Summary
Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.
Abstract
L'étude des interactions intercellulaires exige souvent l'étiquetage discret des populations cellulaires spécifiques et la localisation précise de protéine. L'embryon de poisson zèbre est un excellent outil pour examiner de telles interactions avec un modèle in vivo. Des tests immunohistochimiques et immunofluorescence s'appliquent fréquemment dans les embryons de poissons zèbres pour évaluer l'expression des protéines. Cependant, il peut être difficile d'obtenir une cartographie précise des protéines colocalisées dans l'espace tridimensionnel. En outre, certaines études peuvent nécessiter l'utilisation de deux anticorps qui ne sont pas compatibles avec la même technique (par exemple, l'anticorps 1 ne convient qu'à l'immunohistochimie et l'anticorps 2 ne convient qu'à l'immunofluorescence). Le but de la méthode décrite ci-dessus est d'effectuer l'immunofluorescence séquentielle et/ou l'immunohistochemistry sur des cryosections individuelles dérivées des embryons de poisson zèbre de stade précoce. Ici nous décrivons l'utilisation des tours séquentiels de l'immunofluorescence, de l'imagerie, de l'immunohistochimie, de la formation image pour une seule cryosection afin d'atteindre l'identification précise de l'expression de protéine au niveau unicellulaire. Cette méthodologie convient à toute étude sur les embryons de poissons zèbres à un stade précoce qui nécessite une identification précise de plusieurs cibles protéiques dans des cellules individuelles.
Introduction
Le poisson zèbre est un organisme modèle extrêmement robuste qui est actuellement utilisé dans une grande variété de disciplines dans la recherche biomédicale. En particulier, le développement externe rapide et la translucidité des embryons de poissons zèbres constituent un excellent outil pour les études in vivo. Ici, nous décrivons une méthode pour l'immunofluorescence séquentielle (IF) et les analyses immunohistochemical (IHC) des embryons cryosectionnés de poisson zèbre. Cette nouvelle procédure utilise l'application séquentielle de deux anticorps sur une seule diapositive, permettant l'identification précise des protéines colocalisées au niveau cellulaire tout en conservant des sections de tissu. Ce protocole est particulièrement utile pour les études avec le modèle du poisson zèbre, car un nombre relativement faible d'anticorps ont été validés pour une utilisation dans les applications IF et/ou IHC chez le poisson zèbre par rapport aux modèles murins.
L'observation des interactions intercellulaires est un élément essentiel dans de nombreuses études, et peut fournir des informations clés sur les mécanismes moléculaires fonctionnant au niveau cellulaire qui sous-tendent les phénotypes au niveau de l'organisation. En outre, l'expression des protéines peut fournir des informations sur la fonction cellulaire, en particulier lors de l'examen de l'expression de plusieurs protéines simultanément dans la cellule (co-localisation). Bien que l'IHC et la FI à monture entière soient des techniques couramment utilisées pour analyser l'expression des protéines dans les embryons de poissons zèbres1,2,3,4,5, les procédures de montage entier peuvent être pour obtenir des données précises de colocalisation. D'après notre expérience, il peut être difficile de différencier les couches de tissu et de visualiser l'expression des protéines au niveau unicellulaire chez des spécimens à monture entière. Les logiciels d'imagerie peuvent généralement être incapables de faire la distinction entre la coloration de surface et la coloration plus profonde. Les expressions protéiques non-surface peuvent être masquées par une expression plus vive au niveau de la surface, ce qui entraîne des inexactitudes dans la quantification. En outre, la plupart des méthodes traditionnelles de défrichement du poisson zèbre sont assez toxiques6 et donc moins souhaitable pour une utilisation.
Les techniques à base d'anticorps, telles que la FI et l'IHC, sont souvent utilisées pour détecter l'expression des protéines dans des matériaux sectionnés, simplifiant ainsi l'identification de populations cellulaires distinctes qui expriment une protéine particulière dans des tissus complexes. IHC est couramment utilisé pour la colocalisation, le plus souvent en utilisant deux anticorps différents conjugués dans différentes espèces hôtes et visualisés avec différents chromogènes colorés4,7,8,9 , 10. Cependant, l'utilisation de chromogènes multiples peut conduire à la coloration de fond non spécifique ou à l'incompatibilité des couleurs11,12.
Nous avons développé un nouveau protocole pour la détection de protéines multiples par IF séquentiel et IHC sur les embryons cryosectionnés de poissons zèbres à un stade précoce. La cryosection est particulièrement bien adaptée aux tissus délicats tels que les embryons de poissons zèbres, et les cryosections sont supérieures aux sections incorporées à la paraffine pour les essais à base de fluorescence13,14. Nous avons choisi d'optimiser la FI combinée et l'IHC plutôt que la FI bicolore ou IHC, afin de contourner le problème de l'incompatibilité des anticorps pour un seul type d'épreuve. Ces problèmes sont particulièrement pertinents pour la recherche sur le poisson zèbre en raison du nombre limité d'anticorps disponibles dans le commerce qui sont validés pour une utilisation chez le poisson zèbre. En fait, une étude de quatre grandes entreprises a montré que les anticorps disponibles dans le commerce pour une utilisation chez la souris était d'environ 112 000 contre environ 5 300 pour une utilisation chez le poisson zèbre15. Enfin, nous avons choisi de développer un protocole qui pourrait être réalisé sur une seule cryosection, ce qui est essentiel lorsque nous travaillons avec des échantillons de tissus petits ou limités tels que sont obtenus à partir d'embryons de poissons zèbres.
Ce protocole a été conçu pour évaluer le comportement proliférant des cellules donneuses dans 48 h après la fécondation des embryons de poissons zèbres chimériques qui ont été générés par la greffe blastula-à-blastula comme décrit par Carmany-Rampey et Moens16. Des embryons de donneur ont été injectés à l'étape d'une cellule avec un conjugué fluorescent de dextran avant la transplantation des cellules de distributeur dans les embryons de destinataire. Nous avons utilisé l'immunofluorescence pour Ser 10 phosphorylated Histone H3 (pH3) pour détecter les cellules proliférantes suivies par l'immunohistochimie pour le dextran étiqueté pour détecter les cellules de donneur dans les embryons de poisson zèbre chimérique. La détection séquentielle du pH3 et du dextran étiqueté dans une seule cryosection nous a permis d'identifier et de quantifier les cellules individuelles qui exprimaient les deux marqueurs.
Ce protocole séquentiel IF/IHC pour le poisson zèbre cryosectionné fournira un outil utile pour les chercheurs de poissons zèbres qui désirent un protocole de colocalisation pour l'expression des protéines. Les problèmes que ce protocole a été conçu pour résoudre, tels que les petits spécimens de tissus et la disponibilité limitée des anticorps, ne sont pas propres au modèle du poisson zèbre. Cette méthode peut donc être utile à tout chercheur désireux d'effectuer des IF/IHC séquentiels.
ÉNONCÉ D'ÉTHIQUE :
Toutes les études sur les animaux ont été approuvées par l'Institutional Animal Care and Use Committee, North Carolina State University, Raleigh, North Carolina, USA.
Protocol
1. Préparation d'embryons
- Fixer 48 h après la fécondation (hpf) embryons de poissons zèbres chimériques générés par la greffe de blastula à blastula entre ab embryons de poissons zèbres de type sauvage dans 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit avec bascule mentà à 4 oC. Effectuer deux lavages de 5 minutes avec bascule à température ambiante à l'aide de 500 l de 1x phosphate tamponné saline contenant 0,1% d'un surfactant non ionique (1x PBSt; voir le tableau des matériaux)
REMARQUE: Le paraformaldéhyde est toxique et cancérogène et doit être correctement éliminé par règlement institutionnel. Le travail avec le paraformaldéhyde doit être effectué dans une hotte chimique, et l'équipement de protection individuelle approprié (gants, manteau de laboratoire, et lunettes de sécurité) devrait toujours être employé. - Déshydrater les embryons en les lavant séquentiellement avec 500 l de 30 %, 50 % et 70 % de méthanol (MeOH) dilués avec 1 x PBSt pendant 10 min chacun à température ambiante avec bascule. Incuber les embryons dans 500 oL de 100 % MeOH à -20 oC pendant au moins 14 h.
REMARQUE: Le méthanol est toxique et doit être correctement éliminé par règlement institutionnel. Le travail avec le méthanol doit être effectué dans une hotte chimique, et l'équipement de protection individuelle approprié (gants, manteau de laboratoire, et lunettes de sécurité) devrait toujours être employé. - Réhydratez les embryons en lavant séquentiellement avec 500 l de 70 %, 50 % et 30 % de MeOH dilués avec 1 x PBSt pendant 10 min chacun à température ambiante avec bascule. Effectuer deux lavages de 5 min avec 500 l de 1x PBSt à température ambiante avec bascule.
- Retirer le 1x PBSt et couver dans 500 L de 30% de saccharose dilué avec de l'eau déionisée à température ambiante avec bascule jusqu'à ce que les embryons coulent au fond du tube (environ 1 h). Remplacer le saccharose par 500 oL de gélatine de poisson de 15 % /25 % de saccharose (15/25; voir la Table des matériaux) et incuber à température ambiante avec bascule pendant la nuit.
- Remplacer environ la moitié du volume de 15/25 par un milieu de coupe optimal (amTU moyen) et couver à température ambiante par bascule jusqu'à ce que les embryons s'enfoncent au fond du tube (environ 1 h).
- Remplacer environ la moitié du volume par le milieu OCT et incuber à température ambiante par bascule pendant 1 h. Répétez cette étape une fois.
- Pendant les étapes d'incubation avec 15/25 et le milieu OCT, inverser ou faire glisser le tube au besoin pour combiner ces réactifs.
2. Embedding et préparation d'embryons de cryosections
- Transférer les embryons dans un moule en plastique (voir la Table des Matériaux) avec des forceps, minimisant tout transfert du mélange 15/25-OCT. Remplir le moule à peu près à moitié plein avec le milieu OCT et mélanger délicatement les embryons dans le milieu OCT.
- Préparer les moules en plastique étiquetés et transférer les embryons désirés (généralement 1 embryons de 20123) dans les moules en plastique vides et étiquetés, en minimisant le report du milieu OCT. Une fois que les embryons désirés sont dans le moule en plastique, remplir délicatement avec le milieu OCT au sommet du moule.
- Utilisez des forceps ou des aiguilles de 25 G pour organiser les embryons à l'orientation désirée, à l'aide d'un microscope stéréomicroscope léger pour la visualisation (Figure 1A, B).
- Congeler les moules préparés sur de la glace sèche dans un contenant isolé avec une plate-forme métallique. Placez un seau à glace ou une glacière en mousse doucement sur la plate-forme métallique pour créer une chambre froide (Figure 1C, D)
-
Préparer des cryosections d'une épaisseur de 10'u201212 à l'aide d'un cryostat réglé à -20 oC.
- Configurez un bloc à la fois et utilisez le milieu OCT pour le congeler sur le disque/chuck avec le fond du bloc orienté vers la lame (Figure 2A). Assurez-vous que le bloc est complètement gelé sur le disque (le milieu OCT deviendra blanc) avant de commencer la section (figure2B).
- Placez les cryosections sur les lames de verre chargées (figure2C,D)et séchez les lames pendant la nuit à température ambiante.
3. Immunofluorescence pour pH3
- Effectuer trois lavages de 5 min des lames dans 1x PBS dans un récipient approprié, comme un pot De Coplin. Si les tissus ne sont pas bien respectés à la glissière, effectuer des lavages en posant des diapositives sur une surface plane et en pipetilage doucement 500 'L de 1x PBS sur la surface. Verser 1x PBS entre les lavages en faisant basculer doucement les lames.
- Décrivez les sections à l'eau avec un stylo-barrière ou un crayon de cire pour garder le liquide sur les glissières (figure 3).
- Déposer les toboggans sur une surface plane dans une chambre humide et une pipette de 200 l de tampon de bloc par section sur les toboggans. Incuber dans un tampon de bloc pendant 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 oC.
- Préparer la dilution des anticorps primaires (anticorps anti-pH3 de lapin, 1:200; voir Tableau des matériaux) dans un tampon de bloc et bien mélanger par pipetting. Inclinez doucement les glissières pour vider le tampon de bloc, retournez à la chambre humide, et pipette 200 L de solution d'anticorps primaire par section sur les glissières. Pour le contrôle secondaire seulement, pipette 200 'L de tampon de bloc sur les sections appropriées.
- Incuber les toboggans à 4 oC pendant la nuit dans une chambre humide remplie d'eau déionisée. Scellez les bords de la chambre humide pour aider à retenir l'humidité.
- Effectuer trois lavages de 5 min des lames dans 1x PBS dans un récipient approprié, comme un pot De Coplin. Pendant les étapes de lavage, préparer la dilution secondaire des anticorps (anticorps secondaires fluorescents anti-lapin, 1:2 000; voir Tableau des matériaux) dans un tampon de bloc et bien mélanger par pipetting.
- Déposer les toboggans sur une surface plane dans une chambre humide et une pipette de 200 l de solution d'anticorps secondaire par section sur les glissières. Incuber les diapositives dans des solutions d'anticorps secondaires à température ambiante, à l'abri de la lumière, pendant 30 min.
- Effectuer trois lavages de 5 min des glissières dans 1x PBS dans un récipient approprié, comme un pot de Coplin, à l'abri de la lumière. Pendant les étapes de lavage, préparer une solution de coloration nucléaire (voir la Table des Matériaux).
- Placez les glissières sur une surface plane et la pipette 200-u2012500 L (selon la taille de l'échantillon) de la solution de coloration nucléaire sur chaque section. Incuber les diapositives dans la solution de coloration nucléaire pendant 10 min, à l'abri de la lumière.
- Égoutter la solution de coloration nucléaire et monter les diapositives avec des supports de montage fluorescents non durcissants et un bordereau en verre. Maintenir les glissières dans l'obscurité à 4 oC jusqu'à ce que l'imagerie soit effectuée.
REMARQUE: Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque les diapositives sont représentées le même jour ou le lendemain. - Après IF, visualisez et imagez les diapositives à l'aide d'un microscope à fluorescence confocale et d'un appareil photo numérique à l'aide de filtres d'émission de 555 nm (rouge) et 645 nm (loin-rouge) à 100x grossissement (grossissement oculaire 10x et grossissement objectif 10x). Maintenez la puissance de laser cohérente tout au long de l'imagerie.
- Après l'imagerie, placez les glissières dans des contenants individuels de 1x PBS et conservez-les à l'appartement à 4 oC pendant la nuit pour vous préparer à l'enlèvement des glissières de couverture. Lorsque vous placez les glissières dans 1x PBS, agiter doucement les diapositives pour aider à enlever la glissière.
REMARQUE: Ne pas appuyer sur le bordereau de couverture ou tenter de supprimer le bordereau manuellement, car cela peut compromettre la qualité des sections. Les couvertures doivent être enlevées horizontalement avec un minimum de mouvement forcé.
4. Immunohistochimie pour Dextran étiqueté
- Une fois les feuilles de couverture enlevées, transférer délicatement les lames dans de nouveaux 1x PBS dans un contenant approprié, comme un bocal Coplin. Retirez le 1x PBS et effectuez trois incubations de 5 minutes des diapositives dans 1x Tris-buffered saline avec 0,1% d'un surfactant non ionique (1x TBSt) à température ambiante.
- Préparer 250 ml de peroxyde d'hydrogène de 3 % (H2O2) dilué dans de l'eau déionisée dans un contenant de taille appropriée. Incuber les lames dans une solution de 3 % H2O2 à température ambiante pendant 15 min.
REMARQUE: Le peroxyde d'hydrogène est corrosif et doit être correctement éliminé par règlement institutionnel. L'équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité) doit toujours être utilisé. - Rincer rapidement les glissières à l'eau déionisée. Effectuer trois lavages de 5 min des glissières dans 1x TBSt. Séchez soigneusement la zone autour des sections de tissu et placez les glissières à plat dans une chambre humide. Décrivez les sections de tissu avec un stylo barrière ou un crayon de cire pour garder le liquide sur les sections si nécessaire.
- Appliquer une solution de blocage de sérum prête à l'emploi de 2,5 % fournie avec un kit d'étiquetage secondaire des anticorps (voir le tableau des matériaux)dans le sens de la goutte à chaque section. Incuber les toboggans dans une chambre humide à température ambiante pendant 20 min.
- Préparer l'anticorps primaire dilué dans le diluant d'anticorps (lapin anti-étiqueté dextran, 1:7,500; voir la Table des Matériaux) et mélanger par pipetting douce. Inclinez doucement les glissières pour drainer le tampon de bloc, séchez la zone autour des sections, et placez les glissières à plat dans une chambre humide.
- Ne pas laver avant d'appliquer la solution d'anticorps primaire. Pipette 200 l de solution d'anticorps primaire par section sur les toboggans et incuber dans une chambre humide à 4 oC pendant la nuit. Pour le contrôle secondaire seulement, pipette 200 'L de diluant d'anticorps sur les sections appropriées.
- Inclinez doucement les glissières pour égoutter la solution d'anticorps primaire et placez-les dans 1x TBSt dans un contenant approprié, comme un bocal Coplin. Effectuer deux lavages de 5 min des toboggans dans 1x TBSt. Séchez la zone autour des sections et placez à plat dans une chambre humide.
- Appliquer un réactif de blocage de réduction de fond prêt à l'emploi (voir la Table des Matériaux)dans le sens de la chute à chaque section. Incuber les toboggans dans une chambre humide à température ambiante pendant 20 min.
- Inclinez doucement les glissières pour égoutter le tampon de bloc, séchez soigneusement la zone autour des sections, et placez les glissières à plat dans une chambre humide. Ne pas laver avant d'appliquer la solution d'anticorps secondaire.
- Appliquer une solution d'anticorps secondaire prête à l'emploi (anticorps secondaire en polymère de raifort anti-lapin (HRP) ; voir le Tableau des matériaux) à chaque section dans le sens goutte et incuber dans une chambre humide à température ambiante pendant 30 min.
- Inclinez doucement les glissières pour égoutter la solution d'anticorps secondaire et placez-les dans 1x TBSt dans un contenant approprié, comme un bocal Coplin. Effectuer deux lavages de 5 min des diapositives en 1x TBSt.
- Préparer le substrat chromogénique HRP immédiatement avant utilisation selon le protocole du fabricant (voir le Tableau des matériaux).
- Séchez la zone autour des sections, placez les glissières sur une surface plane et appliquez 200 l du substrat chromogénique HRP à chaque section. Incuber à température ambiante pendant 3 min, en commençant une minuterie lorsque le substrat a été appliqué sur la première diapositive (Figure 4).
- Égoutter la solution de substrat et rincer brièvement les lames dans un bocal Coplin contenant 1x PBS. Placez les toboggans dans de l'eau déionisée dans un récipient approprié, comme un bocal Coplin, et effectuez deux lavages de 5 min dans de l'eau déionisée avec une douce agitation.
- Contre-tachent les diapositives en les plaçant dans une solution de coloration à l'hématoxylin jusqu'à 30 s.
REMARQUE: L'hématoxylin est toxique et doit être éliminée par règlement institutionnel. L'équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité) doit toujours être utilisé. - Placez les toboggans dans de l'eau déionisée dans un récipient approprié, comme un bocal Coplin, et effectuez trois lavages de 5 min dans de l'eau déionisée. Transférer les glissières dans un récipient contenant l'eau du robinet de Scott (voir la Table des matériaux)et couver pendant 1 min.
- Placez les toboggans dans de l'eau déionisée dans un récipient approprié, comme un bocal Coplin, et effectuez trois lavages de 5 min dans de l'eau déionisée.
- Déshydrater les glissières à l'eau (EtOH) (diluée dans de l'eau déionisée) et le xylène dans une hotte chimique. Effectuez une incubation de 2 min dans 70 % et oh, deux incubations de 1 min dans 95 % etOH, deux incubations de 1 min dans 100 % EtOH et trois incubations de 1 min en xylène. Retirer les lames du xylène et placer une glissière de couverture humide avec un milieu de montage à base de toluène dans une hotte chimique.
REMARQUE: Le xylène et le toluène sont toxiques et inflammables et doivent être éliminés correctement selon la réglementation institutionnelle. Le travail avec le xylène et le toluène doit être effectué dans une hotte chimique, et l'équipement de protection individuelle approprié (gants, blouse de laboratoire, et lunettes de sécurité) devrait toujours être employé. - Après IHC, visualisez et imagez les diapositives à l'aide d'un microscope léger composé et d'un appareil photo numérique à 100 x grossissement (10x grossissement oculaire et grossissement objectif 10x). (Figure 5).
Representative Results
Nous avons développé ce protocole afin d'identifier et d'analyser l'expression des protéines dans les cellules de donneurs individuels dans 48 h après la fécondation des embryons de poissons zèbres chimériques qui ont été générés par la greffe blastula-blastula entre ab des embryons de poissons zèbres de type sauvage. Une analyse réussie de l'expression des protéines au niveau d'une cellule a nécessité la préparation de cryosections avec des embryons correctement orientés (figure1 et figure 2) et une application soigneuse et séquentielle des techniques de FI et iHC à ces cryosections(figure 3 et figure 4). L'utilisation d'anticorps spécifiques pour détecter simultanément les cellules proliférantes (anti-pH3, Figure 5A, B) et les cellules donneuses (dextran anti-étiqueté, figure 5D)peuvent être utilisées pour identifier et quantifier les cellules donneuses qui prolifèrent activement ( Figure 5E). Il est essentiel de générer des images de haute qualité après IF (Figure 2A, B) et IHC ( Figure2D) afin d'identifier avec précision les cellules individuelles. Un programme d'analyse d'image doit être utilisé pour effectuer une mise en jadis d'image (figure 5E). Selon le programme d'analyse d'image utilisé, il peut être possible d'effectuer des comptages automatisés des cellules étiquetées si la quantification est souhaitée.
Figure 1 : Préparation des blocs OCT congelés. (A) vue microscopique 50x des embryons dans OCT dans un moule cryogénique préparé pour la congélation. La flèche rouge indique la position de la tête de l'embryon de poisson zèbre contre la surface inférieure du moule ; flèche noire indique la queue pointant vers l'utilisateur. (B) Moules en plastique avec embryons et OCT placés sur plate-forme métallique réfrigérée. (C) Seau à glace en mousse placé sur des moules en plastique pour créer une chambre de congélation. (D) OCT devient blanc à partir de transparent une fois que le bloc est complètement gelé. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Cryosectioning des blocs OCT congelés. (A), Application de l'OCT frais sur le disque de cryostat et placement du bloc congelé sur OCT, tourné à 180 degrés de l'orientation de congélation du bloc. (B) Vue latérale du bloc gelé au disque de sectionnement. (C) Vue du bloc de sectionavecavec la plaque de rouleau en position. (D) Ramassage des sections à l'aide d'une glissière chargée à partir de la plate-forme métallique du cryostat. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Vue des sections préparées après le placement sur une diapositive. La flèche indique la barrière hydrophobe, et la ligne pointillée délimite la zone contenant des sections dans le périmètre de barrière. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Préparation à l'application de substrat chromogénique pendant le CSI. La glissière est placée sur une surface plane recouverte d'une pellicule plastique pour permettre l'application uniforme du substrat chromogénique tout en contenant tout déversement de matières dangereuses. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : L'étiquetage représentatif de la FI et de l'IHC des embryons de poisson zèbre chimériques cryosectionnés de 48 hpf générés par la greffe de blastula à blastula entre des embryons de poissons zèbresde type sauvage AB. (A) IF pour détecter L'expression de l'histone H3 phosphorylé Ser 10 (anti-pH3, 1:200) dans l'embryon de poisson zèbre chimérique de 48 hpf. Cellules rouges et pH3-positives; bleu et noyaux. Les flèches jaunes indiquent des exemples de cellules positives. (B) La soustraction de la tache nucléaire bleue dans l'image numérique (logiciel ImageJ) améliore la visualisation des cellules pH3-positives pour la quantification et la superpose d'image. (C) Contrôle négatif (anticorps secondaire seulement) pour le test IF dans l'embryon cryosectionné de 48 hpf de poisson zèbre chimérique. La barre d'échelle représente 50 m (applicable à tous les panneaux). (D) IHC pour détecter le dextran étiqueté (dextran anti-étiqueté, 1:7,500) dans l'embryon chimérique de 48 hpf de poisson zèbre produit par la greffe de blastula-à-blastula entre ablencées de type sauvage embryons de poisson zèbre. Des embryons de donneur ont été injectés avec un conjugué fluorescent de dextran étiqueté à l'étape d'une cellule avant d'employer pour la greffe de blastula-à-blastula. Le rouge indique les cellules étiquetées avec un conjugué dextran ; bleu indique noyaux. Les flèches jaunes indiquent des exemples de cellules positives. (E) Superposement du panneau B (IF pour pH3) et du panneau C (IHC pour le dextran étiqueté) montrant la colocalisation de l'expression pH3 et de l'étiquetage dextran dans les cellules individuelles. Les flèches jaunes indiquent des exemples de cellules à double positif. (F) Contrôle négatif (anticorps secondaire seulement) pour l'analyse iHC dans cryosectioned 48 hpf embryon de poisson zèbre chimérique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Nous avons présenté une nouvelle méthode pour l'immunofluorescence combinée et l'immunohistochimie qui représente une étape importante en effectuant des expériences de colocalisation sur des embryons cryosectionnés de poisson zèbre. Il y a un manque critique de protocoles de colocalisation existants qui sont optimisés pour une utilisation avec de petits embryons et du matériel cryosectionné17,18, qui sont tous deux couramment utilisés dans les études moléculaires14. Les protocoles de colocalisation existants se concentrent principalement sur la visualisation simultanée de deux fluorophores17,18. Bien que ces protocoles puissent bien fonctionner, leur utilité est limitée par la disponibilité d'anticorps qui (i) peuvent être utilisés dans le poisson zèbre et (ii) sont compatibles avec IF.
Nous pensons que l'utilisation de la cryosection pour les embryons de poissons zèbres offre un avantage significatif en termes de morphologie des tissus préservés. Comme le CiPH est plus couramment pratiqué sur les sections de paraffine que la cryosection7,8, une exploration plus approfondie des méthodes IHC basées sur la cryosection pour la détection de l'expression des protéines est justifiée. L'utilisation de la monture entière IF est une méthode courante pour visualiser les niveaux d'expression dans les embryons de poissons zèbres, et est plus couramment décrite dans la littérature que SI en utilisant cryosections1,2,3,4, 19. Cependant, les protocoles de montage entier ont des limites, y compris l'absence de localisation précise des protéines exprimées dans les tissus profonds et le potentiel pour l'expression de niveau de surface pour obscurcir l'expression de protéine dans les tissus plus profonds. Nous avons constamment observé l'excellent entretien de la morphologie cellulaire suivant la cryoconservation, le sectionnement, et la FI et iHC séquentielles. Pour les applications qui nécessitent une localisation précise de l'expression des protéines au niveau unicellulaire, il y a un avantage significatif aux procédures basées sur la section comme nous l'avons décrit dans ce protocole. L'incorporation de résine offre une option alternative pour effectuer des tests IF ou IHC sur des sections d'embryons de poissons zèbres à un stade précoce20. Les sections de résine fournissent la conservation supérieure de la morphologie de tissu comparée aux cryosections, et des sections de tissu relativement plus minces peuvent être préparées. Cependant, les fabricants ne recommandent généralement pas l'utilisation de sections de résine pour les essais immuno-basés, car certains composants des résines ne peuvent pas être retirés des sections et peuvent masquer les sites de liaison d'anticorps21.
Bien que l'ensemble du protocole soit essentiel pour une analyse précise et réussie des modèles d'expression, quelques étapes spécifiques sont essentielles au succès expérimental. La première étape critique est la manipulation des embryons lors de l'intégration dans OCT13,14. Il peut être difficile d'orienter chaque embryon dans le même plan transversal afin que les sections soient coupées à peu près de la même zone pour tous les embryons. Nous avons constaté que l'utilisation d'aiguilles à petite jauge pour effectuer de petits mouvements délibérés à travers le milieu visqueux OCT pour l'orientation des embryons est supérieure à l'utilisation de forceps, qui sont trop grands et déplacer trop de milieu OCT. Une deuxième étape critique se produit lors de la section des blocs congelés, car il peut être difficile d'obtenir des sections de haute qualité qui contiennent le tissu désiré sans formation et expérience significatives. Nous recommandons donc l'utilisation d'échantillons d'essai jusqu'à ce que la technique soit maîtrisée. Une troisième étape critique est l'enlèvement de la feuille de couverture, qui a le potentiel de perturber ou de dépouiller les échantillons de tissus. Nous avons constaté qu'une combinaison d'agitation douce pour desserrer la glissade de couverture et le retrait lent de la glissière du récipient de PBS est l'approche la plus efficace pour enlever des couvertures. Une main douce et régulière est la meilleure; les chercheurs peuvent constater que certains essais et erreurs sont nécessaires pour apprendre à supprimer efficacement les fiches de couverture.
D'autres étapes importantes dans le protocole comprennent l'optimisation des anticorps (anticorps primaires et secondaires pour les essais IF et IHC) et l'exposition des diapositives au substrat chromogénique et à la contre-tache. Une recherche approfondie sur la spécificité des anticorps primaires et la concentration cible est essentielle; en général, il est préférable de recueillir suffisamment d'échantillons non précieux pour au moins deux expériences distinctes pour la FI et l'IHC qui seront effectuées pour optimiser les concentrations d'anticorps primaires avant de commencer la combinaison IF/IHC. L'inclusion d'un contrôle positif et négatif connu pour chaque anticorps primaire est essentielle dans chaque expérience pour s'assurer que les tests IF et IHC sont performants de manière appropriée. Des ajustements à la concentration secondaire d'anticorps peuvent également être nécessaires. L'optimisation de l'exposition des sections tissulaires au substrat chromogénique et à la contre-tache pour l'analyse du CSI est nécessaire, puisque les lignes directrices du fabricant décrivent souvent un large éventail de temps d'exposition possibles. Tous les chromogènes ne peuvent pas être compatibles avec les contre-taches et la pigmentation des tissus endogènes, ce qui nécessite une planification minutieuse en ce qui concerne la sélection des chromogènes.
Il existe de nombreuses modifications potentielles qui peuvent être appliquées au protocole décrit, et nous avons réussi ce protocole avec d'autres combinaisons d'anticorps qui ne pouvaient pas être utilisés à la fois pour IF. Comme mentionné ci-dessus, les substances chromogéniques ont une compatibilité distincte avec des contretaches spécifiques. Nous avons constaté que ces composants sont facilement modifiables dans le protocole. En outre, les paramètres d'incubation des anticorps sont assez flexibles, et peuvent être augmentés ou diminués en fonction de l'intensité de coloration désirée. Le processus d'intégration peut également être modifié. Bien que nous nous soyons concentrés sur les sections transversales, les embryons peuvent facilement être orientés dans n'importe quelle direction pour aborder des tissus particuliers d'intérêt. Enfin, il y a plusieurs points de pause possibles dans ce protocole. Les embryons déshydratés peuvent être stockés à 100% MeOH à -20 oC pendant quelques mois; les blocs congelés peuvent être entreposés à -80 oC pendant une période pouvant aller jusqu'à trois mois; et les diapositives préparées peuvent être stockées à -80 oC pendant jusqu'à neuf mois dans une boîte à glissière.
En raison de la complexité relative de ce protocole combiné IF/IHC, il existe de multiples sources possibles de variation ou d'erreur qui peuvent nécessiter un dépannage, allant de la qualité des tissus à l'expérience du chercheur en passant par la manipulation d'échantillons. La plupart des étapes critiques décrites ci-dessus sont considérées comme critiques parce qu'elles nécessitent soit une optimisation au niveau de l'utilisateur individuel, soit qu'elles nécessitent une dextérité, une compétence et une expérience particulières. Cependant, nous avons constaté que la coloration de fond non spécifique et la faible intensité du signal sont les problèmes les plus importants nécessitant une optimisation. Comme avec n'importe quel protocole de SI ou d'IHC, adresser ces issues peut être long et laborieux, et peut être composé avec cette méthode puisque les deux techniques sont combinées. Pour cette raison, nous recommandons fortement d'optimiser la FI et le CSI séparément avant de procéder au protocole combiné.
Bien que nous prédisions que cette méthode sera utile pour un large éventail d'expériences, il existe des limites potentielles. La performance réussie de cette procédure dépend du maintien d'échantillons de tissus intacts grâce à deux expériences séquentielles qui comprennent de nombreuses étapes de lavage. Pour cette raison, tous les problèmes qui surviennent lors de la section ou de la manipulation des tissus, y compris l'utilisation de diapositives plus anciennes qui peuvent avoir dégradé en qualité, limitera considérablement la capacité des chercheurs à exécuter ce protocole avec succès. Bien que les diapositives puissent être stockées à -80 oC pendant jusqu'à neuf mois, l'adhérence des tissus aux diapositives diminue avec le temps et nous avons eu le meilleur succès avec les diapositives qui sont utilisées dans un mois de préparation ou, idéalement, le lendemain. Une deuxième limitation est la faible empreinte d'embryons de poissons zèbres. Bien que nous ayons trouvé cette expérience utile pour visualiser des protéines qui sont relativement abondamment exprimées dans les embryons à un stade précoce, les protéines qui sont exprimées de façon incohérente ou à de faibles niveaux peuvent être très difficiles à capturer dans une section. Enfin, puisque le protocole utilise des cryosections de 10 à 201212 m, il est le mieux adapté à l'évaluation de l'expression des protéines dans les structures plus grandes, comme les noyaux, plutôt que pour les composants sous-cellulaires plus petits.
En résumé, notre protocole combiné IF/IHC sera avantageux pour une grande variété d'études sur des embryons de poissons zèbres à un stade précoce, et représente une innovation importante dans l'analyse précise de l'expression des protéines chez ces spécimens. Notre méthode, présentée avec succès à la figure5, permettra aux chercheurs de préserver la morphologie délicate des embryons de poissons zèbres à un stade précoce dans les cryosections tout en travaillant avec la gamme quelque peu limitée d'anticorps primaires actuellement disponibles qui sont validé pour une utilisation en FI ou IHC chez cette espèce. Ce protocole sera probablement utile pour les études menées sur d'autres espèces de poissons et d'amphibiens (p. ex. Medaka et Xenopus spp.), qui sont entravées par des limitations similaires à la disponibilité des anticorps, et qui peuvent s'appliquer aux modèles de mammifères traditionnels comme bien.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention des NIH 5K01OD021419-02 et NC State University College of Veterinary Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15/25 | N/A | N/A | 15% fish gelatin/25% sucrose w/v, made in dH2O |
| Alexa 555 secondary antibody | Invitrogen | A21429 | used at 1:2,000 dilution in block buffer for IF |
| Antibody Diluent | Dako | S3022 | |
| Background Buster | Innovex | NB306 | |
| block buffer (IF) | N/A | N/A | 5% normal goat serum, 0.1% Triton X-100 in 1x PBS |
| cellSens imaging software | Olympus | cellSens | imaging software used with compound light microscope |
| chimeric zebrafish embryos | N/A | N/A | AB wild-type chimera zebrafish embryos analyzed at 48 hpf |
| Compound light microscope | Olympus | BX51 | used with digital camera and cellSens imaging software for image capture after IHC |
| Confocal fluorescence microscope | Leica | DM 2500 | used with digital camera and Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software for image capture after IF |
| Disposable plastic molds, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Ted Pella | 27147-2 | |
| Digital camera, light microscope | Olympus | DP27 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Leica | TCS SPE | |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fish gelatin | Sigma | G7041 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Hydrogen peroxide, 30% | Fisher | H325-100 | |
| ImmPRESS HRP Polymer detection kit | Vector | MP-7401 | anti-rabbit secondary antibody, HRP polymer |
| Leica Application Suite Advanced Fluorescence imaging software | Leica | LAS AF 2.3.6 | imaging software used with confocal fluorescence microscope |
| Methanol | Fisher | A452-4 | |
| Modified Meyer's Hematoxylin | Thermo | 72804 | |
| Normal Goat Serum | MP Biomedical | 191356 | |
| OCT medium | Tissue-Tek/Fisher | 4583/4585 | |
| anti-Oregon Green antibody | Molecular Probes/Life Technologies | A889 | used at 1:7500 dilution for IHC |
| Oregon Green Dextran | Invitrogen | P7171 | used at 2.5% in 0.2 M KCl |
| Paraformaldehyde, 4% | Acros Organics | 416780030 | made in lab in 1x PBS |
| Permount | Fisher | SP15 | |
| 1x phosphate-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x phoshpate-buffered saline | made in lab | N/A | use Cold Spring Harbor protocol |
| 1x PBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x PBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| anti-Ser10 phosphorylated Histone H3 antibody | Santa Cruz | sc-8656-R | used at 1:500 dilution for IF |
| Scott's Tap Water | Electron Microscopy Sciences | 26070-06 | have used other brands successfully in addition to EMS |
| Sucrose | Amresco | 335 | |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | |
| TO-PRO3 | Invitrogen | T3605 | used at 1:1,000 in 1x PBS for IF |
| 1x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, up to 500 mL volume with dH2O |
| 10x Tris-buffered saline | made in lab | N/A | 85 g NaCl, 61 g Tris base, up to 1 L volume with dH2O |
| 1x TBSt | made in lab | N/A | 50 mL 10x TBS, 1 mL 10% Tween 20, up to 500 mL volume with dH2O |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Vectashield | Vector | H-1000 | non-hardening mounting media |
| Vector NovaRed substrate | Vector | SK-4800 | HRP substrate |
| Xylene | Fisher | X3P-1GAL |
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