CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking van Saccharomyces cerevisiae en de creatie van gist pixel art

Summary

Het CRISPR/Cas12a systeem in combinatie met een enkele crRNA array maakt efficiënte multiplex bewerking van de S. cerevisiae genoom op meerdere loci tegelijk mogelijk. Dit wordt aangetoond door het construeren van Carotenoïde producerende giststammen die vervolgens worden gebruikt om gist pixel kunst te maken.

Abstract

Hoog rendement, gebruiksgemak en veelzijdigheid van de geclusterd regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen/CRISPR-geassocieerde proteïne 9 (CRISPR/Cas9) systeem heeft de gevorderde genetische modificatie van Saccharomyces cerevisiaevergemakkelijkt, een model organisme en het werkpaard in de industriële biotechnologie. CRISPR-geassocieerde proteïne 12a (Cas12a), een RNA-geleide endonuclease met kenmerken die te onderscheiden zijn van Cas9, wordt toegepast in dit werk, waardoor de moleculaire Toolbox verder wordt uitgebreid voor genoom bewerkings doeleinden. Een voordeel van de crispr/Cas12a systeem is dat het kan worden gebruikt in multiplex genoom Editing met meerdere gids rna's uitgedrukt uit een enkele transcriptionele eenheid (single crispr RNA (crrna) array). We presenteren een protocol voor multiplex integratie van meerdere heterologeuze genen in onafhankelijke loci van het S. cerevisiae genoom met behulp van het crispr/Cas12a systeem met meerdere Crrna's uitgedrukt uit een enkele crrna array construct. De voorgestelde methode benut het vermogen van S. cerevisiae om in vivo recombinatie van DNA-fragmenten uit te voeren om de enkelvoudige crrna-array in een plasmide te monteren die kan worden gebruikt voor de selectie van de Gasste, evenals de samenstelling van het donor DNA sequenties die integreren in het genoom op de beoogde posities. Cas12a wordt vooruitgedruct in constitutief, waardoor het decolleté van het S. cerevisiae genoom op de beoogde posities wordt vergemakkelijkt bij de uitdrukking van de enkelvoudige crrna-array. Het protocol omvat het ontwerp en de constructie van een enkele crRNA array en donor DNA expressie cassettes, en exploiteert een integratie aanpak die gebruik maakt van unieke 50-BP DNA connectors sequenties en afzonderlijke integratie flank DNA sequenties, die vereenvoudigt experimenteel ontwerp door standaardisatie en modularisatie en breidt het toepassingsgebied uit. Ten slotte demonstreren we een eenvoudige techniek voor het maken van gist pixel kunst met een akoestische vloeistof handler met verschillend gekleurde carotenoïde producerende giststammen die werden geconstrueerd.

Introduction

Crispr/CAS enzymen hebben ongetwijfeld een revolutie teweeggebracht in de moleculaire biologie en zijn algemeen aangenomen als hulpmiddelen voor engineering genomen met een snelheid die voorheen onhaalbaar was¹. De eerste modificatie van een Saccharomyces cerevisiae genoom door het crispr/Cas9 genoom editing systeem werd gerapporteerd door DiCarlo et al. ², aantonen van succesvolle gen knock-out en het maken van puntmutaties met behulp van extern geïntroduceerde oligonucleotiden. Verdere ontwikkeling van gist CRISPR Toolbox inbegrepen: transcriptionele regulering door fusie van katalytisch inactief Dead Cas9 (dCas9) met transcriptionele Effector domeinen om activering en uitschakeling van transcriptie³mogelijk te maken, toepassing voor beide genoom editing en regelgevende functies voor metabole traject techniek door gelijktijdige activering, onderdrukking en deletie⁴, verwijdering van grote fragmenten uit de S. cerevisiae genoome⁵, en multichromosoom Fusions⁶ .

CRISPR/CAS genoom bewerkingssystemen vinden hun oorsprong in adaptieve immuunsystemen van bacteriën en archaea en deze systemen zijn aangepast door moleculaire biologen voor genoom bewerking. Hun functionaliteit is gebaseerd op de geclusterd regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) DNA-gebieden coderen RNA dat verantwoordelijk is voor de herkenning van het vreemde DNA of RNA en de CRISPR geassocieerde genen (CAS) die RNA-geleide enzym^1,7,8,9. Op basis van de recente genoom analyse van crispr/CAS systemen werd voorgesteld om de crispr/CAS systemen te verdelen in twee klassen, vijf types en 16 subtypen¹⁰. De twee klassen worden onderscheiden op basis van de organisatie van Effector complexen die betrokken zijn bij Target decolleté. Meestal zijn crispr/CAS-systemen met een multi-subeenheid-organisatie gecategoriseerd als klasse 1, terwijl enkele subeenheid Effector-complexen behoren tot klasse 2^10,11. In dit artikel, onderzoeken we de klasse 2 type V Cas12a, voorheen Cpf1^10,12genoemd, wat een alternatief is voor het klasse 2 type II Cas9. Hoewel Cas9 goed wordt gekarakteriseerd en op grote schaal wordt gebruikt in onderzoek, biedt Cas12a extra functies¹². Ten eerste vormt Cas12a een complex met CRISPR RNA (crRNA) van 42 tot 44 nucleotiden zonder dat er een extra trans-activerende CRISPR RNA (tracrRNA) nodig is. Daarom kan een kortere handleiding RNA worden gebruikt in genoom Editing met CRISPR/Cas12a systemen in vergelijking met CRISPR/Cas9. Ten tweede maakt de unieke endonuclease-en endoribonuclease-activiteit van Cas12a de rijping van zijn pre-crRNA-¹³mogelijk. Deze RNase-activiteit maakt het mogelijk om meerdere Crrna's op één CRISPR crRNA-array te coderen, terwijl Cas9 de afzonderlijke uitdrukking vereist van elke zogenaamde enkelvoudige gelei-RNA (sgRNA) of als alternatief, bijvoorbeeld expressie van een extra endonuclease ( bijvoorbeeldCsy4) in combinatie met herkennings motieven voor Csy4 rondom elke sgrna^14,15. Ten derde vereist Cas12a herkenning van de doelsite een protospacer aangrenzend motief (PAM) op het 5 ' uiteinde van het doel en Slaid na de + 18/+ 23 positie van zijn pam, resulterend in gespleten DNA met kleverige uiteinden, terwijl Cas9 een pam moet hebben die zich op het 3 ' uiteinde van de target en deaves na de-3 positie waardoor botte eind sneden in het DNA¹²ontstaan. Ten vierde verschilt de consensus nucleotide-sequentie van de PAM van Cas12a ((T) TTV) en Cas9 (NGG), wat Cas12a een veelbelovende kandidaat maakt voor het targeten van T-Rich promoter en Terminator sequences¹⁶. Ten slotte meldde een recente studie een grotere doel specificiteit voor Cas12a dan voor de inheemse Cas9¹⁷.

We presenteren een protocol voor het gebruik van het CRISPR/Cas12a-systeem voor genoom bewerking van S. cerevisiae met een bijzondere focus op de introductie van meerdere DNA-expressie cassettes in onafhankelijke genomische loci tegelijk (multiplex genoom bewerking) met behulp van een enkele crRNA-array. De belangrijkste stappen van het protocol worden afgebeeld in Figuur 1. Als proof of concept werd het CRISPR/Cas12a-systeem toegepast voor de introductie van drie uitdrukkings cassettes in het genoom van S. cerevisiae , die de productie van β-caroteen¹⁸ als schematisch weergegeven in Figuur 2mogelijk maken. De productie van β-caroteen beïnvloedt het fenotype van S. cerevisiae: d.w.z.na een geslaagde introductie van alle drie heterologeuze genen die nodig zijn voor de biosynthese van carotenoïden, worden de witte s. cerevisiae -cellen geel of oranje, afhankelijk van de expressie sterkte van de promotor van elk gen. Door de eenvoudige visuele uitlezen van dit traject is het geïntroduceerd om geavanceerde crispr-gebaseerde systemen en methoden voor het bewerken van genoom^19,20te ontwikkelen. In dit werk zijn expressie cassettes die de carotenoïde genen CRTE, crtyb en crti coderen met behulp van een Golden Gate klonen (GGC)-aanpak²¹ met heterologeuze promotors en homologe terminators opgebouwd. gebruikt om de expressie van de genen te stimuleren. De expressie cassettes worden omgeven door unieke 50-base pairs (BP) sequenties, genaamd connectors, die toelaten in vivo assemblage met integratie flank DNA sequenties (flankerende regio's) met dezelfde 50-BP sequenties, en daaropvolgende integratie in het genomische DNA van gist op de positie bepaald door de flankerende gebieden. Door het gebruik van verschillende promotor sterktes, stammen met verschillende niveaus van carotenoïden productie werden verkregen resulterend in variatie in kleur van de cellen. Deze stammen-geïnspireerd door het "gist kunst project"²² -werden gebruikt in een spotting Setup met een akoestische Liquid handler om een 4-color High-Resolution "gist foto" van Rosalind Franklin te creëren. Franklin (1920-1958) was een Engelse scheikundige en Röntgen kristallograaf die bekend stond om haar bijdrage aan de ontdekking van de DNA-structuur door foto 51^23,24,25.

Protocol

1. bereiding van de Cas12a plasmiden

Opmerking: het plasmide dat de Lachnospiraceae bacterie ND2006 Cas12a (LbCpf1, pCSN067) codon, geoptimaliseerd voor expressie in S. cerevisiae, werd eerder geconstrueerd¹⁹, gedeponeerd in een plasmide repository (Zie de tabel van Materialen). Dit is een enkele kopie episomale s. cerevisiae/E. coli shuttle plasmide met een kanmx weerstand marker gen om de selectie van S. cerevisiae transformanten op Geneticin (G418).

1. Verkrijg de pCSN067 plasmide (Zie de tabel met materialen).
2. Vergroot de pCSN067 plasmide om een hoog bedrag te verkrijgen.
   1. Transformeer 25 μL gekochte chemisch competente E. coli cellen met de plasmide pCSN067 volgens het Protocol van de fabrikant. Verdun de transformatie combinatie 10 en 50 keer in 2x peptone-gist (PY). Plaat uit 10x en 50x verdunningen op 2x PY agar-platen met ampicilineen (0,1 g/L) en incuberen 's nachts bij 37 °C.
   2. Kies 2 tot 3 kolonies en beënt elke kolonie in 3 mL van 2x PY en kweek 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 180 rpm.
   3. Reinig het plasmide met behulp van een plasmide reinigingsset volgens de instructies van de fabrikant.

2. bereiding van de enkelvoudige crRNA array Expression cassette

1. Bereid de enkelvoudige crRNA-array voor.
   Opmerking: de enkelvoudige crRNA-array bestaat uit een SNR52 RNA-POLYMERASE III-promotor van S. cerevisiae², een directe herhaling specifiek voor LbCas12a en een spacer (genomische doel volgorde), samen herhaald voor elk doel¹⁹ en eindigt met een SUP4 Terminator van S. cerevisiae². De enkelvoudige crrna-array wordt geassembleerd door in vivo recombinatie in de gelineariseerde plasmide pRN1120 om een circulair plasmide te genereren, dus moeten de regio's die homologe zijn aan plasmide pRN1120 aanwezig zijn aan het begin en einde van de enkelvoudige crrna-array (Zie Figuur 2a ). Het wordt aanbevolen om van tevoren de functionaliteit van een aantal ontworpen Crrna's afzonderlijk te evalueren¹⁹. Deze informatie wordt vervolgens gebruikt om de meeste functionele Crrna's te selecteren om deze te combineren in de directe herhaling en spacer sequenties om een enkele crRNA array te creëren voor het multiplexing doel.
   1. Bestel de enkelvoudige crRNA array voor multiplex genoom Editing experimenten als synthetisch DNA (Zie de DNA sequentie van de enkelvoudige crRNA array in aanvullende tabel 1).
   2. Versterk de geordende enkelvoudige crRNA-array (bijv.met behulp van PRIMERS KC-101 en KC-102 (aanvullende tabel 2)). Bereid de PCR-amplificatie mix met: 0,5 μL van de DNA-polymerase, 10 μL 5x buffer vereist voor de DNA-polymerase, 1 μL van 10 mM Dntp's, 2,5 μL van 10 μM voorwaartse primer, 2,5 μL 10 μM reverse primer, 2 μL DNA-template bij een concentratie van 5 ng/μL en ultrapuur H ₂ O tot een totaal volume van 50 μL.
      1. Voer de reactie in een Thermocycler uit met behulp van het volgende programma: i) 98 °C gedurende 3 min, (II) 98 °C gedurende 10 s, (III) 60 °C gedurende 20 s, (IV) 72 °C gedurende 15 s – Herhaal stappen (II) tot (IV) 30 maal, (v) 72 °C gedurende 5 min (VI) tot aan 12 °C tot nader onderzoek.
   3. Analyseer de PCR-producten door elektroforese door het uitvoeren van de monsters op een 0,8% agarose gel bij 5 V/cm voor 40 min met behulp van een DNA-belastingskleurstof en DNA-ladder met DNA-fragmenten in een bereik van 100 tot 10.000 BP.
   4. Reinig de PCR-producten met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant.
2. Bereid de enkelvoudige crRNA array-ontvanger plasmide voor.
   Opmerking: de enkelvoudige crRNA-array wordt uitgedrukt uit de S. cerevisiae/E. coli shuttle plasmide pRN1120¹⁹ (Zie de tabel met materialen). Deze multi-Copy plasmide bevat een NatMX weerstand marker gen om selectie van S. cerevisiae transformanten op nourseothricin (NTC).
   1. Verkrijg de pRN1120 plasmide.
   2. Vergroot de pRN1120 plasmide om een hoog bedrag te verkrijgen.
      1. Transformeer 25 μL gekochte chemisch competente E. coli cellen met plasmide pRN1120 volgens het Protocol van de fabrikant. Verdun de transformatie combinatie 10 en 50 keer in 2x PY. Plaat uit 10x en 50x verdunningen op 2x PY agar-platen met ampicilineen (0,1 g/L) en incuberen 's nachts bij 37 °C.
      2. Kies 2 tot 3 kolonies en beënt elke kolonie in 3 mL van 2x PY en kweek 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 180 rpm.
      3. Reinig het plasmide met behulp van een plasmide reinigingsset volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Linearize plasmide pRN1120 met EcoRI-HF en xhoI. Bereid hiervoor een verterings mengsel voor, bestaande uit 1 μg pRN1120, 5 μL 10 x buffer (1x buffer bevat 50 mM Kaliumacetaat, 20 mM tris-acetaat, 10 mM magnesium acetaat, 100 μg/mL boviene serumalbumine [BSA]; pH 7,9), 1 μL EcoRI-HF (20 U) , 1 μL XhoI (20 U) en ultrapuur H₂O tot een totaal volume van 50 μL. incuberen de digestie mix bij 37 °c gedurende 2 uur en inactiveren bij 65 °c gedurende 20 minuten.
   4. Analyseer de gelineariseerde plasmide door elektroforese op een agarose gel (0,8%, 40 min, 5 V/cm) met behulp van een DNA-belastingskleur stof en DNA-ladder met DNA-fragmenten in een bereik van 100 tot 10.000 BP. Als een controle omvatten een circulaire plasmide in de analyse.
   5. Reinig het gelineariseerde plasmide met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant.

3. voorbereiding van de organisator-ORF-Terminator (POT) donor DNA constructies

1. Bestel een set van Promoter (P) van verschillende sterkte, open reading frame (O) en Terminator (T) sequenties als synthetisch DNA zodanig dat elk element gestandaardiseerde 4-BP herkennings sequenties bevat die worden geflankeerd door BSAI sites om Golden Gate klonen mogelijk te maken ( GGC) assemblage²⁶ (Zie de gedetailleerde ontwerpen in aanvullende tabel 3 en sequenties in aanvullende tabel 4).
2. Montage van POTUITDRUKKINGS cassettes samengesteld uit een promotor, open Lees frame, Terminator en connectors sequenties via een 4-delige assembly met behulp van een GGC-reactie²¹, in een bestemmings vector die al vooraf gespecificeerde 50-BP connectoren sequenties bevat ( Zie aanvullende tabel 4 en verwijzingen^26,27).
   1. Meet de concentratie van DNA-onderdelen met behulp van een spectrofotometer. Verdun elk DNA-deel in ultrapuur H₂O tot een eindconcentratie van 15 fmol/μL.
   2. Maak een reactiemix samengesteld uit DNA-fragmenten: 2 μL van de promotor, 2 μL open Lees frame, 2 μL Terminator en 2 μL ruggengraat (niveau 1-bestemmings vectoren zoals beschreven in ²⁶), 4 μl 5X T4 DNA-ligase-buffer, 2,5 μL van 1 U/ΜL T4 DNA ligase , 1,5 μL van 20 e/μL BSAI-HF en ultrapuur H₂O tot een totaal volume van 20 μL.
   3. Voer de GGC-reactie uit in een Thermocycler met behulp van het volgende programma: (i) 37 °C gedurende 2 min, (II) 16 °C gedurende 5 min – Herhaal stappen (i) en (II) 50 keer, (III) 50 °C gedurende 60 min, (IV) 80 °C gedurende 45 min, (v) vasthouden bij 12 °C tot verdere analyse.
3. Transformeer 25 μL aangekochte, chemisch competente E. coli²⁸ cellen met 3 ΜL van de GGC-reactiemix volgens het Protocol van de fabrikant. Verdun de transformatie combinatie 10 en 50 keer in 2x PY. Plaat uit 10x en 50x verdunningen op 2x PY agar-platen met ampicilineen (0,1 g/L) en incuberen 's nachts bij 37 °C.
4. Kies 2 tot 3 kolonies en beënt elke kolonie in 3 mL van 2x PY en kweek 's nachts bij 37 °C in een schuddende incubator bij 180 rpm.
5. Reinig de plasmiden met behulp van een plasmide reinigingsset volgens de instructies van de fabrikant.
6. Controleer of de POTEXPRESSION cassettes door PCR correct in de GGC-reactie zijn gemonteerd.
   1. Ontwerp primers complementair aan de connector sequentie aanwezig aan het begin en het einde van elke Expression cassette (Zie Figuur 2b). Voor in dit protocol gekozen connectoren gebruikt u primers KC-103 naar KC-108 (Zie aanvullende tabel 2).
   2. Bereid PCR-versterkings mengsels voor elk plasmide met: 0,5 μl van het proefschrift DNA polymerase, 10 μL 5x buffer vereist voor de DNA-polymerase, 1 μl van 10 mm dntp's, 2,5 μL van 10 μm voorwaartse primer, 2,5 μL van 10 μm reverse primer, 2 μL DNA-sjabloon met een jukbe Ion van 5 ng/μL en ultrapuur H₂O tot een totaal volume van 50 μL.
   3. De PCR-reactie in een Thermocycler uitvoeren met behulp van het volgende programma: (i) 98 °C 3 min, (II) 98 °C gedurende 10 s, (III) 60 °C gedurende 20 s, (IV) 72 °C gedurende 2 min 30 s – Herhaal stappen (II) tot (IV) 30 maal, (v) 72 °C gedurende 5 min. , (VI) vasthouden tot 12 °C tot nader onderzoek.
      NB: resulterende PCR-producten bestaan uit 50-BP van de 5 ' connector, Promoter, open reading frame, Terminator en 50-BP van de 3 ' connector.
7. Analyseer de PCR-producten door elektroforese door het uitvoeren van monsters op een 0,8% agarose gel bij 5 V/cm voor 40 min met behulp van een DNA-belastingskleurstof en DNA-ladder met DNA-fragmenten in een bereik van 100 tot 10.000 BP.

4. voorbereiding van integratie flank DNA sequenties met connectors sequenties

1. Purify genomisch DNA uit wild type S. cerevisiae CEN. PK113-7d²⁹.
   1. Kweek de stam in een 500 ml schud kolf gevuld met 100 ml gistextract pepton dextrose (yepd, 2% glucose) medium bij 30 °c en schudden bij 250 rpm gedurende 48 uur.
   2. Oogst de cellen door centrifugeren van 2 mL Bouillon bij 16.000 x g gedurende 1 minuut en gooi het supernatant weg.
   3. Respendeer de cellen in fysiologisch zout (200 μL; 0,85% NaCl-oplossing) met RNase (10 μL, 10 mg/mL) en gist lytisch enzym (4 μL). Inincuberen van de celsuspensie bij 37 °C gedurende 15 minuten.
   4. Voeg 300 μL cellysisoplossing (Zie tabel van de materialen) en Vortex kort toe.
   5. Voeg 168 μL eiwit precipitatie oplossing (Zie tabel van de materialen) toe en Vortex krachtig gedurende 20 sec.
   6. Scheid de eiwitfractie door centrifugeren bij 16.000 x g en 4 °c gedurende 10 min. Verzamel 600 μL supernatant in een nieuwe buis en meng met 600 μL isopropanol en Vortex kort.
   7. Herstel DNA door te draaien op 16.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Gooi de supernatant weg en houd de pellet.
   8. Was de pellet met 200 μL ethanol (70%). Centrifugeer op 16.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant. Damp de ethanol in door de buis gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incueren met het deksel geopend.
      Opmerking: als vloeistof in de buis nog steeds zichtbaar is, herhaalt u de stap 4.1.8. Droog de pellet niet langer dan 10 min om een verminderde oplosbaarheid van het DNA te voorkomen.
   9. Los het DNA op in 50 μL TE buffer. Bewaar het gezuiverde DNA op 4 °C.
2. Voor elke integratie site, ontwerp integratie flank DNA sequenties (ca. 500 BP) zodanig dat ongeveer 1000 BP van genomisch DNA zal worden verwijderd bij de invoering van donor DNA (Zie het schematische ontwerp in Figuur 2b en sequenties in aanvullende Tabel 4).
3. Ontwerp primers om de flankerende gebieden te genereren door PCR.
   1. Voor de linker flankerende regio, ontwerpen forward en reverse primers om te versterken ongeveer 500 BP van de genomische DNA-regio gepositioneerd 5 ' (links) van de integratie site van belang.
      Opmerking: de voorwaartse primer bevat 20 BP van homologie met de beoogde flankerende regio. De omgekeerde primer bevat 20 BP met homologie met de beoogde flankerende regio en bevat de gewenste 50-BP connector sequentie om in vivo assemblage in de Cas12a editing op het genoom later aan te schakelen.
   2. Voor de rechter flankerende regio, ontwerpen voorwaartse en omgekeerde primers om ongeveer 500 BP van de GENOMISCHE DNA-regio te versterken, gepositioneerd 3 ' (rechts) van de integratie site van belang.
      Opmerking: de voorwaartse primer bevat 20 BP met homologie met de beoogde flankerende regio en bevat de gewenste 50-BP connector sequentie om in vivo assemblage in de Cas12a editing op het genoom later aan te zetten. De omgekeerde primer omvat 20 BP van homologie met het beoogde flankerende gebied.
4. Versterk de flankerende gebieden met de ontworpen primers (bijv.PRIMERS KC-109 tot KC-120 ingesloten in supplementaire tabel 2).
   1. Meet de concentratie van gezuiverd genomisch DNA dat als sjabloon in de PCR zal dienen. Stel de DNA-concentratie in op 50 ng/μL.
   2. PCR-versterkings mengsels bereiden van genomisch DNA (1 – 4 μL van 50 ng/μL genomische DNA-verdunning) gezuiverd in stap 4,1, voorwaartse en omgekeerde primer (10 μM per stuk), 1 μL van 10 mM Dntp's, 10 μL 5x buffer vereist voor de DNA-polymerase, 0,5 μL van DNA-polymerase (1,0 U) en ultrazuiver H₂O tot een totaal volume van 50 μL.
   3. Voer PCRs in een Thermocycler uit met behulp van het volgende programma: (i) 98 °C gedurende 3 min, (II) 98 °C gedurende 20 s, (III) 60 °C gedurende 20 s, (IV) 72 °C gedurende 15 sec, herhaal stappen (II) tot (IV) 30 maal, (v) 72 °C gedurende 5 min. , (VI) vasthouden tot 12 °C tot nader onderzoek.
5. Analyseer de PCR-producten door elektroforese op een 0,8% agarose gel bij 5 V/cm voor 40 min met behulp van een DNA-belastingskleurstof en DNA-ladder met DNA-fragmenten in een bereik van 100 tot 10.000 BP.
6. Reinig de juiste PCR-producten met behulp van een PCR-zuiverings pakket volgens de instructies van de fabrikant.

5. transformatie naar S. cerevisiae

Opmerking: transformatie uitvoeren met behulp van een protocol op basis van de methoden die zijn ontwikkeld door Gietz et al. (1995) ³⁰ en Hill et al. ³¹ die kan worden gebruikt voor verschillende stammen van S. cerevisiae. Het hieronder beschreven protocol volstaat voor 1 transformatie.

1. Oplossingen voorbereiden die nodig zijn voor transformatie.
   1. Bereid de volgende stamoplossingen en filter-steriliseren: 10x TE buffer met 100 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, totaal volume van 50 mL; 1 M LiAc bij pH 7,5, totaal volume van 50 mL; 50% PEG 4000, totaal volume van 100 mL.
      Opmerking: Controleer altijd of PEG 4000 Stock op pH 5 staat. Deze voorraad mag niet langer dan een maand worden bewaard.
   2. Bereid de volgende oplossingen met behulp van voorraden: bereiding LiAc-TE oplossing met 0,1 M LiAc, 10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, totaal volume van 0,5 mL. Bereid PEG-LiAc-TE oplossing met 40% PEG 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, totaal volume van 1 mL.
      Opmerking: het is cruciaal voor een succesvolle transformatie dat PEG-LiAc-TE en LiAc-TE oplossingen vers worden bereid.
2. Eerste transformatie ronde (bereid de stam voor het uitdrukken van Cas12a).
   Opmerking: gebruik in alle transformatiestappen water met een pH hoger dan 5. Het wordt aanbevolen om gedemineraliseerd water te gebruiken in alle stappen van de transformatie.
   1. Bereid een pre-cultuur door groeiende stam CEN. PK113-7D in een Shake kolf van 100 mL met 20 mL YEPD (2% glucose) medium en inincuberen bij 30 °C met een schud snelheid van 250 rpm.
   2. Meet de OD₆₀₀ van de pre-cultuur (OD_PC). Bereken de verdunningsfactor (DF) tussen het volume van de voor kweek en het volume van het verse medium dat nodig is voor de bereiding van de cellen die Cas12a moeten worden gebruikt voor de transformatie (transformatie cultuur). In de berekeningen wordt uitgegaan van de extinctie van de transformatie cultuur (OD_TC) tot 1,0 na de incubatie stap beschreven in 5.2.3 (Ti).
      
      waarbij Ti en τ respectievelijk de incubatietijd en de verdubbelingstijd zijn.
      1. Bereken het volume van de pre-cultuur (v_i) die nodig is voor de inoculatie van de transformatie cultuur (v_TC) op basis van de verdunningsfactor.
         
   3. Bereid de transformatie cultuur voor door inoculatie van 20 mL YEPD (2% glucose) (v_TC) met het volume van de pre-cultuur bepaald in de vorige stap (v_i). Incuberen bij 30 °C met schudden bij 250 rpm.
   4. Meet de OD₆₀₀ van de transformatie cultuur tot een od₆₀₀ van 1,0 is bereikt.
   5. Oogst de cellen door centrifugeren van de 20 mL Bouillon bij 2.500 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en was de cellen in 20 ml kamertemperatuur gedemineraliseerd water. Herhaal de Centrifugeer stap en houd de celpellet.
   6. Regeer de cellen in 100 μL LiAc-TE-oplossing en breng over naar een micro centrifugebuis.
   7. Voeg 5 μL single-gestrande drager-DNA (10 mg/mL zalm sperma-DNA) toe en meng door pipetten.
   8. Pipetteer 1 μg plasmide pCSN067 naar de micro centrifugebuis.
      Opmerking: het totale volume van het DNA-mengsel mag niet groter zijn dan 100 μL om een lagere transformatie-efficiëntie te voorkomen.
   9. Voeg 600 μL PEG-LiAc-TE oplossing toe en meng door pipetten. Inincuberen gedurende 30 minuten bij 30 °C terwijl het schudden bij 450 rpm in een tafelblad warmte blok.
   10. Voeg 70 μL DMSO (100%) naar het transformatie mengsel en meng door Pipetting. Voer een hitteschok uit door het transformatie mengsel bij 42 °C gedurende 15 minuten in een waterbad te bebroed.
   11. Herstel de cellen door het mengsel over te brengen naar een ronde bodem buis van 15 mL en voeg 10 mL YEPD (2% glucose) toe aan de buis. Inincuberen bij 30 °C met schudden bij 250 rpm.
   12. Centrifugeer het transformatie mengsel bij 2.500 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en revoer de celpellet in ongeveer 200 μL van de resterende oplossing.
   13. Plaat uit 150 μL van de transformatie combinatie en een 20x verdunning in YEPD (2% glucose) van transformatie mengsel op YEPD (2% glucose) agar-platen aangevuld met 0,2 g/L G418. Inincuberen de platen bij 30 °C gedurende 48 – 72 uur.
   14. Kies een enkele transformant en re-streak op een YEPD (2% glucose) agar plaat aangevuld met 0,2 g/L G418 voor het verkrijgen van enkele kolonies.
3. Tweede transformatie ronde (het uitvoeren van multiplex genoom bewerking met CRISPR/Cas12a).
   1. Bereid een pre-cultuur door het kweken van de stam pre-uitdrukken Cas12a, gemaakt in de eerste transformatie ronde (stap 5,2), in een 100 mL Shake kolf met 20 mL YEPD (2% glucose) medium aangevuld met 0,2 g/L G418. Inincuberen bij 30 °C met schudden 250 rpm.
      Opmerking: voor meervoudige transformaties past u het volume van de pre-cultuur aan.
   2. Volg de stappen 5.2.2 tot 5.2.7 voor de eerste transformatie ronde.
      Opmerking: voor meervoudige transformaties past u de volumes van de vereiste oplossingen en cultuur van de stam voor het uitdrukken van Cas12a aan.
   3. Pipetteer 1 μg van de enkelvoudige crrna-array, 1 μg van de gelineariseerde plas smid voor de crrna-array, 1 μg donor-DNA en 1 μg van elk flankerende gebied (stap 4,3) in de microcentrifuge buis.
      Opmerking: het totale volume van het DNA-mengsel mag niet groter zijn dan 100 μL om een lagere transformatie-efficiëntie te voorkomen.
   4. Bereid de volgende besturingselementen voor de transformatie: negatieve controle (Ultrapure H₂O); positieve controle voor de bepaling van de efficiëntie van de transformatie (1 μg circulaire pRN1120); een controle waarbij wordt nagegaan of het donor DNA wordt binnengebracht via CRISPR editing (1 μg circulair pRN1120, 1 μg van alle donor-DNA-expressie cassettes en 1 μg flankerende gebieden, maar geen enkele crRNA-array); controle om te controleren of donor DNA kan worden geïntegreerd buiten het doel (1 μg gelineariseerde pRN1120, 1 μg donor-DNA-expressie cassettes en 1 μg van de enkelvoudige crrna-array, maar geen flankerende gebieden); een controle die de volledige linearisatie van pRN1120 (1 μg gelineariseerde pRN1120) verifieert.
   5. Volg de stappen 5.2.9 naar 5.2.12 voor de eerste transformatie ronde.
   6. Plaat uit 150 μL van de transformatie combinatie en 20x verdunning in YEPD (2% glucose) van transformatie mengsel op YEPD (2% glucose) agar aangevuld met 0,2 g/L G418 en 0,2 g/L NTC. De controle op de agar YEPD (2% glucose) wordt aangevuld met de juiste selectie (G418 en/of NTC of geen selectie). Inincuberen de platen bij 30 °C gedurende 48 – 72 uur.
   7. Kies een enkele gekleurde transformant en re-streak op een YEPD (2% glucose) agar plaat voor het verkrijgen van één gekleurde kolonies.

6. evaluatie van het genoom bewerkings rendement

1. Tel het aantal gekleurde kolonies en witte kolonies op de transformatie platen.
2. Bereken genoom bewerkings efficiëntie door het aantal gekleurde kolonies te delen door het totale aantal kolonies (zowel wit als gekleurd), zoals weergegeven in tabel 1.

7. bevestiging van de integratie van het donor DNA op de beoogde loci

1. Herstreep een gekleurde enkele kolonie van een transformatie plaat op een YEPD (2% glucose) agar plaat zonder G418 en NTC selectie en inincuberen voor 48 uur bij 30 °C.
2. Kies een enkele kolonie en beënt een 500 mL schud kolf gevuld met 100 mL YEPD (2% glucose) medium. Incuberen gedurende 48 uur bij 30 °C en schudden bij 250 rpm.
3. Isoleer het genomische DNA zoals beschreven in punt 4,1.
   Opmerking: alternatief, gebruik een protocol voor de bereiding van gist voor kolonie PCR eerder voorgesteld door Looke et al. ³². in dit geval kan de groei in vloeibaar medium (punt 7,2) worden overgeslagen.
4. Controleer de juiste integratie door de versterking van twee fragmenten per geïntegreerde Expression cassette.
   1. Ontwerp primers die glokken naar genomisch DNA buiten de getransformeerde flankerende gebieden en het gen van belang (zie voorbeelden in aanvullende tabel 2, kc-121 tot KC-132). Bij gebruik van primers KC-121 naar KC-132, stel de gloeien temperatuur in het PCR-programma tot 62 °C.
   2. Versterk de regio van belang zoals beschreven in paragraaf 4.4.2. Het PCR-programma aanpassen, specifiek de tijd van de uitbreidings stap in PCR aanpassen aan de hand van de lengte van de sjabloon en de aanbevelingen van de fabrikant voor de DNA-polymerase.
5. Controleer de grootte van de PCR-producten door elektroforese op een agarose-gel (0,8%, 40 min, 5 V/cm) met behulp van een DNA-belastingskleurstof en DNA-ladder met DNA-fragmenten in een bereik van 100 tot 10.000 BP.

8. creatie van gist pixel art met behulp van een akoestische Liquid handler

1. Bereid een foto sjabloon voor de gist pixel art.
   1. Wijzig de grootte van de oorspronkelijke RGB-afbeelding (220 × 280 pixels, zie de representatieve resultaten), bijvoorbeeld met imagej om een laatste 64 × 96 pixels (breedte × hoogte) grijs schaal afbeelding te maken die is gevisualiseerd in beoogde kleuren (representatieve resultaten).
   2. Converteer de RGB-afbeelding naar grijs schaal met behulp van deze formule:
      
      waar Ik_gr, i_r, i_g, i_b zijn de grijs, rood, groen en blauw intensiteiten, respectievelijk.
   3. Om de pixels te categoriseren, moet u een ImageJ-plugin ontwikkelen die de volgende regels toepast: (a) als Ik_gr ≤ 64 is, gebruik dan de donker oranje gist (stam 1, supplementaire tabel 3) voor deze pixel. b) als 64 < I_gr ≤ 128, gebruik dan de sinaasappel gist (stam 2, supplementaire tabel 3) voor deze pixel. c) als 128 < I_gr ≤ 192, gebruik dan de gele gist (stam 3, supplementaire tabel 3) voor deze pixel. d) als Ik_gr > 192, gebruik dan de witte gist (CEN. PK113-7D) voor deze pixel.
2. Spot gistcellen om de gist pixel art te maken.
   1. Inoculeren 500 mL Shake kolven met 100 mL YEPD (2% glucose) medium met drie verschillend gekleurde carotenoïden die S. cerevisiae stam en wild type CEN produceren. PK113-7D. Incuberen de culturen op 30 °C met schudden bij 250 rpm.
   2. Breng 0,5 mL van de overnachtings cultuur over naar een buis gevuld met 0,5 mL steriel niet-ionische dichtheidsgradiënt (Zie de tabel met materialen). Meng door grondig kort.
   3. Breng de celsuspensie over in een gekwalificeerd reservoir, 2 x 3 goed. Voer spotting uit met behulp van een akoestisch vloeistof handlerinstrument van een gekwalificeerde reservoir bron plaat naar een microplaat (Zie de tabel met materialen) met 50 ml YEPD (2% glucose) agar. Om de beplating te vereenvoudigen, definieer putjes op plaat, bijv. Gebruik een microplaat als 6144 goed plaat (64 × 96).
   4. Spot 25 nL van elke S. cerevisiae stam van de 2x 3 put bron plaat met behulp van een. CSV bestand met de instelling van de vloeistof kalibratie 6Res_aq_gpsa2 op de bestemming microplaat. Definieer elk van deze 25 nL druppels als een pixel in de 64 x 96 grid die is vertaald naar de well-posities (A01, B01, C01 enz.).
   5. Inincuberen van de microplaat bij 30 °C gedurende 48 uur. Om de kleuren van de stammen te intensiveren, bewaart u de agar-plaat gedurende ten minste 72 uur bij 4 °C.

Representative Results

Het protocol voor multiplex genoom Editing met behulp van crisrp/Cas12a werd aangetoond door de bouw van drie carotenoïde produceren S. cerevisiae stammen uitdrukken van de CRTE, crtyb en crti genen met behulp van heterologe promoters van hoge, gemiddelde en lage sterkte: stam 1, 2 en, 3 respectievelijk (supplementaire tabel 3). De bouw van deze stammen vereist het genereren van drie donor-DNA-expressie cassettes en zes flankerende gebieden per stam voor targeting op drie verschillende loci in genomisch DNA (weergegeven in Figuur 2B). Zoals hierin beschreven, werden Promoter, open reading frame, Terminator en twee aaneengesloten 50-BP connectoren sequenties samengevoegd in een Expression cassette via een Golden Gate kloon reactie en werd de assemblage geverifieerd door PCR (Figuur 3a). De enkelvoudige crRNA-array werd besteld als een synthetisch DNA-fragment en werd versterkt door PCR (Figuur 3B). De ontvangende plasmide voor de enkelvoudige crrna array (plasmide pRN1120) werd gelineariseerde met EcoRI-HF en xhoI en linearisatie werd bevestigd door elektroforese (Figuur 3C). Het ontwerp en de nucleotide-sequenties van de geïntroduceerde donor-DNA-expressie cassettes en flankerende gebieden worden weergegeven in aanvullende tabel 3 en aanvullende tabel 4. De opeenvolging van enkelvoudige crRNA array-expressie cassettes is beschikbaar in de aanvullende tabel 1. Functionaliteit van de spacers opgenomen in de single crRNA array werd vooraf getest door singleplex genoom Editing met individuele Crrna's¹⁹.

De efficiëntie van genoom bewerking met behulp van Cas12a werd eerst geëvalueerd op basis van het aantal gekleurde kolonies verkregen na transformatie (tabel 1, Figuur 4). De bewerkings efficiëntie van de drie gebouwde stammen varieerden van 50% tot 94%. Met name de introductie van expressie cassettes die worden gebruikt om stam 1 te genereren, heeft de laagste bewerkings efficiëntie weergegeven, mogelijk veroorzaakt door de aard van het donor-DNA (d.w.z.deze expressie cassettes coderen CRTE, Crtyb en crti van drie hogekrachtpromo tors). Ten tweede werd de correcte integratie van de drie donor-DNA-expressie cassettes op de beoogde loci op het genomische DNA bevestigd door PCR (Figuur 5). Primers werden zo ontworpen dat PCR-producten werden verkregen wanneer de juiste integratie van het donor-DNA op de beoogde locatie plaatsvond. Voor elk transformatie experiment werden acht kolonies uit de transformatie plaat geplukt en getest (merk op dat er slechts drie worden weergegeven in Figuur 5). In het algemeen, van de 8 onderzochte kolonies per donor-DNA, werd de correcte integratie van het CRTE donor-DNA bij de INT1 Locus, CRTYB bij de INT2 Locus en crti op de INT3 Locus bevestigd in > 90% van de transformanten. Deze resultaten demonstreren het CRISPR/Cas12a systeem in combinatie met een enkele crRNA array maakt efficiënte multiplex bewerking van de S. cerevisiae genoom op meerdere loci tegelijk mogelijk.

Daarnaast demonstreren we de creatie van "gist pixel art" met behulp van de drie carotenoïde producerende stammen die samen met een niet-gekleurde wild-type stam werden geconstrueerd. Beginnend met een zwart-wit beeld van Rosalind Franklin (Figuur 6a), werd een afbeelding met 4 kleuren (Figuur 6B) en spotting List gemaakt die vervolgens werd gebruikt om de vier verschillende giststammen op een agar-microplaat te spotten met behulp van een akoestische Liquid handler, resulterend in een hoge resolutie "gist schilderij" van Rosalind Franklin (Figuur 6C, D, E).

Figuur 1 : Workflow van het protocol voor CRISPR/Cas12a multiplex genoom Editing in S. cerevisiae. De werkstroom bevat cruciale stappen van de gepresenteerde methode. Zie het protocol voor meer informatie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 2 : Schema van CRISPR/Cas12a multiplex genoom bewerking met behulp van een enkele crRNA-array. (A) de enkelvoudige crrna-array bestaat uit drie crRNAs-eenheden in hun volwassen vorm, een directe herhaling van 20 BP die specifiek is voor LbCas12a (Grijze vierkantjes) met een 23-BP geleidings sequentie (gekleurde diamanten). Expressie van de crRNA-array wordt ingeschakeld door de SNR52 promoter en SUP4 Terminator. Transformatie van S. cerevisiae met een gelineariseerde pRN1120 en de enkelvoudige crrna array Expression cassette met homologie met pRN1120 (diagonale strepen) maakt een in vivo recombinatie mogelijk in een circulair plasmide in cellen die vooraf LbCas12a. De enkelvoudige crRNA-array wordt vervolgens verwerkt door Cas12a. B) Cas12a is gericht op de beoogde INT1, INT2 en INT3 genomische doellocaties en creëert dubbele gestrande pauzes. In het transformatie mengsel werden donor-DNA bestaande uit flankerende gebieden en de carotenoïde genexpressie cassette opgenomen. Donor-DNA-assemblages werden gericht op één stuk DNA in genomisch DNA rond de INT1 (CRTE), INT2 (crtyb) en INT3 (crti) loci door in vivo recombinatie door de aanwezigheid van 50-BP homologe connectors sequenties, aangeduid als 5, A, B, C, D of E. P1 – P3, verschillende promotors; T1 – T3, verschillende terminators. Dit cijfer is gewijzigd van Verwaal et al. 2018¹⁹. Genetische constructies getoond met behulp van synthetische biologie open Language (SBOL) visuele symbolen⁴⁰. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 3 : PCR controle van de genoom bewerking experimenten. A) verificatie van de gouden poort klonen reacties van geassembleerde donor DNA cassettes. Verkregen resultaten zijn in overeenstemming met de verwachte lengtes. B) PCR van de enkelvoudige crrna-array. C) linearisatie van plasmide pRN1120. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 4 : Platen van S. cerevisiae transformaties met behulp van de multiplex genoom Editing aanpak. A) stam 1 die CRTE, crtyb en crti uitdrukt van drie sterke promotors (donker oranje kolonies). B) stam 2 waarin CRTE, Crtyb en crti uit drie middelgrote sterkte bevorderaar (oranje kolonies) worden uitgesproken. C) stam 3 uitdrukken van CRTE, Crtyb en crti van drie lage-sterkte bevorderaar (gele kolonies). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 5 : PCR verifieert de integratie van de donor-DNA-expressie cassettes op de beoogde loci binnen het genomische DNA. A) verificatie van drie kolonies van de stam 1. B) verificatie van drie kolonies van de stam 2. C) verificatie van drie kolonies van de stam 3. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figuur 6 : Gist pixel art van Rosalind Franklin. (A) zwart-wit RGB-foto van 220 × 280 pixels van Rosalind Franklin die als sjabloon werd gebruikt. (B) computer conversie van de zwart-witfoto van Rosalind Franklin in een 4-kleurige 64 × 96 pixel lijst. C) foto van gist pixelart met 64 × 96 gist kolonies met een ingezoomd gedeelte. D) foto van een akoestische vloeistof behandelaar met twee volgroeide platen. E) foto van een volgroeide microplaat met 64 × 96 gist kolonies. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

	Stam 1	Stam 2	Stam 3
Gekleurde kolonies	16	279	220
Witte kolonies	16	18	18
Totaal kolonies	32	297	238
Efficiëntie	50%	94%	92%

Tabel 1: Bewerk de efficiëntie van de multiplex genoom Editing aanpak.

crRNA array sequentiea, b, c, d, e, f

Catgtttgacagcttatcatcgataatccggagctagcatgcggccgctctagaactagtggatcccccgggctgcag Tctttgaaaa GATAATGTATGATTATGCTTTCACTCATATTTATACAGAAACTTGATGTTTTCTTTCGAGTATATACAAGG TGATTACATGTACGTTTGAAGTACAACTCTAGATTTTGTAGTGCCCTCTTGGGCTAGCGGTAAAGGTGCGCA TTTTTTCACACCCTACAATGTTCTGTTCAAAAGATTTTGGTCAAACGCTGTAGAAGTGAAAGTTGGTGCGC ATGTTTCGGCGTTCGAAACTTCTCCGCAGTGAAAGATAAATGATCAatttctactaagtgtagat CTGGTGGGAGAAAGCTTATGAAatttctactaagtgtagatgtgccgtac GCCGGAGCCGACGGAatttctactaagtgtagattgcccctcttatacgattatattTT TTTTTGTTTTTTATGTCTggggggcccggtacccagcttttgttccctttagtgagg GTTAATTCCGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG

a. homologie aan pRN1120 (Bold). b. SNR52 promotor (cursief). c. genomische streef reeksen (onderstreept). d. Guide direct herhalingen specifiek voor LbCas12a (cursief, vet). e. SUP4 Terminator (cursief). f. homologie aan pRN1120 (Bold).

Aanvullende tabel 1: enkelvoudige crRNA-array voor LbCas12a die homologie met plasmide pRN1120 bevat.

Naam	Volgordea	Omschrijvingb	Gebruikt in punt
KC-101	GEAAND, Nederland	FW primer voor versterking van enkele crRNA array	2.1.4
KC-102	CACACAGGAAACAGCTATGAC	RV primer voor versterking van enkele crRNA array	2.1.4
KC-103	AAGCGACTTCCAATCGCTTTGC	FW primer voor versterking van donor DNA met connector 5	3.6.1
KC-104	Een van de meest GEAAGDE	RV primer voor versterking van donor DNA met connector A	3.6.1
KC-105	EEN van de meest GEGE-	FW primer voor versterking van donor DNA met connector B	3.6.1
KC-106	CAACAGGAGGCGGATGGATATAC	RV primer voor versterking van donor DNA met connector C	3.6.1
KC-107	AACGTTGTCCAGGTTTGTATCC	FW primer voor versterking van donor DNA met connector D	3.6.1
KC-108	Een van de meest GEAAGDE	RV primer voor versterking van donor DNA met connector E	3.6.1
KC-109	Een van de meest GESMOKKELDE bloemen	FW primer voor versterking van INT1 5 ' met connector 5	4,4
KC-110	Een van de meest GEKKEN TGGATATGCAAAGCGATTGGAA GTCGCTTgactcctctgccgtc ATTCC	RV primer voor versterking van INT1 5 ' met connector 5	4,4
KC-111	GEAGLDE, Een van de meest GEKKEN. TGCTTTaagcgttgaagtttcctc TTTG	FW primer voor versterking van INT1 3 ' met connector A	4,4
KC-112	TGTCAACTGGAGAGCTATCG	RV primer voor versterking van INT1 3 ' met connector A	4,4
KC-113	AGAAGATTTCTCTTCAATCTC	FW primer voor versterking van INT2 5 ' met connector B	4,4
KC-114	TGCTAAGATTTGTGTTCGTT TGGGTGCAGTCGGTTGTGTACAT CGATCCGcccttatcaaggatacc TGGTTG	RV primer voor versterking van INT2 5 ' met connector B	4,4
KC-115	Een van de meest GEKKEN Een van de meest GECATONE CCTGTTGGGCGATTACACAAGCG GTGG	FW primer voor versterking van INT2 3 ' met connector C	4,4
KC-116	TCTCCTCTTCGATGACCGGG	RV primer voor versterking van INT2 3 ' met connector C	4,4
KC-117	Een van de meest GEAGLDE	FW primer voor versterking van INT3 5 ' met connector D	4,4
KC-118	Een van de meest GESMOKKELDE schoenen EEN van de meest gebruikte GACAACGTTttccaaggaggtg AAGAACG	RV primer voor versterking van INT3 5 ' met connector D	4,4
KC-119	Een van de meest gebruikte CCCATATGCTCGGTCGTGCTTGTT GTACCTgatgggacgtcagcact GTAC	FW primer voor versterking van INT3 3 ' met connector E	4,4
KC-120	Een van de meest toegepaste	RV primer voor versterking van INT3 3 ' met connector E	4,4
KC-121	EEN van de meest GEKKEN.	FW primer voor de verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 5 '	7.4.1
KC-122	Een van de meest GEKKEN	FW primer voor de verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 3 '	7.4.1
KC-123	Een van de meest GEKKEN	FW primer voor de verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC tot INT2 5 '	7.4.1
KC-124	GTCTCCAGCTGAATTGGTCC	FW primer voor de verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC tot INT2 3 '	7.4.1
KC-125	CTCTCATGAAGCAGTCAAGTC	FW primer voor de verificatie van de integratie van conD-crtI-conE naar INT3 5 '	7.4.1
KC-126	Een van de meest GEAGLTE schoenen	FW primer voor de verificatie van de integratie van conD-crtI-conE naar INT3 3 '	7.4.1
KC-127	Een van de meest creatieve	RV primer voor verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 5 '	7.4.1
KC-128	GCTGTCATGATCTGTGATAAC	RV primer voor verificatie van de integratie van con5-crtE-conA naar INT1 3 '	7.4.1
KC-129	CTGGCAATGTTGACCAATTGC	RV primer voor verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC tot INT2 5 '	7.4.1
KC-130	Een van de meest GEKKEN	RV primer voor verificatie van de integratie van conB-crtYB-conC naar INT2 3 '	7.4.1
KC-131	CCTTACCTTCTGGAGCAGCAG	RV primer voor verificatie van de integratie van conD-crtI-conE tot INT3 5 '	7.4.1
KC-132	CTGGTTACTTCCCTAAGACTG	RV primer voor verificatie van de integratie van conD-crtI-conE tot INT3 3 '	7.4.1
	a. vette reeksen duiden op verbindingsreeksen. b. voorwaartse en omgekeerde primers worden aangeduid als FW en RV, respectievelijk.

Aanvullende tabel 2: primer sequenties.

Aanvullende tabel 3: ontwerp van geconstrueerde stammen.

Aanvullende tabel 4: sequenties van donor-DNA-expressie cassettes en Schilde gebieden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het verstrekte protocol beschrijft multiplex genoom editing van S. cerevisiae met behulp van Cas12a van Lachnospiraceae bacterie ND2006 in combinatie met een enkele crrna array en donor DNA. Het ontwerp van de enkelvoudige crRNA-array en het donor-DNA wordt gedetailleerd toegelicht. In tegenstelling tot het welbekende crispr/Cas9 systeem, heeft de crispr/Cas12a de unieke extra mogelijkheid om meerdere crrna's te verwerken, uitgedrukt in één crrna array^13,33. Vanwege deze functie is het gelijktijdig bewerken van meerdere doelen eenvoudiger om in te stellen en kan het worden bereikt in één transformatie. Deze enkele crRNA array aanpak werd eerder gedemonstreerd door Zetsche et al. ³⁴ die gelijktijdig tot vier genen in zoogdiercellen hebben bewerkt met behulp van AsCas12a, en door Swiat et al. ³⁵ die vier DNA-fragmenten introduceerde in een gist-genoom met behulp van FnCas12a. Voor onze kennis is een hoger aantal gelijktijdige genomische modificaties met behulp van een Cas12a-systeem niet gerapporteerd en moet de maximale limiet van de doelen per enkele array voor Cas12a nog worden bepaald. Verder onderzoek met behulp van enkelvoudige crrna-arrays in combinatie met Cas12a omvat multiplex transcriptionele regulering in een breed scala van organismen^33,36,37.

Er zijn enkele kritieke stappen in het gepresenteerde protocol. Ontwerp zorgvuldig alle DNA-sequenties die betrokken zijn bij het Cas12a genoom Editing experiment, vooral in het geval dat nieuwe DNA-sequenties worden geïntroduceerd. Bepaal de functionaliteit van nieuwe spacer sequenties deel van een crRNA, bijvoorbeeld door een singleplex genoom Editing experiment zoals beschreven door Verwaal et al. ¹⁹ alvorens ze te combineren tot één crrna array. Volg de aanbevelingen voor het voorbereiden van transformatie bufferoplossingen die worden gebruikt in het Cas12a Editing experiment om een goede transformatie efficiëntie van gist te bereiken.

Er zijn enkele optionele modificaties van de techniek. Het wordt aanbevolen om 1 μg van elk donor-DNA, gelineariseerde pRN1120 of enkele crrna array Expression cassette in de transformatie te gebruiken, hoewel het gebruik van een lager DNA-bedrag ook naar verwachting resulteert in een bevredigende transformatie efficiëntie. Voer een test transformatie uit om te bepalen of lagere DNA-bedragen kunnen worden gebruikt. De transformatie van S. cerevisiae kan worden uitgevoerd met een andere methode dan beschreven in dit protocol, bijvoorbeeld het protocol dat is beschreven door Gietz et al. (2007) ³⁸. de gids RNA-ontvanger plasmide pRN1120 is geschikt voor de expressie van een enkele crrna-en enkele crrna-array van verschillende Cas12a-varianten (bijv.van acidaminococcus spp. BV3L6 of Francisella novicida U112) en voor de uitdrukking van sgRNA in combinatie met Cas9¹⁹. Het donor DNA hoeft niet te worden beperkt tot carotenoïde genexpressie cassettes en flankerende gebieden die het donor DNA targeten op de beschreven INT1, INT2 en INT3 locaties in genomisch DNA. Elk DNA van belang kan op multiplex wijze in genomisch DNA van de gastheer worden geïntroduceerd door de in dit protocol beschreven ontwerpprincipes, of als alternatief kan donor DNA worden gebruikt om DNA van een gastheer genoom te verwijderen. De modulaire structuur van enkele crRNA-array vergemakkelijkt eenvoudige aanpassing van de Spacer en directe herhalings sequenties. Wijziging van de afstandsequenties maakt een verandering van de beoogde integratie Locus mogelijk, die kan worden ontworpen door een van de instrumenten voor de identificatie van een genomische doellocatie, bijvoorbeeld Guide scan software 1,0³⁹. In plaats van grote flankerende sequenties te gebruiken die verbindingslijnen bevatten, kan 50-BP van de flankerende regio in de DNA-sequenties van de donor worden opgenomen door de sequenties van deze 50-BP flankerende regio te integreren in de primers die in de PCR worden gebruikt. In dit geval, in totaal slechts drie in plaats van negen donor DNA-fragmenten zijn vereist voor een succesvolle multiplex genoom Editing experiment.

Samengevat, dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van multiplex genoom Editing in S. cerevisiae met behulp van Cas12a in combinatie met een enkele crrna array-benadering. Het protocol werd gedemonstreerd door multiplex genoom Editing met behulp van 9 donor DNA fragmenten en enkele crRNA array Coding voor drie Grna's. We tonen hoge algemene bewerkings frequenties tussen 50% en 94% voor de drie strain designs die hier worden gerapporteerd. Tot slot, het unieke kenmerk van Cas12a is de mogelijkheid om een enkele crRNA-array in individuele Crrna's in een cel te verwerken, wat Cas12a een uitstekend hulpmiddel maakt om multiplex genoom te bewerken en transcriptionele regulatie modules te ontwikkelen die gericht zijn op meerdere expressie cassettes in één gaan. Uiteindelijk, drie stammen werden verkregen produceren carotenoïden op een ander niveau en kleuren in tinten tussen geel en oranje. Met die stammen en een wild-type stam, lieten we zien hoe een akoestische vloeistof behandelaar op een rechte manier kan worden gebruikt om gist pixel kunst te maken-dit ter ere van Rosalind Franklin die heeft bijgedragen aan de ontdekking van de DNA-structuur 65 jaar geleden door haar beroemde foto 51^{23 < /C1 >.}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals specific for the protocol
1 Kb Plus DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	10787018	Electrophoresis
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A9518	Selection of E. coli transformants
BsaI-HF (20 U/µl)	New England BioLabs	R353L	Golden Gate Cloning
Cell Lysis Solution (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
CutSmart Buffer	New England BioLabs	B7204S	Linearization of pRN1120
Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes	Sigma Aldrich	D1626	Transfromation of S. cerevisiae (carrier DNA)
dNTPs	Invitrogen	10297018	PCRs
EcoRI-HF	New England BioLabs	R3101S	Linearization of pRN1120
Ethanol absolute for analysis	Merck	100983	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Ethylenediamine-tetraacetic acid	Sigma Aldrich	ED	Transformation of S. cerevisiae
G418 disulfate salt	Sigma Aldrich	A1720	Selection of S. cerevisiae transformants
Histodenz	Sigma Aldrich	D2158	Yeast pixel art
Isopropanol	Merck	100993	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Lithium acetate dihydrate	Sigma Aldrich	L6883	Transformation of S. cerevisiae
Nancy-520 DNA Gel Stain	Sigma Aldrich	1494	Electrophoresis
NEB10 competent E. coli cells	New England BioLabs	C3019H	Transformation of E. coli: dx.doi.org/10.17504/protocols.io.nkvdcw6
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB102	Selection of S. cerevisiae transformants
Phusion buffer	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England BioLabs	M0530L	PCRs
Polyethylene glycol 4000	Merck	7490	Transformation of S. cerevisiae
Protein Precipitation Solution (10 M NH4AC) (from kit Puregene Yeast/Bact. Kit B)	QIAGEN	854016	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
Purple loading dye	New England BioLabs	B7024S	Electrophoresis
QIAprep Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106	Purification of plasmids
RNase coctail enzyme mix	Thermo Fisher Scientific	AM2286	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae
T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	Golden Gate Cloning
T4 DNA Ligase (1 U/µl)	Invitrogen	1705218	Golden Gate Cloning
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500500	Electrophoresis
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kit	Promega	A9282	Purification of PCR products and linearized pRN1120
Xhol	New England BioLabs	R0146S	Linearization of pRN1120
Zymolyase 50 mg/ml (5 units/µL)	Zymo Research	E1006	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (yeast lysis enzyme)
Zymolyase storage buffer	Zymo Research	E1004-B	Isolation of genomic DNA from S. cerevisiae (necessary for the preparation of yeast lysis enzyme)
Chemicals of general use
2*Peptone-Yeast extract (PY) agar			Plate growth of E. coli
2*PY medium			Cultivation of E. coli
Demineralized water			Transformation of S. cerevisiae
ELFO buffer			Electrophoresis
MQ			Multiple steps
Physiological salt solution			Transformation of S. cerevisiae
TE buffer			Storage of DNA, transformation of S. cerevisiae
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium			Cultivation of S. cerevisiae
YEPD (2% glucose) agar			Plate growth of S. cerevisiae
Consumables
Eppendorf tubes
Falcon tubes (50 mL)
Microplate 96 wells
Petri dishes
Pipette tips 0.5 - 10 µL
Pipette tips 10 - 200 µL
Pipette tips 100 - 1000 µL
Shake flasks (500 mL)
Sterile filters
Equipment
Centrifuge (Falcon tubes)
Echo 525 acoustic liquid handler
Incubator
NanoDrop
Set for eletrophoresis
Spectrophotometer
Table centrifuge (Eppendorfs tubes)
Thermocycler
Plasmids
pCSN067	Addgene	ID 101748	https://www.addgene.org/
pRN1120	Addgene	ID 101750	https://www.addgene.org/
Strains
S. cerevisiae strain CEN.PK113-7D	EUROSCARF collection		http://www.euroscarf.de