener secciones de alta calidad que contengan los tejidos deseados sin entrenamiento y experiencia significativos. Por lo tanto, recomendamos el uso de muestras de prueba hasta que se domine la técnica. Un tercer paso crítico es la extracción de cubredes, que tiene el potencial de perturbar o eliminar muestras de tejido. Hemos encontrado que una combinación de agitación suave para aflojar la cubierta y la eliminación lenta de la diapositiva del contenedor PBS es el enfoque más eficaz para eliminar los cubrecubiertas. Una mano suave y firme es mejor; los investigadores pueden encontrar que algún ensayo y error es necesario para aprender cómo eliminar coverslips con eficacia.
Otros pasos importantes en el protocolo incluyen la optimización de anticuerpos (anticuerpos primarios y secundarios para ensayos IF e IHC) y la exposición de diapositivas al sustrato cromogénico y la contramanchas. Es esencial una investigación exhaustiva sobre la especificidad de los anticuerpos primarios y la concentración objetivo; generalmente, es mejor recolectar suficientes muestras no preciosas para al menos dos experimentos separados para IF e IHC que se realizarán para optimizar las concentraciones primarias de anticuerpos antes de comenzar la combinación IF/IHC. Incluir un control positivo y negativo conocido para cada anticuerpo primario es esencial en cada experimento para asegurar que los ensayos IF e IHC funcionen adecuadamente. También pueden ser necesarios ajustes a la concentración secundaria de anticuerpos. Se requiere la optimización de la exposición de las secciones tisulares al sustrato cromogénico y la contramancha para el ensayo IHC, ya que las directrices del fabricante a menudo describen una amplia gama de tiempos de exposición posibles. No todos los cromógenos pueden ser compatibles con contramanchas y pigmentación de tejido endógeno, lo que requiere una planificación cuidadosa con respecto a la selección de cromógenos.
Hay numerosas modificaciones potenciales que se pueden aplicar al protocolo descrito, y hemos realizado con éxito este protocolo con otras combinaciones de anticuerpos que no se podrían utilizar para IF. Como se mencionó anteriormente, las sustancias cromogénicas tienen una compatibilidad distinta con contramanchas específicas. Hemos encontrado que estos componentes son fácilmente modificables en el protocolo. Además, los parámetros para la incubación de anticuerpos son bastante flexibles, y se pueden aumentar o disminuir dependiendo de la intensidad de tinción deseada. El proceso de incrustación también se puede modificar. Si bien nos hemos centrado en secciones transversales, los embriones pueden orientarse fácilmente en cualquier dirección para abordar determinados tejidos de interés. Por último, hay varios puntos de pausa posibles en este protocolo. Los embriones deshidratados se pueden almacenar en 100% MeOH a -20 oC durante unos meses; los bloques congelados se pueden almacenar a -80 oC durante un máximo de tres meses; y las diapositivas preparadas se pueden almacenar a -80 oC durante un máximo de nueve meses en una caja de diapositivas.
Debido a la complejidad relativa de este protocolo combinado IF/IHC, hay múltiples fuentes posibles de variación o error que pueden requerir solución de problemas, que van desde la calidad del tejido a la experiencia del investigador hasta el manejo de muestras. La mayoría de los pasos críticos descritos anteriormente se consideran críticos porque requieren optimización a nivel de usuario individual o requieren destreza, habilidad y experiencia particulares. Sin embargo, hemos encontrado que la tinción de fondo inespecífico y la baja intensidad de la señal son los problemas más significativos que requieren optimización. Al igual que con cualquier protocolo IF o IHC, abordar estos problemas puede llevar mucho tiempo y trabajar, y puede ser compuesto con este método ya que las dos técnicas se combinan. Por esta razón, recomendamos encarecidamente optimizar IF e IHC por separado antes de continuar con el protocolo combinado.
Aunque predecimos que este método será útil para una amplia gama de experimentos, hay limitaciones potenciales. El rendimiento exitoso de este procedimiento depende del mantenimiento de muestras de tejido intactas a través de dos experimentos secuenciales que incluyen numerosos pasos de lavado. Por esta razón, cualquier problema que surja durante la sección o el manejo de tejidos, incluyendo el uso de diapositivas más antiguas que pueden haber se degradado en calidad, limitará significativamente la capacidad de los investigadores para realizar este protocolo con éxito. Aunque las diapositivas pueden almacenarse potencialmente a -80 oC durante un máximo de nueve meses, la adherencia del tejido a las diapositivas disminuye con el tiempo y tuvimos el mejor éxito con diapositivas que se utilizan dentro de un mes de preparación o idealmente, al día siguiente. Una segunda limitación es la pequeña huella de embriones de pez cebra. Si bien hemos encontrado que este experimento es útil para visualizar proteínas que se expresan relativamente abundantemente en embriones en etapa temprana, las proteínas que se expresan de manera inconsistente o en niveles bajos pueden ser muy difíciles de capturar en una sección. Por último, dado que el protocolo utiliza criosecciones de 10 u201212 m, es más adecuado para la evaluación de la expresión proteica en estructuras más grandes, como núcleos, en lugar de componentes subcelulares más pequeños.
En resumen, nuestro protocolo combinado IF/IHC será ventajoso para una amplia variedad de estudios en embriones de pez cebra en etapatempranas, y representa una innovación importante en el análisis preciso de la expresión de proteínas en estos especímenes. Nuestro método, que se muestra con éxito en la Figura5, permitirá a los investigadores preservar la delicada morfología de los embriones de pez cebra en etapa temprana en criosecciones mientras trabajan con la gama algo limitada de anticuerpos primarios disponibles actualmente que son validado para su uso en IF o IHC en esta especie. Este protocolo probablemente será útil para estudios en otras especies de peces y anfibios (por ejemplo, Medaka y Xenopus spp.), que se ven obstaculizados por limitaciones similares a la disponibilidad de anticuerpos, y pueden ser aplicables a los modelos tradicionales de mamíferos como Bien.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la concesión de NIH 5K01OD021419-02 y nc State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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