CRISPR/Cas12a-systemet i kombination med et enkelt crRNA-array muliggør effektiv multiplex-redigering af S. cerevisiae -genomet på flere loci samtidigt. Dette påvises ved at konstruere carotenoid producerer gær stammer, som efterfølgende bruges til at skabe gær pixel kunst.
Høj effektivitet, brugervenlighed og alsidighed af grupperet regelmæssigt hinanden korte palindromiske gentagelser/crispr-associerede protein 9 (crispr/Cas9) system har lettet avanceret genetisk modifikation af Saccharomyces cerevisiae, en model organisme og arbejdshest i industriel bioteknologi. CRISPR-associeret protein 12a (Cas12a), en RNA-styret endonuklease med funktioner, der adskiller sig fra Cas9, anvendes i dette arbejde, hvilket yderligere udvider den molekylære værktøjskasse til genom-redigeringsformål. En fordel ved crispr/Cas12a systemet er, at det kan bruges i multiplex genom redigering med flere guide RNAs udtrykt fra en enkelt transkriptional enhed (enkelt crispr RNA (crrna) array). Vi præsenterer en protokol for multiplex integration af flere heterologe gener i uafhængige loci af S. cerevisiae genom ved hjælp af crispr/Cas12a system med flere crrnas udtrykt fra en enkelt crrna array konstruktion. Den foreslåede metode udnytter S. cerevisiae evne til at udføre in vivo rekombination af DNA-fragmenter til at samle den enkelte crrna array i en plasmid, der kan bruges til transformerende udvælgelse, samt samling af donor DNA sekvenser, der integreres i genomet på de tilsigtede positioner. Cas12a er præ-udtrykt konstitutivt, lette spaltning af S. cerevisiae genom på de påtænkte positioner ved ekspression af den enkelte crrna array. Protokollen omfatter design og konstruktion af et enkelt crRNA-array og donor-DNA-udtryks kassetter og udnytter en integrationstilgang, der gør brug af unikke 50-BP-DNA-stik sekvenser og separate integrations flanke-DNA-sekvenser, hvilket forenkler Eksperimentel design gennem standardisering og modularisering og udvider rækken af applikationer. Endelig viser vi en ligetil teknik til at skabe gær pixel kunst med en akustisk væske handler ved hjælp af forskelligt farvet carotenoid producerer gærstammer, der blev konstrueret.
CRISPR/CAS-enzymer har utvivlsomt revolutioneret molekylær biologi og er blevet bredt vedtaget som værktøjer til ingeniør genomer med en hastighed, der ikke tidligere var gennemførlig1. Den første ændring af en Saccharomyces cerevisiae genom ved crispr/Cas9 genom redigeringssystem blev rapporteret af DiCarlo et al. 2, viser vellykket gen knock-out og gøre punktmutationer ved hjælp af eksternt introducerede oligonucleotides. Yderligere udvikling af gær CRISPR Toolbox omfattede: transkriptional regulering ved fusion af katalytisk inaktive Dead Cas9 (dCas9) med transkriptional Effector domæner for at muliggøre aktivering og hæmning af transkriptionen3, ansøgning om både genomredigering og reguleringsfunktioner for metabolisk pathway Engineering ved samtidig aktivering, undertrykkelse og sletning4, sletning af store fragmenter fra S. cerevisiae genom5og multiple-kromosom fusioner6 .
CRISPR/CAS-genomredigeringssystemer finder deres oprindelse i adaptive immun systemer af bakterier og archaea, og disse systemer er blevet tilpasset af molekylære biologer til genomredigering. Deres funktionalitet er baseret på klynger regelmæssigt Interspaced korte Palindromic gentagelser (CRISPR) DNA regioner kodning RNA ansvarlig for anerkendelse af det fremmede DNA eller RNA og CRISPR associerede gener (CAS) som koder RNA-guidede endonukleaser1,7,8,9. På baggrund af den nylige genomanalyse af CRISPR/CAS-systemer blev det foreslået at opdele CRISPR/CAS-systemerne i to klasser, fem typer og 16 undertyper10. De to klasser er kendetegnet på grundlag af organiseringen af Effector komplekser involveret i Target kavalergang. CRISPR/CAS-systemer med en organisation med flere under enheder kategoriseres typisk som klasse 1, hvorimod enkelt enheder under enheds-Effector tilhører klasse 210,11. I dette papir udforsker vi klasse 2 type V Cas12a, tidligere kaldet Cpf110,12, som er et alternativ til klasse 2 type II Cas9. Selv om Cas9 er velkarakteriseret og meget udbredt i forskning, Cas12a tilbyder yderligere funktioner12. For det første danner Cas12a et kompleks med CRISPR RNA (crRNA) på 42 til 44 nucleotider uden at kræve en yderligere Trans-aktivering af CRISPR RNA (tracrRNA). Derfor kan en kortere guide RNA udnyttes i genomredigering med CRISPR/Cas12a systemer sammenlignet med CRISPR/Cas9. For det andet muliggør den unikke endonuklease-og endoribonucleaseaktivitet af Cas12a modning af dens præ-crRNA13. Denne RNase aktivitet giver mulighed for kodning af flere crrnas på en enkelt crispr crrna array, mens Cas9 kræver separat udtryk for hver såkaldt single-guide RNA (sgrna) eller alternativt for eksempeludtryk for en yderligere endonuklease ( f. eks.Csy4) i kombination med genkendelses motiver for Csy4 omkring hver sgrna14,15. For det tredje, Cas12a Target site Recognition kræver en protospacer tilstødende motiv (PAM) ved 5 ‘ ende fra målet og kløver efter + 18/+ 23 position fra sin PAM resulterer i kløvet DNA med klæbrig ender, mens Cas9 kræver en PAM placeret på 3 ‘ ende fra den Target og spalter efter den-3 position skabe stump ende nedskæringer i DNA12. For det fjerde er den konsensus-nukleotid sekvens af PAM adskiller mellem Cas12a ((T) TTV) og Cas9 (NGG), hvilket gør Cas12a en lovende kandidat til målretning T-rige promotor og Terminator sekvenser16. Endelig rapporterede en nylig undersøgelse større målspecificitet for Cas12a end for de indfødte Cas917.
Vi præsenterer en protokol for brug af crispr/Cas12a system til genomredigering af S. cerevisiae med særligt fokus på indførelse af flere DNA-udtryks kassetter i uafhængig genomisk loci samtidigt (multiplex genom editing) ved hjælp af et enkelt crRNA-array. De vigtigste trin i protokollen er afbildet i figur 1. Som et bevis på konceptet blev CRISPR/Cas12a-systemet anvendt til at indføre tre udtryks kassetter i genomet i S. cerevisiae , som gør det muligt at fremstille β-caroten18 som skematisk vist i figur 2. Produktion af β-caroten påvirker fænotype S. cerevisiae: dvs., efter vellykket indførelse af alle tre heterologe gener, der kræves for carotenoider biosyntese, de hvide s. cerevisiae celler bliver gule eller orange, afhængigt af udtryks styrken for hvert gene’s promotor. På grund af den simple visuelle læsning af denne vej, er det blevet introduceret til at udvikle avancerede crispr-baserede systemer og metoder til genomredigering19,20. I dette arbejde er udtryks kassetter, der koder for carotenoide gener Crte, crtyb og crti , blevet konstrueret ved hjælp af en Golden Gate kloning (GGC) approach21 med heterologe promotorer og homologe terminatorer bruges til at drive ekspression af gener. Udtrykket kassetter er omgivet af unikke 50-base par (BP) sekvenser, kaldet stik, der giver mulighed for in vivo -samling med integration FLANKE DNA-sekvenser (flankerer regioner) med de samme 50-BP sekvenser, og efterfølgende integration i det genomiske DNA af gær på den position, som er fastlagt af de flankkende regioner. Ved at bruge forskellige promotor styrker, stammer med forskellige niveauer af carotenoider produktion blev opnået resulterer i variation i farven på cellerne. Disse stammer-inspireret af “gær kunstprojekt”22 -blev brugt i en spotting setup med en akustisk væske handler til at skabe en 4-farve høj opløsning “gær fotografi” af Rosalind Franklin. Franklin (1920-1958) var en engelsk kemiker og X-ray crystallographer kendt for sit bidrag til opdagelsen af DNA-strukturen ved foto 5123,24,25.
Den medfølgende protokol beskriver multiplex genomredigering af S. cerevisiae ved hjælp af Cas12a fra lachnospiraceae bakterie ND2006 i kombination med et enkelt crrna-array og donor-DNA. Design af det enkelte crRNA-array og donor-DNA forklares i detaljer. I modsætning til det veletablerede crispr/Cas9-system har crispr/Cas12a den unikke ekstra evne til at behandle flere crrnas udtrykt fra et enkelt crrna-array13,33. På grund af denne funktion er samtidig redigering af flere mål lettere at opsætte og kan opnås i en enkelt transformation. Denne enkelt crRNA array tilgang blev demonstreret før af Zetsche et al. 34 , som samtidig redigerede op til fire gener i pattedyrsceller ved hjælp af AsCas12a, og ved Swiat et al. 35 , som INTRODUCEREDE fire DNA-fragmenter i et gærgenom ved hjælp af FnCas12a. Til vores kendskab er et større antal samtidige genomændringer ved hjælp af et Cas12a system ikke blevet rapporteret, og den maksimale grænse for mål pr. enkelt array for Cas12a er endnu ikke fastlagt. Yderligere forskning ved hjælp af enkelt crrna-systemer i kombination med Cas12a omfatter multiplex transkriptional regulering i en bred vifte af organismer33,36,37.
Der er nogle kritiske trin i den præsenterede protokol. Design omhyggeligt alle DNA-sekvenser, der er involveret i Cas12a genomredigerende eksperiment, især i tilfælde, hvor nye DNA-sekvenser introduceres. Bestem funktionaliteten af nye afstands sekvenser del af en crRNA, for eksempel ved en singleplex genomredigering eksperiment som beskrevet af Verwaal et al. 19 før du kombinerer dem i et enkelt crrna-array. Følg anbefalingerne for udarbejdelse af transformation buffer løsninger, der anvendes i Cas12a redigering eksperiment for at opnå en god transformation effektivitet af gær.
Der er nogle valgfrie modifikationer af teknikken. Det anbefales at bruge 1 μg af hver donor DNA, lineariseret pRN1120 eller enkelt crRNA array Expression kassette i omdannelsen, selv om brugen af et lavere DNA-beløb forventes også at resultere i en tilfredsstillende transformation effektivitet. Udfør en test transformation for at afgøre, om der kan anvendes lavere DNA-mængder. Omdannelse af S. cerevisiae kan udføres ved hjælp af en anden metode end den, der er beskrevet i denne protokol, for eksempel den protokol, der er beskrevet af gietz et al. (2007) 38. guide RNA-modtager plasmid pRN1120 er egnet til ekspression af et enkelt crrna og enkelt crrna-array af forskellige Cas12a varianter (f. eks.fra acidaminococcus spp. BV3L6 eller Francisella novicida U112) samt til ekspression af sgRNA i kombination med Cas919. Donor-DNA behøver ikke at være begrænset til carotenoid genekspression kassetter og ledsage regioner, der er målrettet donor DNA til de beskrevne INT1, INT2 og INT3 steder i genomisk DNA. Ethvert DNA af interesse kan indføres på en multiplex måde i genomisk DNA af værten ved de designprincipper, der er beskrevet i denne protokol, eller alternativt donor DNA kan bruges til at slette DNA fra et værts-genom. Den modulære struktur af enkelt crRNA-array letter nem justering af spacer og direkte gentagelses sekvenser. Ændring af afstands sekvenser giver mulighed for en ændring af den tilsigtede integration locus, som kan være designet af et af de værktøjer til identifikation af en genomisk mål site, f. eks guidescan software 1,039. I stedet for at bruge store ledsage sekvenser, der indeholder stik sekvenser, kan 50-BP af ledsage regionen medtages i donor DNA-sekvenser ved at indarbejde disse 50-BP ledsage region sekvenser i primere, der anvendes i PCR. I dette tilfælde, i alt kun tre i stedet for ni donor DNA fragmenter er nødvendige for en vellykket multiplex genomredigering eksperiment.
I Resumé, denne protokol giver trin-for-trin anvisninger til at udføre multiplex genom redigering i S. cerevisiae ved hjælp af Cas12a i kombination med en enkelt crrna array tilgang. Protokollen blev demonstreret af multiplex genom editing ved hjælp af 9 donor DNA fragmenter og enkelt crrna array kodning for tre grnas. Vi viser høje samlede redigerings frekvenser mellem 50% og 94% for de tre stamme designs, som rapporteres her. Afsluttende, det unikke træk ved Cas12a er evnen til at behandle en enkelt crRNA array i individuelle crRNAs i en celle, hvilket gør Cas12a et glimrende værktøj til at muliggøre multiplex genomredigering og udvikle transkriptionelle regulerings moduler rettet mod flere udtryk kassetter på én go. I sidste ende, tre stammer blev opnået producerer carotenoider på et andet niveau og farver i nuancer mellem gul og orange. Med disse stammer og en vild-type stamme, vi viste, hvordan en akustisk væske handler kan bruges ligefremdet at gøre gær pixel kunst-dette til ære for Rosalind Franklin, der bidrog til opdagelsen af DNA-strukturen 65 år siden af hendes berømte billede 5123 .
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt modtog støtte fra eu’s Horisont 2020-forsknings-og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale nr. 686070 (DD-DeCaf) og 764591 (SynCrop) og fra forskningsprogrammets byggeklodser med projektnummer 737.016.005 af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO). T.E.G. blev støttet af Royal Society (Grant UF160357) og BrisSynBio, et BBSRC/EPSRC syntetisk biologi Research Center (Grant BB/L01386X/1). Vi takker Zi di og Jeffrey van Wijk for deres bidrag til gær spotting eksperimenter for at skabe gær pixel kunst.
Chemicals specific for the protocol | |||
1 Kb Plus DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | 10787018 | Electrophoresis |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A9518 | Selection of E. coli transformants |
BsaI-HF (20 U/µl) | New England BioLabs | R353L | Golden Gate Cloning |
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
CutSmart Buffer | New England BioLabs | B7204S | Linearization of pRN1120 |
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma Aldrich | D1626 | Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA) |
dNTPs | Invitrogen | 10297018 | PCRs |
EcoRI-HF | New England BioLabs | R3101S | Linearization of pRN1120 |
Ethanol absolute for analysis | Merck | 100983 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Ethylenediamine-tetraacetic acid | Sigma Aldrich | ED | Transformation of S. cerevisiae |
G418 disulfate salt | Sigma Aldrich | A1720 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Histodenz | Sigma Aldrich | D2158 | Yeast pixel art |
Isopropanol | Merck | 100993 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Lithium acetate dihydrate | Sigma Aldrich | L6883 | Transformation of S. cerevisiae |
Nancy-520 DNA Gel Stain | Sigma Aldrich | 1494 | Electrophoresis |
NEB10 competent E. coli cells | New England BioLabs | C3019H | Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6 |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB102 | Selection of S. cerevisiae transformants |
Phusion buffer | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0530L | PCRs |
Polyethylene glycol 4000 | Merck | 7490 | Transformation of S. cerevisiae |
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B) | QIAGEN | 854016 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
Purple loading dye | New England BioLabs | B7024S | Electrophoresis |
QIAprep Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | Purification of plasmids |
RNase coctail enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | AM2286 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae |
T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | Golden Gate Cloning |
T4 DNA Ligase (1 U/µl) | Invitrogen | 1705218 | Golden Gate Cloning |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500500 | Electrophoresis |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit | Promega | A9282 | Purification of PCR products and linearized pRN1120 |
Xhol | New England BioLabs | R0146S | Linearization of pRN1120 |
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL) | Zymo Research | E1006 | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme) |
Zymolyase storage buffer | Zymo Research | E1004-B | Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme) |
Chemicals of general use | |||
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar | Plate growth of E. coli | ||
2*PY medium | Cultivation of E. coli | ||
Demineralized water | Transformation of S. cerevisiae |
||
ELFO buffer | Electrophoresis | ||
MQ | Multiple steps | ||
Physiological salt solution | Transformation of S. cerevisiae |
||
TE buffer | Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae | ||
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | Cultivation of S. cerevisiae | ||
YEPD (2% glucose) agar | Plate growth of S. cerevisiae |
||
Consumables | |||
Eppendorf tubes | |||
Falcon tubes (50 mL) | |||
Microplate 96 wells | |||
Petri dishes | |||
Pipette tips 0.5 – 10 µL | |||
Pipette tips 10 – 200 µL | |||
Pipette tips 100 – 1000 µL | |||
Shake flasks (500 mL) | |||
Sterile filters | |||
Equipment | |||
Centrifuge (Falcon tubes) | |||
Echo 525 acoustic liquid handler | |||
Incubator | |||
NanoDrop | |||
Set for eletrophoresis | |||
Spectrophotometer | |||
Table centrifuge (Eppendorfs tubes) | |||
Thermocycler | |||
Plasmids | |||
pCSN067 | Addgene | ID 101748 | https://www.addgene.org/ |
pRN1120 | Addgene | ID 101750 | https://www.addgene.org/ |
Strains | |||
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D |
EUROSCARF collection | http://www.euroscarf.de |